專利名稱：一種對牛前體脂肪細胞進行體外培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對牛前體脂肪細胞進行體外培養(yǎng)的方法，屬于細胞工程和組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
從脂肪組織中分離培養(yǎng)的細胞多稱為“前體脂肪細胞”。前體脂肪細胞是一類具有增殖分化能力的脂肪細胞前體，在體內(nèi)多種因素的影響下聚脂分化而成為成熟脂肪細胞。 目前報道培養(yǎng)成功的前體脂肪細胞主要來源于人、鼠、豬等。Aso等在1995年于牛肌細胞間 SV(stromal vascular)細胞培養(yǎng)物中分離克隆出前體脂肪細胞系。近年來，國內(nèi)一些實驗室也陸續(xù)對牛脂肪細胞展開了研究。目前所用的培養(yǎng)方法主要有組織塊培養(yǎng)法和傳統(tǒng)消化培養(yǎng)法。采用組織塊培養(yǎng)法時，需先將脂肪組織用眼科剪刀剪至每塊約Imm3大小，然后用玻璃細管接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，3-4天后有少量細胞游離出來貼壁生長，約10-12天后有80-90% 細胞貼壁，因此，此培養(yǎng)方法所需時間較長、人力較多。而采用傳統(tǒng)消化培養(yǎng)法時，也需先將脂肪組織用眼科剪刀剪至每塊約Imm3大小，然后加入膠原酶I在37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化30分鐘，之后離心洗滌，最后接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)。培養(yǎng)1天后有少量細胞開始貼壁生長，7-8天后約有80-90%細胞貼壁，因此，該方法較組織塊培養(yǎng)法省時間，但在剪碎組織時同樣很費人力。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述兩種培養(yǎng)方法存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明旨在提供一種簡單高效、節(jié)省時間和人力、可重復(fù)性強的牛前體脂肪細胞體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明基于傳統(tǒng)消化培養(yǎng)方法，利用組織勻漿機結(jié)合膠原酶I培養(yǎng)基處理脂肪組織，采用含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對牛前體脂肪細胞進行體外培養(yǎng)，成功建立了牛前體脂肪細胞體外培養(yǎng)的新模型，極大的縮短了試驗樣品處理的時間，且獲得細胞形態(tài)最好，培養(yǎng)及提取RNA效率最高，是一種更為便捷、長期高效的前體脂肪細胞培養(yǎng)方法。通過體外培養(yǎng)牛前體脂肪細胞，可深入了解脂肪細胞的增殖分化規(guī)律，為后續(xù)深入研究前體脂肪細胞增殖分化過程中基因、蛋白的表達及信號通路奠定基礎(chǔ)。且為調(diào)控肉牛體脂沉積、預(yù)防奶牛圍產(chǎn)期和泌乳高峰期疾病(酮病、 脂肪肝)等提供新思路和新方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種對牛前體脂肪細胞進行體外培養(yǎng)的方法，其特征是， 利用牛皮下脂肪細胞在體外通過改良消化法進行培養(yǎng)，繼而獲得牛前體脂肪細胞；具體如下(1)試劑0. 膠原酶I培養(yǎng)基將IOOmg膠原酶I溶解于100毫升D-Hanks液中，用5. 6% NaHCO3溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 2 7. 4，經(jīng)0. 22微米過濾器過濾、分裝，_20°C保存?zhèn)溆?。細胞培養(yǎng)液在DMEM/F12液中添加其體積10%的胎牛血清，經(jīng)0. 22微米過濾器過濾、分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?2)牛前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)
a無菌條件下取牛皮下脂肪組織，將其移入預(yù)先盛有D-Hanks液的平皿，漂洗5 8次，用眼科剪去除脂肪組織中可見的血管和結(jié)締組織；b然后剪切組織塊至8 IOmm3小塊，用組織勻漿機180 200r/min勻漿至乳糜狀；繼而加入0. 膠原酶I培養(yǎng)基消化30min，其間每5min振蕩1次；C經(jīng)200目不銹鋼細胞篩過濾去除未消化組織塊及大體積的脂肪細胞，將細胞懸液移入離心管，2000r/min離心5min ；棄去離心后的上清液，加入細胞培養(yǎng)液清洗1次， 2000r/min離心lOmin，制成細胞懸液，顯微鏡下計數(shù)，以5X 104cells/mL接種細胞至培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，置入37 °C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明工藝先進簡單、培養(yǎng)基配制科學(xué)合理。采用0. 膠原酶I和含胎牛血清的DMEM/F12液對牛皮下脂肪細胞在體外通過改良消化法進行培養(yǎng)，繼而獲得牛前體脂肪細胞。本發(fā)明通過體外改良消化法培養(yǎng)牛前體脂肪細胞，成功建立了牛前體脂肪細胞體外培養(yǎng)的新模型，極大的縮短了試驗樣品處理的時間，且獲得細胞形態(tài)最好，培養(yǎng)及提取 RNA效率最高，是一種更為便捷、長期高效的前體脂肪細胞培養(yǎng)方法。為后續(xù)深入研究前體脂肪細胞增殖分化過程中基因、蛋白的表達及信號通路奠定基礎(chǔ)，為調(diào)控肉牛體脂沉積、預(yù)防奶牛圍產(chǎn)期和泌乳高峰期疾病(酮病、脂肪肝)等提供新思路和新方法。


圖1為三種方法培養(yǎng)的前體脂肪細胞圖片；圖1中A、B.組織塊法培養(yǎng)的前體脂肪細胞，C、D.傳統(tǒng)消化法培養(yǎng)的前體脂肪細胞，Ε、F.改良消化法培養(yǎng)的前體脂肪細胞；Α.前體脂肪細胞培養(yǎng)4d，C、E.前體脂肪細胞培養(yǎng)2d，B、D、F.前體脂肪細胞培養(yǎng)8d。圖2為MTT法檢測傳統(tǒng)消化法和改良消化法對牛前體脂肪細胞增殖的影響(n = 3)圖片；圖3為油紅O染色后的脂肪滴(Χ200)圖片；圖3中a.組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的脂肪細胞，b.傳統(tǒng)消化法培養(yǎng)的脂肪細胞，c.改良消化法培養(yǎng)的脂肪細胞。圖4為脂肪細胞中總RNA的瓊脂糖電泳圖片；圖4中1、2.改良消化法，3、4.組織接種法，5、6.傳統(tǒng)消化法。圖5為牛IGF-I基因的RT-PCR結(jié)果圖片。圖5中1、2.改良消化法，3、4.組織接種法，5、6.傳統(tǒng)消化法。
具體實施例方式實施例1(1)試劑0. 1 %膠原酶I培養(yǎng)基將IOOmg膠原酶I溶解于100毫升D-Hanks液(型號 91105B-100，上海寶曼生物科技有限公司生產(chǎn))中，用5.6%妝!10)3溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 2 7. 4，經(jīng)0. 22微米過濾器過濾、分裝，_20°C保存?zhèn)溆?。細胞培養(yǎng)液在DMEM/F12液(型號D6421，Sigma公司生產(chǎn))中添加其體積10% 的胎牛血清，經(jīng)0. 22微米過濾器過濾、分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?2)牛前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)
a無菌條件下取牛皮下脂肪組織，將其移入預(yù)先盛有D-Hanks液的平皿，漂洗6次，用眼科剪去除脂肪組織中可見的血管和結(jié)締組織；b然后剪切組織塊至9mm3小塊，用組織勻漿機180 200r/min勻漿至乳糜狀；繼而加入0. 膠原酶I培養(yǎng)基消化30min，其間每5min振蕩1次；c經(jīng)200目不銹鋼細胞篩過濾去除未消化組織塊及大體積的脂肪細胞，將細胞懸液移入離心管，2000r/min離心5min ；棄去離心后的上清液，加入細胞培養(yǎng)液清洗1次，2000r/min離心lOmin，制成細胞懸液，顯微鏡下計數(shù)，以5X 104cells/mL接種細胞至培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，置入37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其培養(yǎng)效果如下1.牛前體脂肪細胞形態(tài)學(xué)觀察圖1中組織接種后，第4d觀察到少量梭形細胞游離出脂肪組織邊緣(圖1，A)，第7d時前體脂肪細胞開始大量增殖，呈梭形，至8d(匯合占底面積70%以上(圖1，B)。改良消化法與傳統(tǒng)消化法獲得的細胞剛接種時胞質(zhì)回縮成小圓球形，為懸浮狀態(tài)，接種24h后可見部分細胞開始貼壁，呈不規(guī)則的三角形。培養(yǎng)4 后貼壁細胞開始伸展變形，大多數(shù)呈狹長梭形的成纖維樣細胞形態(tài)(圖1，C、E)。第8d細胞匯合達到80%以上(圖1，D、F)。2. MTT法檢測牛前體脂肪細胞的增殖活性。以IOVcm2密度將傳統(tǒng)消化法和改良消化法所得前體脂肪細胞接種于96孔培養(yǎng)板，在培養(yǎng)的2、4、6、8、IOd加入MTT，490nm波長酶聯(lián)檢測儀測定各孔吸光度值。圖2中利用MTT法繪制的牛前體脂肪細胞生長曲線類似S型，符合體外培養(yǎng)細胞的正常生長增殖規(guī)律，即先進入緩慢的潛伏生長期(約40h)，隨后到指數(shù)生長期(4-10d)。改良消化法前體脂肪細胞的后期增殖活性高于傳統(tǒng)消化法。3.油紅O染色法檢測牛前體脂肪細胞分化圖3中在前體脂肪細胞生長至匯合狀態(tài)后更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(在DMEM/F12液中添加0. 5% BSA、10 μ g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、17 μ M生物素、100 μ M泛酸鈣鹽、10 μ g/mL牛胰島素、0. 5mM ΙΒΜΧ,Ο. 25 μ M DEX，混勻后用IM NaOH調(diào)節(jié)PH值至7. 2_7. 4，經(jīng)0. 22微米濾器過濾、分裝，4°C保存?zhèn)溆?中進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。誘導(dǎo)第2d細胞胞質(zhì)內(nèi)開始有小脂滴出現(xiàn)，至第6d時，胞質(zhì)內(nèi)小脂滴明顯增多，并且有少數(shù)開始融合成大脂滴。誘導(dǎo)分化后的脂肪細胞培養(yǎng)12d結(jié)束，按油紅O染色法鑒定脂肪細胞傾去培養(yǎng)液，PBS洗細胞2次，10%甲醛固定lh, PBS洗2次，油紅O染色20min，PBS洗2次，稍干后以甘油明膠封固觀察拍照。圖3顯示，三種培養(yǎng)方法的細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果基本一致，而改良消化法培養(yǎng)得到的脂肪滴最多。4.脂肪細胞RNA質(zhì)量檢測培養(yǎng)的脂肪細胞，傾去培養(yǎng)液，加入Trizol吹打并收集細胞，提取RNA，RT-PCR擴增IGF-I基因檢測RNA質(zhì)量。引物設(shè)計根據(jù)Ge et al (2001)，由博尚生物技術(shù)有限公司(上海)合成。上游引物 forward-ATT ACA AAG CTGCCT GCC CC(SEQ-I)；下游引物:Reverse-ACC TTA CCC GTA TGA AAG GAATAT ACG T (SEQ-2)；產(chǎn)物長度 249bp ；反應(yīng)條件為940C 4min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 31 個循環(huán)，72°C 10min，4°C 30min。從細胞中提取用于IGF-I基因RT-PCR分析的總RNA檢測結(jié)果見圖4。從圖4中可見，總RNA在凝膠上顯示出兩條清晰的和一條較淺的條帶，分別為^S、18S和5S rRNA。28S和18S rRNA條帶亮度的比值均大于1. 5倍，表明總RNA無降解?？俁NA的0D260值與0D280值的比值均在1. 8 2. O之間，表明無蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)污染。因此，提取的RNA質(zhì)量完好。由圖5IGF-1基因的RT-PCR電泳可見，三種方法均能擴增出目的基因，且改良消化法擴增效果要好于另兩種方法。
權(quán)利要求
1. 一種對牛前體脂肪細胞進行體外培養(yǎng)的方法，其特征是，a無菌條件下取牛皮下脂肪組織，將其移入預(yù)先盛有D-Hanks液的平皿，漂洗5 8次，用眼科剪去除脂肪組織中可見的血管和結(jié)締組織；b然后剪切組織塊至8 IOmm3小塊，用組織勻漿機180 200r/min勻漿至乳糜狀；繼而加入0. 膠原酶I培養(yǎng)基消化30min，其間每5min振蕩1次；c經(jīng)200目不銹鋼細胞篩過濾去除未消化組織塊及大體積的脂肪細胞，將細胞懸液移入離心管，2000r/min離心5min ；棄去離心后的上清液，加入細胞培養(yǎng)液清洗1次，2000r/min離心lOmin，制成細胞懸液，顯微鏡下計數(shù)，以5X 104cells/mL接種細胞至培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，置入37 °C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；其中，步驟b中0. 膠原酶I培養(yǎng)基為將IOOmg膠原酶I溶解于100毫升D-Hanks液中，用5. 6% NaHCO3溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 2 7. 4，經(jīng)0. 22微米過濾器過濾、分裝，-20 °C保存?zhèn)溆?；步驟c中細胞培養(yǎng)液為在DMEM/F12液中添加其體積10%的胎牛血清，經(jīng)0. 22微米過濾器過濾、分裝，4 °C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
一種對牛前體脂肪細胞進行體外培養(yǎng)的方法，屬于細胞與組織工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明基于傳統(tǒng)消化培養(yǎng)方法，利用組織勻漿機結(jié)合膠原酶I培養(yǎng)基處理脂肪組織，采用含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對牛前體脂肪細胞進行體外培養(yǎng)，成功建立了牛前體脂肪細胞體外培養(yǎng)的新模型。本發(fā)明工藝先進簡單、培養(yǎng)基配制科學(xué)合理，節(jié)省了人力和物力，極大的縮短了試驗樣品處理的時間，且獲得細胞形態(tài)最好，培養(yǎng)及提取RNA效率最高，是一種更為便捷、長期高效的前體脂肪細胞培養(yǎng)方法，為后續(xù)深入研究前體脂肪細胞增殖分化過程中基因、蛋白的表達及信號通路奠定基礎(chǔ)，且為調(diào)控肉牛體脂沉積、預(yù)防奶牛圍產(chǎn)期和泌乳高峰期疾病等提供新思路和新方法。
文檔編號C12N5/077GK102559589SQ20121006029
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者萬發(fā)春, 劉曉牧, 劉桂芬, 宋恩亮, 成海建, 游偉, 譚秀文 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所