專利名稱：一種預防電磁輻射致腦損傷的標志物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于腦損傷防治技術領域，具體涉及一種預防電磁輻射致腦損傷的標志物-NMDA受體SNP。
背景技術：
隨著電子電氣設備的廣泛應用，人們對電磁的生物效應問題愈發(fā)重視，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是電磁輻射敏感的靶器官之一，流行病學調查顯示，電磁輻射可引起疲勞、頭痛、激動、 多夢、記憶力下降等癥狀。因此，尋找電磁輻射損傷敏感的預測和監(jiān)測指標對于電磁輻射接觸人群的預防診治極其重要。電磁輻射參數(shù)以及影響的環(huán)境復雜多樣，電磁暴露人群個體敏感性各有差異，電磁輻射人群腦結構和功能異常的發(fā)生風險及其與機體的遺傳因素之間的關系需要關注。本發(fā)明擬著眼于電磁輻射對腦結構和功能的損傷，通過基因多態(tài)性研究來尋找預測電磁輻射致腦損傷的重要指標。NMDA受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性氨基酸受體之一，電磁輻射可引起其重要受體NR1、NR2B活性、數(shù)量及其基因和蛋白表達的改變，進而影響學習記憶等腦的重要功能。因此，研究NRl及NR2B基因是否存在多態(tài)性，及其與輻射致腦組織結構和功能改變是否存在相關性，對于尋找與電磁輻射致腦損傷發(fā)生密切相關的敏感預測和監(jiān)測指標，具有極其重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種預防電磁輻射致腦損傷的標志物-NMDA受體SNP。本發(fā)明的目的還在于提供一種預防電磁輻射致腦損傷的方法。一種預防電磁輻射致腦損傷的標志物，該標志物為N-甲基-D-天門冬氨酸受體單核苷酸多態(tài)性。所述N-甲基-D-天門冬氨酸受體的基因為NR2B基因。所述N-甲基-D-天門冬氨酸受體單核苷酸多態(tài)性為NR2B基因啟動子區(qū)_217位 c/τ單核苷酸多態(tài)。一種預防電磁輻射致腦損傷的方法，按照如下步驟進行(I)抽取大鼠尾靜脈血100-500 μ 1，提取基因組DNA ；(2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以如序列表所述的核苷酸序列SEQ ID NO :1(5’-CTGCCTTCCTCCTTGCTTCCCACTTC-3’)和 SEQ ID NO :2(5’-CTCTTCTCGCTTGCATATCC ACATAA-3’ )為引物，做 PCR ；(3)將步驟⑵得到的PCR產(chǎn)物進行測序，測序結果與標準NR2B基因比對，若其啟動子區(qū)-217位基因型為CC型，則為抗電磁輻射致腦損傷大鼠；若其啟動子區(qū)-217位基因型為CT型或TT型，則為電磁輻射致腦損傷敏感型大鼠。所述CC型是指在同源染色體上NR2B基因啟動子區(qū)_217位點均為C，即野生純合型；CT型是指在同源染色體上NR2B基因啟動子區(qū)-217位點一個為C，另一個為T，即突變雜合型；TT型是指在同源染色體上NR2B基因啟動子區(qū)-217位點均為Τ，即突變純合型。所述標準NR2B基因為genebank上公布的NR2B基因序列，其genebank登錄號為-NC_005103-。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的N-甲基-D-天門冬氨酸受體單核苷酸多態(tài)性， 能準確預測不同基因型大鼠電磁輻射致腦損傷的可能性，為N-甲基-D-天門冬氨酸受體基因及其相關基因的單核苷酸多態(tài)性應用于人類電磁輻射致腦損傷的防治奠定了基礎。


圖I為大鼠NR2B基因核心啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性位點。圖2為大鼠NR2B基因SNP位點酶切分型圖。圖3為Wistar大鼠(編號1-16)NR2B基因-217C/T分型結果。圖4為Wistar大鼠(編號17-32)NR2B基因-217C/T分型結果。圖5為SD大鼠(編號33-48)NR2B基因-217C/T分型結果。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1NR2B基因單核苷酸多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)I、實驗動物二級雄性大鼠96只，體重160_200g，其中Wistar大鼠38只(編號1_8購自北京動物所，編號9-16、73-78購自維通利華，編號17-24取自軍事醫(yī)學科學院動物中心，編號 25-32購自維通利華為非同窩大鼠)，SD大鼠22只(編號33-40取自軍事醫(yī)學科學院動物中心，編號41-48、74-80購自維通利華)，f_344大鼠22只(編號49-56取自軍事醫(yī)學科學院動物中心，編號57-64、85-90購自維通利華)，Wistar Han IGS大鼠14只(65-72,91-96 購自維通利華)。2、大鼠尾靜脈血基因組DNA的提取
(I)用苦味酸在大鼠背部標記好記號后，將其固定于頭部固定器上，用酒精棉球反復擦拭尾部至可見藍色靜脈，于尾部Icm處切口，血滴入EDTA抗凝管后快速晃動，防止凝血，每只大鼠米集尾靜脈血500 μ I ο
(2)在1.5ml EP管中先加入30μ I蛋白酶K，再加入大鼠尾靜脈血200μ 1，最后加A 250 μI細胞裂解液；
(3)將振蕩器速度調到最大，將EP管放上震蕩15s ；
(4) 5OOOrpm快速離心；
(5)56°C 孵育 2min ；
(6)加入250 μ I無水乙醇；
(7)放在振蕩器上震蕩15s ；
(8) 5000rpm快速離心；
(9)將裂解液轉入QG-810的套管并固定；
(10)整個裝置放回QG-810的相應位置，關閉前蓋；
(11)按MODE鍵選擇抽提模式，按START自動運行；
(12)聽到2聲鳴叫，抽提結束；(13)去1μ I制備的大鼠全血基因組DNA采用紫外分光光度法測定其紫外吸收峰， 并計算DNA濃度和純度。3、大鼠N-甲基-D-天門冬氨酸受體單核苷酸多態(tài)性的發(fā)據(jù)(I)大鼠NR1、NR2B基因候選區(qū)域序列克隆引物設計及合成根據(jù)Genebank上提供的NRl (Genebank登錄號為NC_005102)、 NR2B (Genebank登錄號為NC_005103)序列，設計PCR引物(見表I)。表I PCR引物序列及擴增片段長度
權利要求
1.一種預防電磁輻射致腦損傷的標志物，其特征在于，該標志物為N-甲基-D-天門冬氨酸受體單核苷酸多態(tài)性。
2.根據(jù)權利要求I所述一種預防電磁輻射致腦損傷的標志物，其特征在于，所述N-甲基-D-天門冬氨酸受體的基因為NR2B基因。
3.根據(jù)權利要求I所述一種預防電磁輻射致腦損傷的標志物，其特征在于，所述N-甲基-D-天門冬氨酸受體單核苷酸多態(tài)性為NR2B基因啟動子區(qū)-217位C/T單核苷酸多態(tài)。
4.一種預防電磁輻射致腦損傷的方法，其特征在于，按照如下步驟進行(1)抽取靜脈血100-500μ 1，提取基因組DNA ；(2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以如序列表所述的核苷酸序列SEQID NO I和SEQ ID NO :2為引物，做PCR ;(3)將步驟(2)得到的PCR產(chǎn)物進行測序，測序結果與標準NR2B基因比對，若其啟動子區(qū)-217位基因型為CC型，則為抗電磁輻射致腦損傷大鼠；若其啟動子區(qū)-217位基因型為 CT型或TT型，則為電磁輻射致腦損傷敏感型大鼠。
5.根據(jù)權利要求4所述一種預防電磁輻射致腦損傷的方法，其特征在于，所述CC型是指在同源染色體上NR2B基因啟動子區(qū)-217位點均為C，即野生純合型；CT型是指在同源染色體上NR2B基因啟動子區(qū)-217位點一個為C，另一個為Τ，即突變雜合型；ΤΤ型是指在同源染色體上NR2B基因啟動子區(qū)-217位點均為Τ，即突變純合型。
6.根據(jù)權利要求4所述一種預防電磁輻射致腦損傷的方法，其特征在于，所述標準 NR2B基因為genebank上公布的NR2B基因序列，其genebank登錄號為NC_005103。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于腦損傷防治技術領域的一種預防電磁輻射致腦損傷的標志物-NMDA受體SNP。該標志物NR2B基因啟動子區(qū)-217位C/T單核苷酸多態(tài)，能準確預測不同基因型大鼠電磁輻射致腦損傷的可能性，為N-甲基-D-天門冬氨酸受體基因及其相關基因的單核苷酸多態(tài)性應用于人類電磁輻射致腦損傷的防治奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102586243SQ20121005874
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月8日 優(yōu)先權日2012年3月8日
發(fā)明者喬思默, 王麗峰, 王長振, 田大為, 胡向軍, 鄒勇 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所