專利名稱：一種基于納米鈀標(biāo)記的基因芯片顯色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種基于納米鈀標(biāo)記的基因芯片顯色方法，屬于納米技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因芯片(或稱DNA微陣列)技術(shù)在生物檢測(cè)、疾病診斷、藥物篩選和基因序列分析上有著極其重要的意義，是目前發(fā)展較快的一種高通量篩選技術(shù)。它把大量已知序列的寡核苷酸探針集成在同一個(gè)基片上(如玻璃、尼龍膜等載體)，然后將標(biāo)記好(同位素、酶或熒光等)的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，接著利用各種成像技術(shù)，將標(biāo)記雜交后的信號(hào)讀出，最后對(duì)生物細(xì)胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析的一套檢測(cè)系統(tǒng)。目前，基因芯片雜交結(jié)果的檢測(cè)技術(shù)主要有以下幾種同位素標(biāo)記檢測(cè)法、熒光標(biāo)記檢測(cè)法等。其中，同位素標(biāo)記檢測(cè)法，盡管其靈敏度高，但空間分辨率低。同時(shí)，放射性標(biāo)記檢測(cè)體系需要特殊培訓(xùn)的技術(shù)人員，且還會(huì)面臨放射性污染及標(biāo)記活性受半衰期限制的問(wèn)題。因此，除一些特定實(shí)驗(yàn)環(huán)境下還在使用外，一般實(shí)驗(yàn)室都不采用該技術(shù)。而突光標(biāo)記檢測(cè)法是目前應(yīng)用最為廣泛的一種技術(shù)，被國(guó)際上Affymetrix公司等重要生物芯片制備公司所采用。它在DNA靶序列上標(biāo)記熒光染料如Cy3、Cy5，與DNA探針雜交后，熒光雜交信號(hào)可通過(guò)熒光掃描儀或激光掃描共焦顯微鏡獲取。此法成熟穩(wěn)定，但所用的掃描儀器較為昂貴，成本較高，而且熒光在空氣中易被淬滅。因此，如何結(jié)合不同生物分子標(biāo)記方法的探索，對(duì)大量的信息進(jìn)行簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜地解讀，仍是科學(xué)家的夢(mèng)想，是目前的一個(gè)艱巨的技術(shù)問(wèn)題。近二十年來(lái)，隨著納米材料技術(shù)的蓬勃發(fā)展，通過(guò)對(duì)DNA分子進(jìn)行納米顆粒標(biāo)記，然后發(fā)展一種分析過(guò)程簡(jiǎn)單、不需要特殊儀器設(shè)備的顯色法或目測(cè)法成為大家的一個(gè)努力方向。比如，2002年，美國(guó)西北大學(xué)Mirkin教授報(bào)道了納米金標(biāo)記銀染的檢測(cè)方法。與熒光檢測(cè)方法相比，它的選擇性可高出3倍，而靈敏度則可提高100倍之多。其基本原理是將靶DNA末端標(biāo)記上納米金顆粒，雜交后，利用化學(xué)鍍使銀離子在金顆粒表面還原沉積，而還原后的單質(zhì)銀呈現(xiàn)出黑色的銀染信號(hào)。這種信號(hào)用肉眼就可觀察到，如果用普通的掃描儀掃描后再用相關(guān)軟件分析信號(hào)的灰度，即可得到準(zhǔn)確的灰度值。國(guó)內(nèi)的一些研究人員也將該技術(shù)引入基因芯片的檢測(cè)過(guò)程中，并紛紛提出各種專利保護(hù)如一種基因芯片的TSA-納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法(CN200610135832)、一種基因芯片的納米金標(biāo)記銀染檢測(cè)法(CN02113147)、納米微粒與親和素標(biāo)記探針及其制備方法和應(yīng)用(CN1415759)、可目視化生物芯片的制備方法(CN1955307)等。盡管如此，作為一種顯色法或目測(cè)法，金標(biāo)銀染法目前還未見(jiàn)商品化的基因芯片檢測(cè)中，仍處于實(shí)驗(yàn)室的低密度芯片分析試驗(yàn)中。究其原因有多方面，但其中關(guān)鍵一點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程中不易控制銀的沉積過(guò)程。理論上，作為一個(gè)化學(xué)鍍過(guò)程，只有在納米金存在的地方，才會(huì)出現(xiàn)因金的催化作用而沉積銀的現(xiàn)象。但實(shí)際過(guò)程中，由于銀的氧化還原電極電勢(shì)較大，很容易就被還原。隨著銀染的進(jìn)行，經(jīng)常出現(xiàn)納米金標(biāo)記處剛出現(xiàn)黑色銀斑點(diǎn)的同時(shí)，整個(gè)鍍液也變成黑色，還原后的銀在載玻片表面四處非特異性的沉積，從而給整個(gè)芯片的后期分析帶來(lái)影響。為此，尋求一個(gè)新的基因芯片顯色法對(duì)發(fā)展可目視化的芯片檢測(cè)技
術(shù)將有著重要意義。納米鈀顆粒近年來(lái)一直吸引 了眾多研究者的目光，2007年因?yàn)槠湓赟uzuki和Heck反應(yīng)上出色的催化性能，而促使兩位科學(xué)家獲得化學(xué)Nobel獎(jiǎng)。與納米金相比，鈀的催化范圍更廣。從化學(xué)鍍角度看，鈀不僅可以催化銀的沉積，而且還可以催化鈷、鎳、鐵、銅等金屬的還原。同時(shí)，從鈷、鎳、鐵、銅等金屬的催化還原過(guò)程看，由于它們的氧化還原電位沒(méi)有銀離子的高，化學(xué)鍍過(guò)程中，這些金屬沉積過(guò)程的特異性非常強(qiáng)，只有出現(xiàn)納米鈀標(biāo)記的地方才會(huì)出現(xiàn)金屬沉積。從而可以有效地解決以上基于納米金標(biāo)記銀染的基因芯片目視化技術(shù)的所有缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前基因芯片目測(cè)法或顯色法中(特別是金標(biāo)銀染的檢測(cè)方法)存在的反應(yīng)過(guò)程不易控制、特異性差等缺點(diǎn)，基于納米鈀標(biāo)記與對(duì)應(yīng)的顯色方法，提供一種全新的基因芯片顯色方法。技術(shù)方案本發(fā)明所述的基于納米鈀標(biāo)記的基因芯片顯色方法，將納米鈀取代納米金進(jìn)行樣品生物分子標(biāo)記，然后將納米鈀標(biāo)記后的樣品DNA與芯片進(jìn)行雜交?；蛘呦葘悠飞锓肿优c芯片雜交，然后再進(jìn)行納米鈀標(biāo)記。在完成芯片上納米鈀的標(biāo)記后，再將芯片浸入含有鈷、銅、鎳或其他金屬離子的鍍液中進(jìn)行化學(xué)鍍，沉積金屬，從而完成可視化過(guò)程。最后，利用普通的光學(xué)掃描儀對(duì)其掃描，進(jìn)行信號(hào)的定量分析。本發(fā)明方法具體包括如下步驟(I)待測(cè)樣品的基因提取、純化、擴(kuò)增與標(biāo)記基因提取、純化的具體方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，J.薩姆布魯克；基因的擴(kuò)增采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)；樣品DNA的標(biāo)記是在上述PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)特定的生物素修飾引物或一個(gè)含共用DNA序列的引物完成；(2)生物分子的納米鈀標(biāo)記，根據(jù)后面檢測(cè)過(guò)程的不同，分為兩種生物分子的納米鈀標(biāo)記(2-1)共用序列DNA-納米鈀的制備將一段5，(3，)端含巰基(-SH)的共用DNA序列與納米鈀水溶液孵育12-48小時(shí)，然后，離心清洗去除多余DNA?；蛘邔⒁欢?，(3，)端含胺基(-NH2)的共用DNA序列與醛基(或羧基)修飾納米鈀反應(yīng)，利用共價(jià)鍵將DNA連到納米鈀表面；(2-2)親和素(或鏈親和素)_納米鈀的制備，在EDC\NHS的幫助下，將親和素(或鏈親和素)連接到羧基修飾的納米鈕表面；(3)芯片的制備可采用商品化的基因芯片，如Affymetrix公司提供，亦可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自己設(shè)計(jì)制備，其過(guò)程參照一般芯片的制備過(guò)程，即先對(duì)玻璃載玻片表面進(jìn)行清洗、去除污染物。接著，利用氨基硅烷化試劑在玻片表面修飾上氨基。隨后，再通過(guò)戊二醛分子在玻片表面修飾醛基功能團(tuán)。最后，根據(jù)檢測(cè)樣品的特點(diǎn)，利用點(diǎn)樣儀將所設(shè)計(jì)的DNA探針點(diǎn)樣到玻片表面進(jìn)行固定；(4)芯片的雜交先將步驟(I)獲得的目標(biāo)DNA分散在TE緩沖液中，然后按2 I的關(guān)系將其與雜交母液混合，配成雜交液；接著，在雜交艙或蓋玻片的幫助下，將雜交液覆蓋在芯片表面進(jìn)行生物分子反應(yīng)O. 5-1. 5小時(shí)，具體雜交溫度取決于實(shí)驗(yàn)中待測(cè)樣品中的G-C含量與堿基個(gè)數(shù)；雜交完成后，利用清洗液，洗去多余的、非特異性吸附的DNA片段；(5)芯片表面的納米鈀標(biāo)記，根據(jù)樣品DNA標(biāo)記方法的不同，采用兩種不同標(biāo)記納米鈀方法(5-1)樣品DNA標(biāo)記是利用共用DNA序列標(biāo)記，則將以上得到的芯片再與共用DNA序列標(biāo)記納米鈀進(jìn)行二次雜交，雜交溫度取決于共用DNA序列中的G-C含量與堿基個(gè)數(shù)；雜交后，清洗去除游離的共用DNA序列標(biāo)記納米鈀。該過(guò)程在本專利中也稱為“三明治”式的夾心法，特指檢測(cè)時(shí)將待測(cè)樣品DNA的一段設(shè)計(jì)成公共堿基設(shè)別區(qū)，與標(biāo)記物上連的DNA片段完全互補(bǔ)，而另一段為探針的識(shí)別區(qū)，即待測(cè)樣品的DNA檢測(cè)區(qū)。由于檢測(cè)過(guò)程中，樣品DNA夾在探針與標(biāo)記物之間，形象地將其稱為“三明治”式的夾心法；(5-2)樣品DNA標(biāo)記是利用生物素標(biāo)記，則納米鈀標(biāo)記的過(guò)程采用生物素-親和素系統(tǒng)(所謂的生物素-親和素系統(tǒng)，特指利用生物素與親和素之間的特異性相互作用，進(jìn)行分子連接的一種過(guò)程)，直接將親和素修飾納米鈀溶液與上面得到的芯片在35-38°C下，孵育反應(yīng)O. 5-1. 5小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，利用PBS緩沖液洗去多余的、未結(jié)合親和素-納米鈀顆粒；(6)顯色反應(yīng)利用化學(xué)鍍技術(shù)，將以上得到的芯片浸入含鈷、銅、鎳或其他金屬離子的鍍液中，進(jìn)行化學(xué)鍍反應(yīng)。反應(yīng)后，以上列舉的金屬離子將圍繞已修飾的鈀顆粒周圍進(jìn)行沉積。由于沉積的金屬為黑顏色，所以，清洗后，直接通過(guò)肉眼就可以觀察到最終的檢測(cè)情況。只有樣品序列與探針完全互補(bǔ)的點(diǎn)樣處才出現(xiàn)黑點(diǎn)，其他錯(cuò)配一個(gè)堿基或兩個(gè)堿基的點(diǎn)樣處，顏色將較完全互補(bǔ)的點(diǎn)樣處顏色淺一些，而完全錯(cuò)配的點(diǎn)樣處將無(wú)任何黑色金屬沉積；(7)芯片的定量分析利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)以上顯色后的芯片進(jìn)行灰度掃描，然后利用photoshop等圖片處理軟件對(duì)掃描出的圖片進(jìn)行灰度值分析，從而進(jìn)一步從量化的角度分析正錯(cuò)比例。有益效果本發(fā)明方法與現(xiàn)有的一些基于金標(biāo)銀染的基因芯片顯色技術(shù)如CN200610135832、CN02113147、CN1415759、CN1955307 等相對(duì)比，最大的不同點(diǎn)是本發(fā)明方法采用了納米鈀標(biāo)記、顯色方法是通過(guò)鈀對(duì)鈷、銅、鎳等金屬的催化沉積實(shí)現(xiàn)的，從而克服了以往金標(biāo)銀染過(guò)程中出現(xiàn)的系列缺點(diǎn)，如銀染通常要在暗室進(jìn)行，銀自動(dòng)沉積的速度很快，給信號(hào)分辨工作帶來(lái)困難等。在納米鈀為催化劑的化學(xué)鍍過(guò)程中，上述金屬離子只有在遇到具有催化活性的鈀顆粒時(shí)才會(huì)迅速在其表面沉積，從而達(dá)到顯色過(guò)程可控、顯色過(guò)程 的非特異性沉積較少目的。同時(shí)，如能控制好雜交條件與化學(xué)鍍溫度，還可以大大提高堿基的正錯(cuò)配信號(hào)比。如圖I所示，其中，(A)為本發(fā)明提出的基于納米鈀標(biāo)記與鈷化學(xué)鍍顯色后的結(jié)果，(B)為傳統(tǒng)“金標(biāo)銀染”的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)比可以看出，(A)中只有完全正配的位點(diǎn)處出現(xiàn)黑色，而其它錯(cuò)配1-2個(gè)堿基的位點(diǎn)處無(wú)任何黑色沉淀。但((B))中在錯(cuò)配1-2個(gè)堿基的位點(diǎn)處仍有銀沉積。所以說(shuō)本發(fā)明方法提出的技術(shù)路線在堿基的正錯(cuò)配識(shí)別信號(hào)比上也要好于傳統(tǒng)“金標(biāo)銀染”顯示法。


圖I為本發(fā)明提出的基于納米鈀標(biāo)記的顯色法與傳統(tǒng)“金標(biāo)銀染”顯色的結(jié)果比較。圖2為基于生物素-親和素系統(tǒng)的納米鈀標(biāo)記過(guò)程。其中，(a)代表了固定有不同 探針的基因芯片，(b)為基因芯片與生物素標(biāo)記樣品DNA雜交后的結(jié)果，(c)通過(guò)生物素與親和素之間的特異性相互作用，在以上標(biāo)記有生物素的芯片位點(diǎn)處進(jìn)一步修飾上納米鈀，(d)通過(guò)化學(xué)鍍過(guò)程，在納米鈀的催化作用下，顯色沉積上鈷等金屬單質(zhì)。圖3為納米鈀標(biāo)鈷顯色的基因芯片檢測(cè)結(jié)果(a)與灰度分析(b)。圖4為基于“三明治”夾心法的納米鈀標(biāo)記過(guò)程。其中，(a)代表了固定有不同探針的基因芯片，(b)為基因芯片與共用序列DNA標(biāo)記的樣品DNA雜交后的結(jié)果，(c)通過(guò)共用序列DNA與納米鈀表面連接的互補(bǔ)共用序列DNA之間的堿基之間相互作用，進(jìn)一步修飾上納米鈀，(d)通過(guò)化學(xué)鍍過(guò)程，在納米鈀的催化作用下，顯色沉積上鈷等金屬單質(zhì)。
具體實(shí)施例方式應(yīng)該特別指出的是，在以下實(shí)施例中，芯片上的探針陣列與探針序列是任意選擇的，分別與靶DNA完全互補(bǔ)、錯(cuò)配一個(gè)堿基、錯(cuò)配兩個(gè)堿基與完全錯(cuò)配序列。這樣做的目的純粹只是為了簡(jiǎn)單明了地說(shuō)明原理。實(shí)際過(guò)程中，陣列密度與探針序列并不受此限制，探針密度可以根據(jù)芯片的制備方法有所不同，而DNA序列也將根據(jù)實(shí)際過(guò)程進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)施例I :基于生物素-親和素系統(tǒng)的納米鈀標(biāo)記與芯片的顯色檢測(cè)，示意圖如圖2。在該實(shí)施例中，我們隨機(jī)選擇了實(shí)驗(yàn)室中正在進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因檢測(cè)為例。選擇CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子設(shè)計(jì)特異性引物及探針，經(jīng)過(guò)在PCR體系中摻入生物素修飾的dUTP擴(kuò)增得到帶有生物素的核酸片段，與芯片上的特異探針進(jìn)行雜交結(jié)合，然后加入鏈親和素修飾的納米鈀與生物素結(jié)合，再通過(guò)催化鈷染或其他金屬離子沉積，進(jìn)行顯色及放大信號(hào)。最后，經(jīng)過(guò)掃描儀掃描其灰度值測(cè)量結(jié)果。(a)生物素標(biāo)記35S DNA片段(biotin_35S)的擴(kuò)增根據(jù)E.coli BL21菌株的基因組DNA序列,用Primer Premier V5. O軟件設(shè)計(jì)CAT的PCR引物，由該對(duì)引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物為283bp。在20 μ L PCR混合反應(yīng)體系中含有I XTaq酶緩沖液，I. 5mM MgCl2, 250 μ MdATPs,dGTPs, dCTPs,210yM dTTPs,40yM biotin-ll-dUTP (biotin-ll-dUTP 的摻入量參考 NewEngland Biolabs(NEB)公司“生物素標(biāo)記dNTP混合物”(產(chǎn)品貨號(hào)N7550S)中biotin-dATP的量確定)，和5U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，60°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)35次，最后72°C延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物及基因組DNA用I. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。(b)親和素-納米鈀的制備將所得Iml Pd-S-(CH2) 11-C00H溶液，在13000rpm下，離心30min。除去上清液后，將底層的黑色沉淀用MES緩沖液稀釋至lml，并加入O. 4mg EDC (約2mM)和O. 6mgNHS室溫反應(yīng)15分鐘。然后，在4 , 13000rpm下,離心IOmin,去除上清液,加入Iml含ImM的親和素PBS緩沖液。接著，將以上混合溶液在4°C下，反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，離心清洗去除掉多余的親和素。再加入O. lmol/L的乙醇胺PBS緩沖液，封閉掉剩余的、未反應(yīng)的活化羧基基團(tuán)，并再次清洗。最后，得到了親和素修飾納米鈀顆粒，貯存于4°C備用(c)DNA芯片的制作L玻片的清洗以及硅烷化a)首先將玻片置于甲醇與鹽酸I : I的混合溶液中，浸泡30min ;b)雙蒸水清洗后再將玻片置于濃硫酸中浸泡30min。先用雙蒸水，再用95%的乙醇充分沖洗玻片，洗凈表面殘余的酸液，然后氮?dú)獯蹈梢后w；c)將95%的乙醇和硅烷以49 I配制成硅烷化試劑，浸泡玻片IOmin ；d)硅烷化后的玻片，用雙蒸水充分清洗，氮?dú)獯蹈?；e)將玻片置于干燥箱內(nèi)，110°C，烘30min。玻片的硅烷化就完成了。2.手臂分子的聯(lián)接(I)硅烷化后的玻片首先用95%乙醇浸泡清洗5min，雙蒸水充分清洗吹干；(2)用O. OlM的PB液將25%戊二醛稀釋成5%的溶液，浸泡玻片2h ；(3)用O. OlM的PB清洗玻片，除去殘余的戊二醛；(4)用雙蒸水沖洗玻片，吹干，待用。3.探針的點(diǎn)樣及固定(I)用碳酸緩沖液將探針稀釋至80pmol/ μ L ；(2)將O. 15 μ L探針溶液每個(gè)點(diǎn)，手工點(diǎn)樣點(diǎn)在修飾好的玻片上；(3)將放有玻片的表面皿封閉，室溫下放置過(guò)夜(時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)效果更佳)；(4)37°C下水浴I個(gè)小時(shí)；(5)取出玻片，用O. I %的SDS溶液沖洗5min ；(6)再用雙蒸水清洗4-5遍，吹干；(7)用硼氫化鈉還原試劑浸泡玻片30min ；(8)用雙蒸水洗凈后吹干放置待用。(d)芯片的雜交將待測(cè)PCR產(chǎn)物95°C變性lOmin，置于冰上3min后，用雜交液以I : 3稀釋PCR產(chǎn)物，分別取O. 15 μ L待測(cè)PCR產(chǎn)物與芯片上的探針于44°C雜交lh，分別用2XSSC/0. 1%SDS 和 O. 1XSSC/0. 1% SDS 溶液各清洗 2min，再用 2 X PBN (O. 3MNaN0s, IOmMPB, pH 7)液清洗 2min。(e)芯片表面的鈀標(biāo)記雜交后的芯片浸入鏈親和素修飾膠體鈀(顆粒濃度調(diào)節(jié)為IOnM)中l(wèi)Omin，再分別用 2 X SSC/0. I % SDS 和 O. I X SSC/0. I % SDS 溶液各清洗 2min,再用 2 X PBN (O. 3MNaN0s,IOmMPB, pH 7)液清洗 2min。(f)顯色反應(yīng)接著，將以上所得芯片浸入含鈷的鍍液中進(jìn)行信號(hào)放大與顯影。其中，鍍液成分由以下A和B兩種溶液構(gòu)成，在進(jìn)行化學(xué)鍍之前，現(xiàn)場(chǎng)配制。A溶液為還原液，胺基硼烷(DMAB) O. 39g/L。另外，還原劑還可以為NaBH4、KBH4等堿金屬硼氫化物、三甲胺基硼烷、三乙胺基硼烷等胺基硼烷以及肼等，以DMAB為佳。B溶液中為CoSO4 8_14g/L、NaH2 PO2 20g/L、C6H5O7Na3 64g/L、絡(luò)合劑O. 020g/L、穩(wěn)定劑O. 003g/L、表面活性劑O. 5g/L。化學(xué)鍍前，直接將以上A、B兩種溶液混合，并將其pH值調(diào)至8 8. 5。然后將以上獲得微陣列浸入進(jìn)行反應(yīng)，30 40°C下反應(yīng)lOmin，水洗吹干。 或者浸入鎳染鍍液中進(jìn)行信號(hào)放大與顯影。其中，鍍液成分由以下A和B兩種溶液構(gòu)成，在進(jìn)行化學(xué)鍍之前，現(xiàn)場(chǎng)配制。A溶液為還原液，胺基硼烷(DMAB)O. 39g/L。另外，還原劑還可以為NaBH4、KBH4等堿金屬硼氫化物、三甲胺基硼烷、三乙胺基硼烷等胺基硼烷以及肼等，以 DMAB 為佳。B 溶液中為 NiSO4 (以 Ni2+ 計(jì))/g · L_14 7、NaH2PO2 · W2Qfg · 1^20 40蘋(píng)果酸/g -L^1IO 30琥珀酸/g ·Ι^5 15?；瘜W(xué)鍍前，直接將以上Α、Β兩種溶液混合，并將其pH值調(diào)至4 5。然后將以上獲得微陣列浸入進(jìn)行反應(yīng)，70 93°C下反應(yīng)lOmin，水洗吹干?；蛘呓脬~染鍍液中進(jìn)行信號(hào)放大與顯影。其中，鍍液成分由以下A和B兩種溶液構(gòu)成，在進(jìn)行化學(xué)鍍之前，現(xiàn)場(chǎng)配制。A溶液3g CuSO4,4g NaOH、14g酒石酸鈉鉀、IOOml水，B溶液37. 2%的福爾馬林溶液。化學(xué)鍍前，直接將以上A、B兩種溶液混合，然后將以上獲得微陣列浸入進(jìn)行反應(yīng)。室溫下反應(yīng)lOmin，水洗吹干。(g)芯片的定量分析用水沖洗后，再用氮?dú)獯蹈尚酒缓髮⑵渲糜谀z成像掃描儀中，對(duì)以上顯色后的芯片進(jìn)行灰度掃描，最后利用photoshop等軟件對(duì)掃描出的圖片進(jìn)行灰度值分析。圖3代表性地給出了鈷顯色后的掃描圖與灰度值。從圖3(a)中可以看出，經(jīng)過(guò)鈷化學(xué)鍍后，通過(guò)肉眼就可以直接觀察到芯片雜交后的結(jié)果。完全正配的探針位點(diǎn)處，顏色非常黑。錯(cuò)配I個(gè)堿基處，顏色較淺。錯(cuò)配2個(gè)堿基處，顏色更淺。而完全錯(cuò)配的位點(diǎn)處沒(méi)有任何黑色的鈷沉積。特別需要指出的是，在整個(gè)顯色過(guò)程中，除以上位點(diǎn)顯示的黑色斑點(diǎn)外，鍍液及玻璃載體的其他地方均沒(méi)有出現(xiàn)顏色的變化，這說(shuō)明基于納米鈀標(biāo)記及隨后的鍍鈷顯色表現(xiàn)出良好的可控性，特異性很強(qiáng)。從檢測(cè)靈敏度看，以上樣品的最低檢測(cè)極限亦達(dá)到PM級(jí),與金標(biāo)銀染相當(dāng)。圖3(b)進(jìn)一步給出圖3(a)所對(duì)應(yīng)的平均灰度值,從中可以看出，正配錯(cuò)配I個(gè)堿基錯(cuò)配2個(gè)堿基完全錯(cuò)配之間的灰度值比為I : 0. 6 : 0. 2 : 0，從而達(dá)到基因芯片檢測(cè)中對(duì)堿基正錯(cuò)配的要求。實(shí)施例2 :基于“三明治”式的夾心法系統(tǒng)進(jìn)行納米鈀標(biāo)記與芯片的顯色檢測(cè)，示意圖如圖4。在該實(shí)施例中，我們參照文獻(xiàn)Taton et al, Science 2000，289，1757，直接設(shè)計(jì)了樣品DNA(I)、共用DNA序列(6)與芯片表面的四種探針(2_5)，如下例所示5’ -GGA TTA TTG TTAAAT ATT GAT AAG GAT-3’ 所設(shè)計(jì)的待測(cè)樣品 DNA⑴5’ -CCT AAT AAC AAT-3’ 完全互補(bǔ)探針 (2)5’ -CCT ATT AAC AAT-3’ 錯(cuò)配 I 個(gè)堿基探針 (3)5’ -CCT ATG AAC AAT-3’ 錯(cuò)配 2 個(gè)堿基探針 (4)5’ -AAAAGT GTGAGA-3’ 完全錯(cuò)配探針 (5)Pd-5，-HS-ATC CTT ATC AAT ATT-3’ (6)這樣做的目的是簡(jiǎn)化問(wèn)題，更簡(jiǎn)潔的將整個(gè)原理講清。因此，在該實(shí)施例中，就省去了目標(biāo)樣品DNA的提取、擴(kuò)增、純化與標(biāo)記等步驟，直接由上海博亞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司代為合成。(a)共用序列-納米鈀的制備
將2ml所制備的檸檬酸修飾Pd膠體溶液(平均粒徑在10納米)與IOD巰基-共用序列DNA (5，-HS-ATC CTT ATC AAT ATT-3’，其最終濃度大約在3. 51μΜ)混合，室溫下孵育16h。加入3ml磷酸緩沖液(IOmM PB, O. IM NaCl，pH 7)，繼續(xù)孵育48h。然后在HOOOrpm下離心25min，以分離未標(biāo)記的DNA。離心后除去上層清液，底層的黑色沉淀重新用5ml磷酸緩沖液(IOmM PB, O. IM NaCl, pH 7)稀釋，再次在14000rpm下離心25min,除去上清液，下層黑色沉淀加入lml 2XPBS液(IOmM PB, O. 3M NaCl,pH 7)，母液貯存于4°C備用?；蛘邔⑺胠ml Pd-S- (CH2) n-COOH溶液，在14000rpm下，離心30min,除去上清液，然后將底層的黑色沉淀用MES緩沖液稀釋至1ml，加入O. 4mgEDC(約2mM)和O. 6mgNHS室溫反應(yīng)15分鐘。然后，將IOD的H2N-ATC CTTATC AAT ATT-3’溶液加入上述溶液中，繼續(xù)孵育24h。反應(yīng)后，將以上混合溶液在14000rpm下離心30min。去除上清液后，將下層黑色沉淀加入lml 2 X PBS液(IOmM PB, O. 3M NaCl，pH 7)，母液貯存于4°C備用。經(jīng)過(guò)以上過(guò)程制備了納米Pd修飾的DNA靶序列。(b) DNA芯片的制作芯片的制作過(guò)程與實(shí)施例1(c)中的步驟基本相似，唯一不同的是固定在玻片表面的探針換成以上系列(2-5)。(C)芯片的雜交將以上人工合成的樣品DNA(5，-GGA TTA TTG TTAAAT ATT GAT AAG GAT-3’ )與步驟(b)中獲得的芯片進(jìn)行雜交，雜交液為MiCToHyb，雜交條件與熒光法相同。S卩，將200 μ I含樣品DNA的雜交液點(diǎn)在玻片表面，蓋上蓋玻片，40°C下雜交I小時(shí)。最后，分別用2XSSC/0. 1% SDS和O. 1XSSC/0. 1% SDS溶液各清洗lOmin，除去非特異性吸附在芯片表面的樣品DNA。(d)芯片表面的鈀標(biāo)記將以上雜交后的芯片再次與含Pd-5’-HS-ATC CTT ATC AAT ATT-3’的雜交液進(jìn)行雜交，雜交條件與步驟(C) 一樣，唯一不同的是雜交過(guò)程在雜交艙中進(jìn)行的。(e)顯色反應(yīng)與實(shí)施例I中步驟(f)相同。(f)芯片的定量分析與實(shí)施例I中步驟(g)相同。如上所述，盡管參照特定的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)表示和表述了本發(fā)明，但其不得解釋為對(duì)本發(fā)明自身的限制。在不脫離所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍前提下，可對(duì)其在形式上和細(xì)節(jié)上作出各種變化。
權(quán)利要求
1.一種基于納米鈀標(biāo)記的基因芯片顯色方法，其特征在于包括如下步驟 (1)待測(cè)樣品的基因提取、純化、擴(kuò)增與標(biāo)記； (2)生物分子的納米鈀標(biāo)記，根據(jù)后面檢測(cè)過(guò)程的不同，分為兩種生物分子的納米鈀標(biāo)記 (2-1)共用序列DNA-納米鈀的制備將一段5，(3，)端含巰基(-SH)的共用DNA序列與納米鈀水溶液孵育12-48小時(shí)，然后，離心清洗去除多余DNA ;或者將一段5，(3，)端含胺基(-NH2)的共用DNA序列與醛基或羧基修飾納米鈀反應(yīng)，利用共價(jià)鍵將DNA連到納米鈀表面； (2-2)親和素或鏈親和素-納米鈀的制備在EDC\NHS的幫助下，將親和素或鏈親和素連接到羧基修飾的納米鈀表面； (3)芯片的制備先對(duì)玻璃載玻片表面進(jìn)行清洗、去除污染物；接著，利用氨基硅烷化試劑在玻片表面修飾上氨基；隨后，再通過(guò)戊ニ醛分子在玻片表面修飾醛基功能團(tuán)；最后，根據(jù)檢測(cè)樣品的特點(diǎn)，利用點(diǎn)樣儀將所設(shè)計(jì)的DNA探針點(diǎn)樣到玻片表面進(jìn)行固定； (4)芯片的雜交先將步驟(I)獲得的目標(biāo)DNA分散在TE緩沖液中，然后按2 I的關(guān)系將其與雜交母液混合，配成雜交液；接著，在雜交艙或蓋玻片的幫助下，將雜交液覆蓋在芯片表面進(jìn)行生物分子反應(yīng)O. 5-1. 5小時(shí)，具體雜交溫度取決于實(shí)驗(yàn)中待測(cè)樣品中的G-C含量與堿基個(gè)數(shù)；雜交完成后，利用清洗液，洗去多余的、非特異性吸附的DNA片段； (5)芯片表面的納米鈀標(biāo)記，根據(jù)樣品DNA標(biāo)記方法的不同，采用兩種不同標(biāo)記納米鈀方法 (5-1)樣品DNA標(biāo)記是利用共用DNA序列標(biāo)記，則將以上得到的芯片再與共用DNA序列標(biāo)記納米鈀進(jìn)行二次雜交，雜交溫度取決于共用DNA序列中的G-C含量與堿基個(gè)數(shù)；雜交后，清洗去除游離的共用DNA序列標(biāo)記納米鈀； (5-2)樣品DNA標(biāo)記是利用生物素標(biāo)記，則納米鈀標(biāo)記的過(guò)程采用生物素-親和素系統(tǒng)，直接將親和素修飾納米鈀溶液與上面得到的芯片在35-38 °C下，孵育反應(yīng)O. 5-1. 5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，利用PBS緩沖液洗去多余的、未結(jié)合親和素-納米鈀顆粒； (6)顯色反應(yīng)利用化學(xué)鍍技術(shù)，將以上得到的芯片浸入含鈷、銅、鎳或其他金屬離子的鍍液中，進(jìn)行化學(xué)鍍反應(yīng)；反應(yīng)后，金屬離子將圍繞已修飾的鈀顆粒周圍進(jìn)行沉積，由于沉積的金屬為黑顏色，所以，清洗后，直接通過(guò)肉眼就可以觀察到最終的檢測(cè)情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米鈀標(biāo)記的基因芯片顯色方法，其特征在于 步驟(6)顯色反應(yīng)后，還包括 (7)芯片的定量分析利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)以上顯色后的芯片進(jìn)行灰度掃描，然后利用圖片處理軟件對(duì)掃描出的圖片進(jìn)行灰度值分析，從而進(jìn)一步從量化的角度分析正錯(cuò)比例。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于納米鈀標(biāo)記的基因芯片顯色方法，其特征在于 步驟(I)中，基因的擴(kuò)增采用聚合酶鏈反應(yīng)或反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于納米鈀標(biāo)記的基因芯片顯色方法，其特征在于 步驟(I)中，基因的標(biāo)記是在所述聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)特定的生物素修飾引物或ー個(gè)含共用DNA序列的引物完成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于納米鈀標(biāo)記的基因芯片顯色方法，采用了納米鈀標(biāo)記生物分子(如DNA、親和素等)，然后通過(guò)標(biāo)記后的納米鈀對(duì)鈷、銅、鎳等金屬的化學(xué)鍍過(guò)程具有催化沉積作用進(jìn)行顯色，從而克服了以往“金標(biāo)銀染”過(guò)程中出現(xiàn)的系列缺點(diǎn)，達(dá)到顯色過(guò)程可控、顯色過(guò)程的非特異性沉積較少的目的。對(duì)于顯色后的結(jié)果可以通過(guò)肉眼定性分析，亦可利用凝膠成像系統(tǒng)中的光學(xué)掃描儀進(jìn)行灰度掃描，并結(jié)合相關(guān)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析等定量研究，從而區(qū)別出探針與靶序列間的完全正配、錯(cuò)配一個(gè)堿基、錯(cuò)配兩個(gè)堿基與完全錯(cuò)配。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102618637SQ201210060708
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者王志飛 申請(qǐng)人:東南大學(xué)