專利名稱：稻啟動(dòng)子的制作方法
稻啟動(dòng)子本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年2月4日、申請(qǐng)?zhí)枮?00480003528. 9、發(fā)明名稱為“稻
啟動(dòng)子”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)植物中有效連接的核酸表達(dá)的核酸序列。公開了該核酸序列從稻的分離，以及其在驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)有效連接的核酸表達(dá)中的用途。本發(fā)明因此涉及啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子、遺傳構(gòu)建體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)化載體、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和包含根據(jù)本發(fā)明的分離核酸的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及用于驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的方法以及用于轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的方法?；虮磉_(dá)取決于轉(zhuǎn)錄起始，其通過轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物介導(dǎo)?；虮磉_(dá)還取決于轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，其確定多強(qiáng)、何時(shí)以及在何處基因得到表達(dá)。所述基因表達(dá)的調(diào)節(jié)可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件介導(dǎo)，其通常嵌入核酸序列5'-側(cè)或表達(dá)基因的上游。上游核酸區(qū)域因?yàn)槠鋯?dòng)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的結(jié)合、形成和/或活化而通常稱為“啟動(dòng)子”，并且因此能夠驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)其 3’下游核酸序列的表達(dá)。為獲得有用的植物表型的植物遺傳工程通常包括異源基因的表達(dá)，其一般通過能驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)有效連接的異源核酸表達(dá)的啟動(dòng)子介導(dǎo)。宿主植物的表型不僅取決于異源核酸的貢獻(xiàn)，還取決于確定如何、在何處以及何時(shí)異源核酸得到表達(dá)的所選啟動(dòng)子特異表達(dá)模式的貢獻(xiàn)。因此，具有合適表達(dá)模式的啟動(dòng)子的選擇對(duì)于獲得合適的表型是至關(guān)重要的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將需要有效的不同啟動(dòng)子，以確定針對(duì)特定核酸的最優(yōu)啟動(dòng)子。對(duì)于許多不同的宿主植物，該有效性是相當(dāng)有限的而因此還是需要提供具有各種表達(dá)特點(diǎn)的新啟動(dòng)子。SEQ ID NO I至22表示的核酸從稻(Oryza Sativa)分離且已發(fā)現(xiàn)能驅(qū)動(dòng)和調(diào)節(jié)有效連接的核酸的表達(dá)；其表達(dá)模式也已被表征。因此本發(fā)明提供許多尚未知的分離核酸， 其可用作啟動(dòng)子。據(jù)此，本發(fā)明提供能驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)表達(dá)的分離啟動(dòng)子，包括(a) SEQ ID NO I至22任一所示的分離核酸或與SEQ ID NO I至22任一互補(bǔ)的分離核酸；或(b)與SEQ ID NO I至22任一所示的DNA序列具有至少90%序列同一性的分離核酸；或(c)與SEQ ID NO I至22任一所示的DNA序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下特異性雜交的分離核酸；或(d) (a)至(C)中任一項(xiàng)定義的分離核酸，其通過插入序列而間隔；或(e) (a)至(d)中定義的任一核酸的片段，其能驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)表達(dá)。如此處使用的術(shù)語“分離的”指從其原始來源中移出。優(yōu)選地，“分離的”啟動(dòng)子不含那些啟動(dòng)子來源的生物體基因組DNA中天然位于啟動(dòng)子側(cè)翼的序列(如蛋白質(zhì)編碼序列或位于3’末端的其他序列)。更優(yōu)選地，“分離的”啟動(dòng)子也不含那些天然側(cè)接于其5’末端的序列。更優(yōu)選地，“分離的”啟動(dòng)子包括啟動(dòng)子來源的生物體基因組DNA中與該啟動(dòng)子天然在一起的少于 5kb、4kb、3kb、2kb、I. 5kb、I. 2kb、lkb、0. 8kb、0. 5kb 或 0. Ikb 的核昔酸序列。本發(fā)明并不限于由SEQ ID NO I至22表示的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以存在維持同樣功能的核酸的變體或片段。這些變體或片段可以是人工的(例如，通過遺傳工程)或甚至可以是自然界存在的。因此本發(fā)明涉及SEQ ID NO I至22任一的變體核酸及片段，其在本發(fā)明方法中是有用的。上述變體及片段包含(a) SEQ ID NO I至22中任一所示的分離核酸或與SEQ ID NO I至22任一互補(bǔ)的分離核酸；或(b)與SEQ ID NO I至22任一所示的DNA序列具有至少90%序列同一性的分離核酸；或(c)與SEQ ID NO I至22任一所示的DNA序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下特異性雜交的分離核酸；或(d) (a)至(C)任一中定義的分離核酸，其通過插入序列而間斷；或(e) (a)至(d)中定義的任一核酸的片段，其能驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)表達(dá)。SEQ ID NO I至22任一的合適變體包含與SEQ ID NO I至22所示任一核酸具有遞增的優(yōu)選至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的同源物。同一性的百分比可用比對(duì)程序計(jì)算。優(yōu)選可使用成對(duì)的全序列對(duì)比程序，其執(zhí)行 Needleman-Wunsch的算法(J. Mo I. Biol. 48 :443-453,1970)。該算法最大化匹配數(shù)目而最小化缺口數(shù)目。所述程序有例如GAP、Needle (EMBOSS程序包)、stretcher (EMBOSS程序包) 或Align X(Vector NTI suite 5. 5)且可使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(例如缺口開放罰分15和缺口延伸罰分 6. 66)。做為選擇，可使用執(zhí)行 Smith-Waterman(Advances in Applied Mathematics 2,482-489(1981))算法的局部比對(duì)程序。所述程序有例如Water (EMBOSS程序包)或 matcher (EMBOSS程序包)。如此處使用的“序列同一性”優(yōu)選對(duì)整個(gè)SEQ ID NO I至22任一所示的啟動(dòng)子全長(zhǎng)進(jìn)行計(jì)算。這些啟動(dòng)子的長(zhǎng)度列于表2中。同源核酸的檢索和鑒定在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的范圍內(nèi)。該方法，包括用本發(fā)明提供的序列篩選序列數(shù)據(jù)庫(kù)，序列例如SEQ ID NO I至22的任意一個(gè)，優(yōu)選以計(jì)算機(jī)可讀的形式。有用的序列數(shù)據(jù)庫(kù)包括但不限于Genbank (http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/ web/Genbank),歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL) (http: /w. ebi. ac. uk/ebi-docs/ embl-db. html)或其不同版本，或MIPS數(shù)據(jù)庫(kù)(http://mips.gsf.de/)。用于序列比對(duì)和比較的不同檢索算法和軟件在本領(lǐng)域眾所周知。所述軟件包括，例如GAP、BESTFIT、BLAST、 FASTA和TFASTA。優(yōu)選使用BLAST軟件，其計(jì)算序列同一性百分比且進(jìn)行序列間相似性的統(tǒng)計(jì)分析。稱為BLAST程序的程序組具有5個(gè)不同的執(zhí)行程序三個(gè)設(shè)計(jì)用于核苷酸序列查詢(BLASTN、BLASTX和TBLASTX)而兩個(gè)設(shè)計(jì)用于蛋白質(zhì)序列查詢(BLASTP和TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology :76-80,1994 ；Birren 等，Genome Analysis, I :543, 1997)。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公開得到。鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)基因組和稻基因組序列可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)如 Genbank中獲得。其他基因組目前正在測(cè)序中。因此，由于可獲得更多的其他植物基因組序列，預(yù)計(jì)可通過與SEQ ID NO I至SEQ ID NO 22任一進(jìn)行序列比對(duì)而鑒定同源啟動(dòng)子。技術(shù)人員將很容易得到來自其他植物種類的同源啟動(dòng)子，例如來自其他農(nóng)作物植物，如玉米。來自其他農(nóng)作物植物的同源啟動(dòng)子對(duì)在農(nóng)作物植物中實(shí)施本發(fā)明的方法尤其有用。具有與SEQ ID NO I至22的任一至少90%序列同一性同源物的一種實(shí)例為SEQ ID NO I至22的任一等位變體。等位變體為同一種類的兩個(gè)不同個(gè)體中的同一基因中發(fā)生的變體并且通常等位變體由于微小的序列變化而不同。等位變體可包含單核苷酸多態(tài)性 (SNP)以及小插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于IOObp。SNP和INDEL在大多數(shù)生物體的天然發(fā)生多態(tài)性品系中形成最大一組序列變體。適合用于本發(fā)明方法中的同源物可很容易通過PCR或雜交從其來源生物體分離。 其驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)表達(dá)的能力可很容易確定，例如，通過下列實(shí)施例部分描述的方法，用同源物簡(jiǎn)單替代用于實(shí)際實(shí)施例中的序列。本發(fā)明包含的其他SEQ ID NO I至22任一的合適變體為在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO I至22任一的核酸特異地雜交的核酸。術(shù)語“雜交”指在雜交過程中與基本上同源的互補(bǔ)的核苷酸序列的退火。依賴所述雜交過程的分子生物學(xué)工具包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR ; 和所有基于此的方法)、消減雜交、隨機(jī)引物延伸、核酸酶SI作圖、引物延伸、反轉(zhuǎn)錄、cDNA 合成、RNA差異顯示和DNA序列測(cè)定、Northern印跡法(RNA印跡法)、Southern印跡法(DNA 印跡法)。雜交過程還可與固定至基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖凝膠磁珠或任何其他樹脂的互補(bǔ)核酸發(fā)生。依賴該過程的分子生物學(xué)工具包括poly (A+) mRNA的分離。雜交過程還可與固定至固相支持物如硝酸纖維素或尼龍膜或通過例如光刻法固定至例如硅質(zhì)玻璃支持物的互補(bǔ)核酸發(fā)生(后者稱為核酸陣列或微陣列或稱為核酸芯片)。依賴上述過程的分子生物學(xué)工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、菌落雜交、噬斑雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了能夠進(jìn)行雜交，通常通過熱或化學(xué)方法使核酸分子變性，從而使雙鏈熔解成兩條單鏈和/或由單鏈核酸消除發(fā)夾或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交嚴(yán)謹(jǐn)度受到如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成等條件的影響。在例如 Sambrook(2001)Molecular Cloning a laboratory manual, 3rdEdition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, NewYork 中描述了常規(guī)的雜交條件,但熟練的技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)可根據(jù)已知的或預(yù)期的同源性和/或核酸序列的長(zhǎng)度而設(shè)計(jì)多種不同的雜交條件。高嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交條件包括高溫和/或低鈉/鹽濃度(鹽包括鈉，實(shí)例為NaCl 和檸檬酸三鈉)和/或在雜交緩沖液中包含甲酰胺和/或降低雜交緩沖液中如SDS(十二烷基磺酸鈉去污劑)等化合物的濃度和/或由雜交緩沖液中排除如硫酸葡聚糖或聚乙二醇 (促進(jìn)分子擁擠)等化合物。嚴(yán)謹(jǐn)條件下的特異雜交意味著序列非常相似。嚴(yán)謹(jǐn)條件下的特異雜交優(yōu)選在溫度60°C隨后用O. I至1XSSC、0. IXSDS和1XSSC、0. IXSDS洗滌下進(jìn)行。本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的任意核酸特異性雜交的至少有15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核酸分子。本發(fā)明還涉及通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴(kuò)增本發(fā)明核酸的至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核酸分子。本發(fā)明包含的SEQ ID NO I至22任一的另外的變體為與上述SEQ ID NO I至22 的任一或其變體對(duì)應(yīng)的核酸，其通過插入序列而間斷。例如，SEQ ID NO I至22所示的任意核酸可通過插入序列而間斷?！安迦胄蛄小北硎救我夂怂峄蚝塑账幔涫沽硪恍蛄兄袛?。 插入序列的實(shí)例包括內(nèi)含子、核酸標(biāo)簽、T-DNA和可移動(dòng)的核酸序列如轉(zhuǎn)座子或那些可通過重組而移動(dòng)的核酸。具體轉(zhuǎn)座子的實(shí)例包括Ac (激活劑)、Ds (解離)、Spm(抑制劑-突變基因)或En。目前廣泛應(yīng)用內(nèi)含子導(dǎo)入啟動(dòng)子。本發(fā)明的方法還可使用含有內(nèi)含子的SEQID NO I至22任一核酸序列而實(shí)施。若插入序列是內(nèi)含子，則將出現(xiàn)本發(fā)明核酸的可變剪切變體。如此處使用的術(shù)語“可變剪切變體”包含核酸序列變體，其中插入的內(nèi)含子已被切除、替換或加入。所述剪切變體可在自然界中找到或是人工的。制備具有內(nèi)含子的上述啟動(dòng)子或制備相應(yīng)剪切變體的方法是本領(lǐng)域所熟知的。適合用于本發(fā)明方法的通過插入序列間斷的變體可很容易例如通過下列實(shí)施例部分所述的方法用變體簡(jiǎn)單替代用于現(xiàn)有實(shí)施例中的序列而確定。上文所述的變體核酸可在自然界中得到(例如等位變體或剪切變體)。另外和/ 或做為選擇，上文所述的SEQ ID NO I至22任一的變體可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)包括例如突變、替代、插入、缺失或衍生而人工制得。本發(fā)明還包含上述變體，以及其在本發(fā)明方法中的用途。核酸的“突變變體”可使用重組DNA操作技術(shù)或核苷酸合成很容易地制得。上述技術(shù)的實(shí)例包含通過M13誘變的定點(diǎn)誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland, 0H)、快速變換的定點(diǎn)誘變(Stratagene，San Diego, CA)、PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其他定點(diǎn)誘變方案。 或者，本發(fā)明的核酸可隨機(jī)突變?！疤娲凅w”指那些核酸序列中至少一個(gè)殘基被除去且在其位置插入一不同殘基的變體。核酸替代一般為單殘基，但可以是取決于位于核酸序列的功能性限制的簇；插入通常為約I至約10個(gè)核酸殘基的順序，而缺失可以在約I至約20個(gè)殘基的范圍。核酸的“插入變體”為其中一個(gè)或多個(gè)核酸殘基被導(dǎo)入核酸預(yù)定位點(diǎn)的變體。插入可包括5’ -末端和/或3’ -末端的融合以及單個(gè)或多個(gè)核苷酸的內(nèi)部-序列插入。通常，核酸序列內(nèi)的插入小于5’-或3’-末端的融合，為約I至約10個(gè)殘基的順序。5’-或 3’_末端融合的實(shí)例包含用于酵母雙-雜交系統(tǒng)或酵母單-雜交系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活因子活化作用結(jié)構(gòu)域或結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或噬菌體包被蛋白、6組氨酸標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽、A蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、標(biāo)簽· 100表位、c-myc表位、FLAG -表位、IacZ, CMP (鈣調(diào)蛋白-結(jié)合多肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位的編碼序列。術(shù)語核酸的“衍生物”可包括與天然核酸相比天然的和非-天然存在的核酸殘基的替代，和/或缺失和/或添加。衍生物可例如包括甲基化核苷酸，或人工核苷酸。本發(fā)明還包括啟動(dòng)子,其包括上文所述SEQ ID NO I至22任一所示的任意核酸或其變體的片段。如此處使用的“片段”指核酸序列的一部分。用于本發(fā)明方法的合適片段為功能性片段，其至少保持啟動(dòng)子的功能性部分，由此仍然能驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)表達(dá)。啟動(dòng)子功能性片段的實(shí)例包含最小啟動(dòng)子、上游調(diào)控元件或其任意的組合。合適的片段可在至少約20個(gè)堿基對(duì)或約50、100、150、200、250、300、350、400、 450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 1000 個(gè)堿基對(duì)，直至本發(fā)明的全長(zhǎng)序列的范圍。該堿基對(duì)一般緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，但做為選擇，可以在啟動(dòng)子序列的任何地方。用于本發(fā)明方法的合適片段可通過技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，或通過以下實(shí)施例部分描述的方法測(cè)試其驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)表達(dá)的能力。SEQ ID NO I至22的任一公開的啟動(dòng)子作為來自特定的稻編碼序列(OTS)上游區(qū)域約I. 2kb的核酸而分離。核酸可包含啟動(dòng)子的一般元件，其在圖I中顯示。通常，啟動(dòng)子可包括從編碼序列至上游方向(i)前-信使RNA的5’ UTR, (ii)包括轉(zhuǎn)錄起始元件(INR)和更上游的TATA框的最小啟動(dòng)子，以及(iii)可包含決定啟動(dòng)子特定表達(dá)模式的調(diào)控元件。如此處使用的術(shù)語“啟動(dòng)子”應(yīng)用于整個(gè)上下文并且指能作用(驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)) 與其有效連接的序列表達(dá)的調(diào)控核酸序列。“啟動(dòng)子”包含源于典型基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。通常啟動(dòng)子包括TATA框，其能將轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物引導(dǎo)至適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始開始位點(diǎn)。 然而，一些啟動(dòng)子不具有TATA框(無TATA框啟動(dòng)子)，但仍然有驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)表達(dá)的完整功能。啟動(dòng)子可另外包括CCAAT框序列和另外的調(diào)控元件(即上游激活序列或順式-元件如增強(qiáng)子和沉默子)?！皢?dòng)子”還可包括典型原核類基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在這樣情況下其可包括-35框序列和/或-10框轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。如此處使用的“驅(qū)動(dòng)表達(dá)”指啟動(dòng)(promote)核酸的轉(zhuǎn)錄。如此處使用的“調(diào)節(jié)表達(dá)”指影響核酸轉(zhuǎn)錄的水平、時(shí)間或位置。本發(fā)明的啟動(dòng)子可因此用來增強(qiáng)、降低或改變核酸轉(zhuǎn)錄的時(shí)間和/或位置。例如，其可用來將轉(zhuǎn)錄限至某些細(xì)胞類型、組織或器官，或在某段時(shí)間內(nèi)，或響應(yīng)某些環(huán)境條件。啟動(dòng)子優(yōu)選植物-可表達(dá)的啟動(dòng)子。術(shù)語“植物-可表達(dá)的”指能在植物、植物細(xì)胞、植物組織和/或植物器官中調(diào)節(jié)表達(dá)。因此，本發(fā)明包含如上述的分離核酸，能調(diào)節(jié)有效連接的核酸在植物或植物的一種或多種特定細(xì)胞、組織或器官中的轉(zhuǎn)錄。詳細(xì)研究本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)其中許多是組織特異性的。因此，本發(fā)明提供“組織特異性的”啟動(dòng)子。術(shù)語“組織特異性的”將被用于表明表達(dá)主要在特定組織、 組織-類型、器官或生物體的任何其他部分中，雖然不一定是專門在所述組織、組織-類型、 器官或其他部分中。因此，本發(fā)明包含如上述的分離核酸，能以組織特異性方式驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)表達(dá)(有效連接的核酸的)。表達(dá)可在種子、胚、盾片、糊粉、胚乳、葉片、花、愈傷組織、 分生組織、芽分生組織、分化中心(discriminating centre)、芽、芽分生組織和根中得到驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)。禾本科植物中芽分生組織位于所謂的分化中心(discrimination zone),從中牙和葉片發(fā)生。組織特異性啟動(dòng)子是所謂的“受調(diào)控的啟動(dòng)子”的一種實(shí)例。這些啟動(dòng)子通過內(nèi)源信號(hào)如某些轉(zhuǎn)錄因子、代謝物、植物生長(zhǎng)素的存在或外源信號(hào)如變老、應(yīng)激或營(yíng)養(yǎng)狀況而得到調(diào)控。這些調(diào)控可影響一個(gè)或多個(gè)不同水平的上述時(shí)空特異性。本發(fā)明中包含的為上文所述的核酸，其為“受調(diào)控的啟動(dòng)子”。受調(diào)控的啟動(dòng)子的實(shí)例有細(xì)胞-特異性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、器官-特異性啟動(dòng)子、細(xì)胞周期-特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或早期的組織特異性啟動(dòng)子。做為選擇和/或另外，本發(fā)明的一些啟動(dòng)子顯示組成型表達(dá)的模式。因此，本發(fā)明提供上文所述的啟動(dòng)子，其為組成型啟動(dòng)子。術(shù)語“組成型的”指沒有或幾乎沒有時(shí)空的調(diào)節(jié)。如此處使用的術(shù)語“組成型表達(dá)”指基本在生物體的所有組織中基本上連續(xù)的表達(dá)。熟練技術(shù)人員將理解“組成型啟動(dòng)子”為在生物體生長(zhǎng)發(fā)育幾乎但未必所有的時(shí)期以及遍及生物體幾乎但未必所有的部分中都有活性的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的“表達(dá)模式”不僅受時(shí)空方面的影響，還受表達(dá)水平的影響。表達(dá)水平通過所謂的啟動(dòng)子的“強(qiáng)度”確定?；谒玫降谋磉_(dá)水平，此處可在“弱”或“強(qiáng)”啟動(dòng)子間作出區(qū)分。通常，“弱啟動(dòng)子”指啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)有效連接的核酸以約1/10000轉(zhuǎn)錄本至約 1/100000轉(zhuǎn)錄本至約1/500000轉(zhuǎn)錄本的水平表達(dá)。通常，“強(qiáng)啟動(dòng)子”指啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)有效連接的核酸以約1/10轉(zhuǎn)錄本或至約1/100或至約1/1000轉(zhuǎn)錄本的水平表達(dá)。根據(jù)一具體的實(shí)施方案，本發(fā)明提供上文提及的分離啟動(dòng)子，其為雜合啟動(dòng)子。如此處使用的術(shù)語“雜合啟動(dòng)子”指例如通過遺傳工程合成制得的嵌合啟動(dòng)子。本發(fā)明優(yōu)選的雜合啟動(dòng)子包括本發(fā)明一種啟動(dòng)子的一部分，優(yōu)選功能部分以及其他啟動(dòng)子的至少另一部分，優(yōu)選功能部分。后面的部分，可以是任何啟動(dòng)子的部分，包括本發(fā)明的啟動(dòng)子及其他啟動(dòng)子的任何一個(gè)。雜合啟動(dòng)子的實(shí)例包括與另一啟動(dòng)子的最小啟動(dòng)子組合的本發(fā)明啟動(dòng)子的調(diào)控元件。雜合啟動(dòng)子的另一個(gè)實(shí)例為包括另外的調(diào)控元件以進(jìn)一步增強(qiáng)其活性和/ 或改變其時(shí)空表達(dá)模式的啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供用于改變啟動(dòng)子表達(dá)模式的SEQ ID NO I至22任一的或其變體的功能性片段的用途。在所述方法中，本發(fā)明任意核酸的至少一部分與另外的啟動(dòng)子的至少一個(gè)片段組合。此外，本發(fā)明提供遺傳構(gòu)建體，包含(a)如上定義的分離的啟動(dòng)子(b)與(a)的分離啟動(dòng)子有效連接的異源核酸序列，和任選的(C) 3’轉(zhuǎn)錄終止子如此處使用的術(shù)語“遺傳構(gòu)建體”指通過遺傳工程制得的核酸。如此處使用的術(shù)語“有效連接”至啟動(dòng)子指轉(zhuǎn)錄通過該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解與啟動(dòng)子有效連接優(yōu)選指啟動(dòng)子位于該有效連接的核酸的上游(即在5'-末端)。只要本發(fā)明的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)該有效連接的核酸的轉(zhuǎn)錄，與有效連接的核酸的距離是可變的。例如，在啟動(dòng)子和該有效連接的核酸間，可能有克隆位點(diǎn)、 接頭、轉(zhuǎn)錄或翻譯增強(qiáng)子。該有效連接的核酸可以是任何編碼或非編碼的核酸。該有效連接的核酸可以是有義或反義方向的。一般在宿主細(xì)胞的遺傳工程情況下，該有效連接的核酸被導(dǎo)入宿主細(xì)胞且用來改變宿主細(xì)胞的表型?；蛘?，該有效連接的核酸為來自宿主細(xì)胞的內(nèi)源核酸。如此處使用的術(shù)語“異源的”指“與本發(fā)明啟動(dòng)子異源的”。與本發(fā)明的啟動(dòng)子異源的核酸當(dāng)在其生物基因組環(huán)境中時(shí)并不天然存在于本發(fā)明啟動(dòng)子側(cè)翼的核酸序列中。雖然該核酸可以是與本發(fā)明的啟動(dòng)子異源的，其可以是與植物宿主細(xì)胞同源的或天然的或異源的或外源的。該異源的有效連接的核酸可以是任何核酸(例如編碼任何蛋白質(zhì))，條件是其包括或其至少與一種正常情況下不位于本發(fā)明啟動(dòng)子側(cè)翼的核酸側(cè)接。(c)中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)錄終止子”指其給出轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的轉(zhuǎn)錄單元末端的DNA序列。終止子為通常包含聚腺苷酸化信號(hào)的3'-非翻譯DNA序列，其促進(jìn)聚腺苷酸序列加至初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的V -末端。在和/或分離自病毒、酵母、霉菌、細(xì)菌、昆蟲、禽類、哺乳動(dòng)物和植物中有活性的終止子是已知的且已在文獻(xiàn)中描述過。適用于本發(fā)明遺傳構(gòu)建體的終止子的實(shí)例包含根癌土壤桿菌(Agroba cterium tumefaciens)胭脂堿合酶(NOS)基因終止子、根癌土壤桿菌章魚堿合酶(OCS)基因終止子序列、花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S基因終止子序列、稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶終止子序列(t 3' Bt2)、玉米的玉米蛋白基因終止子序列、rbcs-lA基因終止子和rbcs-3A基因終止子序列等等。本發(fā)明還提供包含如上所述遺傳構(gòu)建體的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)化載體或植物表達(dá)載體。此處“表達(dá)盒”指核酸表達(dá)所需的最小遺傳構(gòu)建體。一般的表達(dá)盒包括啟動(dòng)子-基因-終止子組合。表達(dá)盒可另外包括克隆位點(diǎn)，例如Gateway TM重組位點(diǎn)或限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)以方便有效連接的核酸的克隆或方便表達(dá)盒轉(zhuǎn)入載體。表達(dá)盒可進(jìn)一步包括5’ 非翻譯區(qū)、3’非翻譯區(qū)、篩選標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子?！稗D(zhuǎn)化載體”指遺傳構(gòu)建體，其可通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入生物體且可在所述生物體中穩(wěn)定維持。一些載體可在例如大腸桿菌、A. tumefaciens、釀酒酵母或粟酒裂殖糖酵母中維持，而其它的如噬粒和粘粒載體可在細(xì)菌和/或病毒中維持。轉(zhuǎn)化載體可在其宿主細(xì)胞中增殖且可再次從中分離而轉(zhuǎn)化至另一宿主細(xì)胞。載體序列通常包括一組限制性內(nèi)切酶識(shí)別的唯一位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)(MCS)，其中可插入一個(gè)或多個(gè)非載體序列。載體序列可進(jìn)一步包括一復(fù)制起點(diǎn)，其為在特定宿主細(xì)胞中維持和/或復(fù)制所必需的。復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例包含但不限于， fΙ-ori和 colElο“表達(dá)載體”構(gòu)成轉(zhuǎn)化載體的亞群，其由于包含適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，能啟動(dòng)插入的非載體序列的表達(dá)。已記載適于在細(xì)菌(例如大腸桿菌)、真菌(例如啤酒酵母、粟酒裂殖糖酵母、巴斯德畢赤氏酵母)、昆蟲細(xì)胞(例如桿狀病毒表達(dá)載體)、動(dòng)物細(xì)胞(例如COS或 CHO細(xì)胞)和植物細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體。本發(fā)明的一種合適的表達(dá)載體為植物表達(dá)載體， 用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、植物基因組中的穩(wěn)定整合、植物細(xì)胞內(nèi)的維持和植物細(xì)胞中非載體序列的表達(dá)。一般地，本發(fā)明的植物表達(dá)載體包括上文所述的SEQ ID NO I至22任一核酸或其變體，其任意與另外的核酸有效連接。一般地，本發(fā)明的植物可表達(dá)的載體進(jìn)一步包括用于穩(wěn)定整合入植物基因組的T-DNA區(qū)域(例如Ti質(zhì)粒的左側(cè)邊界和右側(cè)邊界區(qū)域)。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可進(jìn)一步包括“篩選標(biāo)記”。如此處使用的，術(shù)語"篩選標(biāo)記"包含任何基因，其賦予細(xì)胞表型，在其中得到表達(dá)以便于轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的鑒定和/或選擇。合適的標(biāo)記可選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記。包含該遺傳構(gòu)建體的細(xì)胞因此將在殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗生素或除草劑濃度下存活。篩選標(biāo)記基因的實(shí)例包含賦予抗生素抗性的基因(如編碼能磷酸化新霉素和卡那霉素的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的nptll，或編碼能磷酸化潮霉素的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的hpt)、賦予除草劑抗性的基因(例如bar，其提供Basta的抗性；提供草甘膦抗性的aroA或gox)，或提供代謝作用特性的基因(如允許植物利用甘露糖作為單獨(dú)碳源的manA)?？梢姷臉?biāo)記基因引起顏色的生成(例如β _葡糖醛酸酶，GUS)、發(fā)光(如螢光素酶)或產(chǎn)生熒光(綠色熒光蛋白，GFP和其衍生物)。合適篩選標(biāo)記基因進(jìn)一步的實(shí)例包括氨芐青霉素抗性(Ampr)、四環(huán)素抗性基因(Ter)、細(xì)菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、膦絲菌素抗性基因和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因，等等。此外,本發(fā)明包括包含本發(fā)明上文所述的分離的啟動(dòng)子,或遺傳構(gòu)建體,或表達(dá)盒，或轉(zhuǎn)化載體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、 藻類、真菌、酵母、植物、昆蟲或動(dòng)物宿主細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的分離的啟動(dòng)子，或本發(fā)明上述的分離的核酸，或遺傳構(gòu)建體，或表達(dá)盒，或轉(zhuǎn)化載體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。上述植物細(xì)胞優(yōu)選為雙子葉植物植物細(xì)胞或單子葉植物植物細(xì)胞，更優(yōu)選此處提及的任何植物的細(xì)胞。優(yōu)選地，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中，本發(fā)明的啟動(dòng)子或遺傳構(gòu)建體穩(wěn)定整合入該植物細(xì)胞的基因組中。本發(fā)明還提供用于轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的方法，包括
(a)將分離的啟動(dòng)子導(dǎo)入植物細(xì)胞，例如根據(jù)本發(fā)明的以及上文所述的SEQ ID NO I至SEQ ID NO 22的任意一個(gè)，或其變體或片段，或遺傳構(gòu)建體，或表達(dá)盒，或轉(zhuǎn)化載體或表達(dá)載體，和(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)上述植物細(xì)胞。優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化完成“導(dǎo)入”上述分離的啟動(dòng)子，或遺傳構(gòu)建體，或表達(dá)盒，或轉(zhuǎn)化載體或表達(dá)載體至宿主細(xì)胞中(例如植物細(xì)胞)。如此處使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包含外源多核苷酸轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，而不考慮用于轉(zhuǎn)入的方法。尤其對(duì)于能無性繁殖的植物、組織，無論通過器官發(fā)生或胚胎發(fā)生，都適于用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化且可從中再生完整的植株。所選的特定組織將隨對(duì)轉(zhuǎn)化的特定植物品種有效的且適合其的無性繁殖系統(tǒng)而不同。典型的靶組織包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、愈傷組織、存在的分生組織(例如，頂端分生組織、腋芽和根分生組織)和可誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。該多核苷酸可瞬時(shí)或穩(wěn)定地導(dǎo)入植物細(xì)胞以及可以非整合地維持，例如以質(zhì)粒的形式?；蛘撸淇梢哉先胫参锘蚪M。植物品種的轉(zhuǎn)化目前是相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。方便地，一些轉(zhuǎn)化方法中任何一個(gè)都可用來將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入合適的祖細(xì)胞(ancestor cell)。轉(zhuǎn)化方法包括利用脂質(zhì)體、電穿孔法、增強(qiáng)游離DNA攝取的化學(xué)試劑、DNA直接注射入植物、基因槍轟擊、利用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化以及顯微投影。方法可選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.等， 1882，Nature 296,72-74 ；NegrutiuI.等，June 1987，Plant Mol. Biol. 8,363-373);原生質(zhì)體的電穿孔(Shillito R.D.等，1985Bio/Technol 3,1099-1102);微注射入植物材料 (Crossway A.等，1986，Mol. Gen Genet 202,179-185) ;DNA 或 RNA 包被顆粒的轟擊(Klein T. Μ.等，1987，Nature 327,70);病毒的感染(非-整合的)等等。生產(chǎn)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法為土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。包括本發(fā)明任一啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因稻植物優(yōu)選利用任何熟知的稻轉(zhuǎn)化的方法通過土壤桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生，如以下所述的任何方法公開的歐洲專利申請(qǐng) EP1198985A1, Aldemita 和 Hodges(Planta，199，612-617，1996) ；Chan 等· (Plant Mol. Biol. 22 (3) 491-506,1993) ；Hiei 等· (Plant J. 6 (2) 271-282，1994);其公開的內(nèi)容就如充分陳述一樣此處引入作為參考。至于玉米的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選的方法如Ishida等.(Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14 (6) :745-50)或 Frame 等.(Plant Physiol. 2002 May ； 129 (I) 13-22)所述，其公開的內(nèi)容就如充分陳述一樣此處引入作為參考。通常在轉(zhuǎn)化后，選擇具有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的植物細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，其由用目的基因共轉(zhuǎn)染的植物可表達(dá)的基因編碼(其可受本發(fā)明任何啟動(dòng)子控制)，隨之在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的材料。得到的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞隨后可用于以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式再生轉(zhuǎn)化植株。因此，上文所述的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法可進(jìn)一步包括從上述(a)的植物細(xì)胞再生植株。本發(fā)明進(jìn)一步提供包括上文所述植物細(xì)胞的植物。該植物可生長(zhǎng)，或甚至達(dá)到成熟包括例如果實(shí)產(chǎn)生、種子形成、種子成熟和結(jié)籽。此外，可從這些種子生產(chǎn)子代，其子代是可育的。做為選擇或另外，轉(zhuǎn)化的和再生的植物也可以通過無性繁殖如克隆、嫁接產(chǎn)生子代。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可通過多種方式繁殖， 如通過無性繁殖或傳統(tǒng)的育種技術(shù)。例如，第一代(或Tl)轉(zhuǎn)化的植物可自花授精以得到純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，而T2植株進(jìn)一步通過傳統(tǒng)的育種技術(shù)繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可有多種形式。例如，其可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；無性轉(zhuǎn)化體(例如，所有細(xì)胞被轉(zhuǎn)化以包含表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化組織的嫁接物(例如，在植株中，轉(zhuǎn)化的根莖嫁接至未轉(zhuǎn)化的接穗)。隨著DNA的轉(zhuǎn)入和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長(zhǎng),可利用例如Southern分析對(duì)推定的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物進(jìn)行目的基因存在、拷貝數(shù)和/或基因組結(jié)構(gòu)的評(píng)估。做為選擇或另外，新近導(dǎo)入的DNA的表達(dá)水平或表達(dá)模式可利用Northern和/或Western分析進(jìn)行,兩種技術(shù)均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明顯然涉及通過本發(fā)明的任何方法可獲得的植物，其含有任何本發(fā)明分離的啟動(dòng)子或構(gòu)建體。本發(fā)明顯然涉及上述植物的任何植株部分和繁殖體。本發(fā)明進(jìn)一步包含通過任何上述方法產(chǎn)生的原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織、器官或整株植物的子代，唯一條件是子代表現(xiàn)出與通過本發(fā)明方法在親代中產(chǎn)生的相同的基因型和/或表型特征。本發(fā)明還涉及植物可收獲的部分，如但不限于種子、葉片、果實(shí)、花、莖干培養(yǎng)物、莖、根狀莖、根、塊莖、鱗莖和棉纖維。如此處使用的術(shù)語“植物”包括整株植物、植物的原代和子代以及植物部分，包括種子、芽、莖、根(包括塊莖)和植物細(xì)胞、組織和器官。因此術(shù)語“植物”還包含懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、配子體、孢子體、花粉和小孢子。在本發(fā)明方法中特別有用的植物包括屬于綠色植物(Viridiplantae)總科的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括飼料或草料豆科、觀賞植物、糧食作物、樹木、或灌木，選自金合歡屬(Acacia spp·)、械屬(Acer spp·)、稱猴桃屬(Actinidia spp.)、七葉樹屬(Aesculus spp·)、新西蘭貝殼杉(Agathis australis)、Albiziaamara、Alsophila tricolor、須芒草屬(Andropogon spp·)、落花生屬(Arachis spp·)、模榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、Baikiaea pluri juga、樣木屬(Betula spp.)、蕓苔屬 (Brassica spp.)、木攬(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、Butea frondosa、 Cadaba farinosa、朱綴花屬(Cal liandra spp、)、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬(Capsicum spp.)、決明屬(Cassia spp. )、Centroema pubescens、木瓜屬(ChaenomeIes spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、 Colophospermum mopane、繡球小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂屬(Crataegus spp.)、香瓜屬(Cucumis spp.)、柏木屬(Cupressus spp. )、Cyathea dealbata、媼梓(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅屬 (Cymbopogon spp. ) >Cynthea dealbata、媼梓(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、 Davallia divaricata、山蟲馬蟲皇屬(Desmodium spp. )、Dicksonia squarosa>Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、鍵扁丑屬(Dolichos spp. ) > Dorycnium rectum、Echinochloa Pyramidalis> Ehrartia spp.、 (Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、刺桐屬 (Erythrina spp.)、按屬(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、養(yǎng)麥屬(Fagopyrum spp·)、南美穩(wěn)(Feijoa sellowiana)、草莓屬(Fragaria spp·)、千斤拔屬(Flemingia spp)、Freycinet ia banksii、Geranium thunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀禪屬(Grevillea spp. )、Guibourtia coleosperma、巖黃甚屬(Hedysarum spp·)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、紅荀茅(Hyparrhenia rufa)、小連翅(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、Indigo incamata、鸞尾屬(Iris spp.)、Leptarrhena Pyrolifolia、古月枝子屬(Lespediza spp.)、 Lettuca spp.、銀合歡(Leucaena leucocephala)、Loudetia simp I ex Λ Lotonus bainesii、 百脈根屬(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、蘋果屬(Malus spp·)、木薯(Man i hot esculenta)、紫苜猜(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉 (Musa sapientum)、煙草屬(Nicotianum spp.)、馬戶食草屬(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻屬(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬(Pennisetum spp. )、Persea gratissima、碧冬煎屬(Petunia spp.)、菜豆屬(Phaseolus spp.)、Phoenix canariensis、 Phormium cookianum、石楠屬(Photinia spp.)、Picea glauca、松屬(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、 Pogonarthria squarrosa、楊屬(Populus spp.)、瓜葉牧豆樹(Prosopi scineraria)、花方萁松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬 (Quercus spp. )、Rhaphiolepsis umbellata、Rhopalosylis sapida、Rhus natalensis、歐洲醋栗(Ribes grossularia)、荼第子屬(Ribes spp·)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、 薔薇屬(Rosa spp.)、懸鉤子屬(Rubus spp.)、柳屬(Salix spp. )、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高梁(Sorghum bicolor)、菠菜屬(spinacia spp·)、 sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶屬 (Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、車軸草屬(Trifolium spp·)、小麥屬(Triticum spp·)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、 越桔屬(Vaccinium spp·)、野豌豆屬(Vicia spp·)、葡萄(Vitis vinifera) > Watsonia pyramidata、馬蹄蓮(Zantedesc hia aethiopica)、玉蜀泰(Zea mays)、覓屬(amaranth)、 朝鮮薊、蘆筍、莖椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、蕓苔、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)綠葉菜、亞麻、 散葉甘藍(lán)、小扁豆、含油種子油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、稻草、糖用甜菜、糖甘鹿、向日葵、番茄、南瓜和茶、樹木和藻等等。按照本發(fā)明的優(yōu)選特征，植物為農(nóng)作物植物如大豆、 向日葵、蕓苔、紫花苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯、煙草、南瓜、番木瓜、白楊、豆科、亞麻、 羽扇豆屬或高粱。按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案，植物為單子葉植物，如甘蔗，進(jìn)一步優(yōu)選谷類如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥或燕麥。本發(fā)明進(jìn)一步提供在植物或植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的方法，包括(a)將核酸有效連接至上文所述的本發(fā)明的分離核酸，如連接至SEQ ID NO I至 22的任意一個(gè)或其變體或片段，和(b)將得到的遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入植物或植物細(xì)胞中。優(yōu)選(a)的有效連接的核酸與本發(fā)明核酸是異源的。該方法可進(jìn)一步包括在促進(jìn)生長(zhǎng)、促進(jìn)再生和/或促進(jìn)成熟的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞。此外，該有效連接的核酸的表達(dá)可以在植物特定的細(xì)胞、組織或器官中得到驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明提供如上所述的方法，其中表達(dá)是組成型表達(dá)或組織特異性表達(dá)。對(duì)于這些實(shí)施方案，參見實(shí)施例部分，其中描述本發(fā)明啟動(dòng)子特定表達(dá)模式且詳述了組織特異性表達(dá)的不同類型。本發(fā)明進(jìn)一步包含上文定義的分離核酸驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)有效連接的核酸表達(dá)的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到序列SEQ ID NO I至22的提供使得很容易獲得分離相關(guān)啟動(dòng)子的工具，其具有與任意SEQ ID NO I至22基本序列同一性。另外，序列SEQ ID NO 23至44 (對(duì)應(yīng)于本發(fā)明啟動(dòng)子的CDS，參見表I)的提供使得很容易獲得分離相關(guān)啟動(dòng)子的有效工具，其中該相關(guān)⑶S具有與任意SEQ ID NO 23至44基本序列同一性。因此本發(fā)明還包含分離能驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)有效連接的核酸表達(dá)的核酸的方法，包括篩選核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)以找到任意SEQ ID NO I至22或SEQ ID NO 23至44所示序列的同源物。隨后這些同源物用來篩選基因組DNA文庫(kù)，其文庫(kù)例如從上述同源物來源的生物體制得。篩選過程可例如包括雜交。隨后，分析與該同源物匹配的基因組DNA以鑒定與同源物對(duì)應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和翻譯起始位點(diǎn)。最后，設(shè)計(jì)針對(duì)位于上述翻譯起始位點(diǎn)上游區(qū)域(在5’末端) 的核酸擴(kuò)增的特異引物。本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)蛋白的鑒定，其涉及本發(fā)明啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)。所述鑒定可利用酵母單-雜交系統(tǒng)完成。在所述酵母單-雜交系統(tǒng)中，SEQ ID NO I至22的任意一個(gè)序列與GAL轉(zhuǎn)錄激活子有效連接且轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞培養(yǎng)物。酵母細(xì)胞培養(yǎng)物用編碼候選調(diào)節(jié)因子的構(gòu)建體文庫(kù)再次轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)在將參照以下圖例描述本發(fā)明，其中圖I顯示啟動(dòng)子的一般圖示。調(diào)控元件為那些例如決定啟動(dòng)子活性的專一和/或時(shí)序調(diào)節(jié)的序列。最小啟動(dòng)子為必需和足以啟動(dòng)表達(dá)的最小序列。包括TATA框，其為正確引導(dǎo)核糖核酸聚合酶II至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)所必需的。轉(zhuǎn)錄起始元件(INR)包括轉(zhuǎn)錄起始開始位點(diǎn)。5’非翻譯區(qū)(5’UTR)指轉(zhuǎn)錄進(jìn)入前-信使RNA以及最終進(jìn)入mRNA，但不翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域。翻譯起始密碼子由起始密碼子ATG表示。圖2為用于在β -葡糖醛酸酶(GUS)基因受本發(fā)明任一啟動(dòng)子控制下的植物中表達(dá)的載體Ρ4581的圖譜。該雙元載體包括Gateway重組盒,適于本發(fā)明任意啟動(dòng)子在大腸桿菌葡糖醛酸酶(GUS)基因前的重組克隆。該盒包含氯霉素抗性基因(CamR)和用于非-重組質(zhì)粒反向選擇的ccdB自殺基因。該⑶S表達(dá)盒進(jìn)一步包括雙終止子序列T-zein 和T-rbcS-deltaGA。該表達(dá)盒位于胭脂堿Ti質(zhì)粒的左側(cè)邊界內(nèi)(LB重復(fù)，LB Ti C58)和右側(cè)邊界內(nèi)(RB重復(fù)，RB Ti C58)。克隆在該邊界內(nèi)的還有在組成型啟動(dòng)子和終止子序列的控制下的可選擇標(biāo)記和可篩選標(biāo)記基因。該載體還包含細(xì)菌復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)(PBR322) 和細(xì)菌可選擇的細(xì)菌篩選標(biāo)記(Spe/SmeR)。下圖顯示用攜帶與報(bào)告基因⑶S有效連接的本發(fā)明啟動(dòng)子的報(bào)告載體p4581轉(zhuǎn)化的植物或植物部分的GUS染色結(jié)果。標(biāo)志為“C植株”的植物是長(zhǎng)至約5cm的轉(zhuǎn)基因植物； 標(biāo)志為“B植株”的植物是長(zhǎng)至約IOcm的；而標(biāo)志為"A植株"的植物是長(zhǎng)至成熟的。這些A植株用來收集來自老葉、新葉和種子的不同組織樣品。圖3顯示PROO110 (RCc3，SEQ ID NO I)的表達(dá)模式。在根中可見⑶S染色。圖4顯示PR00005(推定的β -淀粉酶，SEQ ID NO 2)的表達(dá)模式。在種子中可見GUS染色，更準(zhǔn)確地是在胚或胚的盾片中。圖5顯示PR00009(推定的纖維素合成酶，SEQ ID NO 3)的表達(dá)模式。在根中可
14見⑶S染色。圖6顯示PR00058(蛋白酶抑制因子Rgpi9，SEQ ID NO 4)的表達(dá)模式。在種子中可見⑶S染色。圖7顯示PR00061(P棒曲霉素EXPB9，SEQ ID NO 5)的表達(dá)模式。在A植株⑷ 的早期花和在B植株⑶以及C植株(C)其他早期增殖的組織中可見GUS染色。圖8顯示PR00063(推定的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，SEQ ID NO 6)的表達(dá)模式。在早期組織中可見⑶S染色，例如在“A植株”的愈傷組織(A)或老葉、新葉和種子(B)中。圖9顯示PR00081(推定的咖啡酰輔酶A3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶，SEQ ID NO 7)的表達(dá)模式。在早期組織，尤其是芽中可見GUS染色。

圖10顯示PR00091 (醇溶谷蛋白R(shí)P5，SEQ ID NO 8)的表達(dá)模式。在種子(A)，尤其在胚乳，和分生組織(B)中可見⑶S染色。圖11顯示PR00095(推定的氨肽酶，SEQ ID NO 9)的表達(dá)模式。在種子，更具體在胚中可見GUS染色。圖12顯示PR00111(uclacyanin3-樣蛋白質(zhì)，SEQ ID NO 10)的表達(dá)模式。在根和分生組織中可見⑶S染色。圖13顯示PR00116(26S蛋白酶體調(diào)控粒子非-ATPase亞單位11，SEQ ID NO 11) 的表達(dá)模式。在整個(gè)植株(弱組成型)中微弱可見⑶S染色且在分生組織中尤其明顯。圖14顯示PR00117(推定的40S核糖體蛋白，SEQ ID NO 12)的表達(dá)模式。在種子，更具體在胚乳中可見GUS染色。圖15顯示PROO122 (葉綠素a/b_結(jié)合蛋白前體(Cab27)，SEQ ID NO 13)的表達(dá)模式。在芽中可見⑶S染色。圖16顯示PR00123(推定的原葉綠素酸酯還原酶，SEQ ID NO 14)的表達(dá)模式。在芽(地上組織)中可見⑶S染色。圖17顯示PR00133(殼多糖酶Cht-3，SEQ ID NO 15)的表達(dá)模式。在根莖和分生組織中可見⑶S染色。圖18顯示PR00151(WSI18，SEQ ID NO 16)的表達(dá)模式。在胼胝體和上部的植株部分(A)以及糊粉層和胚(B)中可見GUS染色。圖19顯示PR00169(水通道蛋白，SEQ ID NO 17)的表達(dá)模式。在整個(gè)植株(組成型表達(dá))中可見⑶S染色。圖20顯示PR00170(高遷移率組蛋白，SEQ ID NO 18)的表達(dá)模式。在由“B植株”(A)例解的整個(gè)植株，和各種組織如老葉、新葉和種子(B)以及愈傷組織(C)(組成型表達(dá))中強(qiáng)烈可見GUS染色。圖21顯示PR00171(可逆糖基化蛋白R(shí)GP1，SEQ ID NO 19)的表達(dá)模式。在所有植株部分(組成型表達(dá))可見⑶S染色。圖22顯示PROO173 (胞質(zhì)MDH，SEQ ID NO 20)的表達(dá)模式。在所有植株部分且尤其在芽(地上組織)和種子中可見⑶S染色。圖23顯示PROO175 (RAB21，SEQ ID NO 21)的表達(dá)模式。在愈傷組織(A)、分生組織和新葉中微弱可見GUS染色，而在正發(fā)育和成熟的種子(B)中，更具體在胚中強(qiáng)烈可見 ⑶S染色。
圖24顯示PR00177(Cdc2-l，SEQ ID NO 22)的表達(dá)模式。在分生組織和葉片中微弱可見⑶S染色。
實(shí)施例本發(fā)明的啟動(dòng)子作為來自各種稻基因翻譯起始密碼子(即第一個(gè)ATG，其密碼子被排除)上游跨度約I. 2kb序列的DNA區(qū)域而被分離。為了測(cè)定其核酸序列和表達(dá)模式， 進(jìn)行以下程序首先對(duì)基因組稻序列進(jìn)行in Silico研究。然而，基于自動(dòng)化預(yù)測(cè)程序以定位啟動(dòng)子-樣核酸序列的程序是非常容易出錯(cuò)的，即使是對(duì)最易-鑒定的啟動(dòng)子調(diào)控元件的定位，如TATA框和轉(zhuǎn)錄起始元件(INR)。還有,表達(dá)模式的in silico測(cè)定是極其投機(jī)性的。因此，為獲得有關(guān)啟動(dòng)子核酸序列和表達(dá)模式的明確數(shù)據(jù)，進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，包含(i)啟動(dòng)子核酸序列的分離；(ii)將報(bào)告基因有效連接至該啟動(dòng)子且將得到的遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入宿主生物體；(iii)在允許報(bào)告基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和(iv)測(cè)定宿主生物體的不同組織中報(bào)告基因的活性。這些方法將更詳細(xì)地得到描述。實(shí)施例I.啟動(dòng)子的鑒定和分離稻EST的鑒定，對(duì)應(yīng)的基因和其在稻基因組中的定位對(duì)包括稻序列的序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索稻表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。隨后進(jìn)行“in silico” 的Northern-blot以鑒定強(qiáng)烈表達(dá)或?qū)μ囟ㄆ鞴偬禺惖腅ST家族。該分析包括從不同植物器官分離的EST數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)化。選擇在源cDNA文庫(kù)中具有目的分布狀態(tài)的EST家族用于進(jìn)一步的分析和序列同源性檢索。在序列同源性檢索結(jié)合搜索科研數(shù)據(jù)后，對(duì)應(yīng)于EST家族的基因從序列數(shù)據(jù)庫(kù)中得到鑒定并且給出功能(推定的)和相應(yīng)的基因名稱(參見表I)。 隨后，相應(yīng)啟動(dòng)子區(qū)域通過以下方法分離。在第一個(gè)步驟中，檢索TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)以得到對(duì)應(yīng) EST家族的假定的重疊群。利用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算機(jī)程序得到序列同源性，如使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(一般， 開放缺口的G值=5，延伸缺口的E值=2，在運(yùn)行的blast部分錯(cuò)配的q罰分=-3，在運(yùn)行的blast部分匹配的r獎(jiǎng)分=1，e期望值=10.0，W字符長(zhǎng)度=11，v —行描述的數(shù)目 =100，b顯示序列比對(duì)的數(shù)目=100，矩陣=BL0SUM62)的Blast N。TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)(基因組研究機(jī)構(gòu))提供了假定的重疊群(TC)，其為基于構(gòu)建自所有已知EST、所有已知cDNA和改造的mRNA重疊群的序列預(yù)測(cè)。用來鑒定本發(fā)明啟動(dòng)子的TC在表I中表示。在第二個(gè)步驟中，TC用來將相應(yīng)基因定位至基因組序列上，其基因包括編碼區(qū)以及啟動(dòng)子區(qū)域。通常， 基因組序列為BAC克隆，此處通過其Genbank登錄號(hào)(參見表I)表示。從這些BAC克隆可確定啟動(dòng)子區(qū)域的序列同一性。表I :本發(fā)明的稻啟動(dòng)子列表。啟動(dòng)子序列在此通過其SEQ ID NO以及啟動(dòng)子編號(hào)(PRO)表示。由本發(fā)明啟動(dòng)子天然驅(qū)動(dòng)的編碼序列(CDS)通過其名稱、通過SEQ ID NO 以及通過TIGR數(shù)據(jù)庫(kù)的假定重疊群(TC)的登錄號(hào)表示。包含本發(fā)明啟動(dòng)子區(qū)域的基因組序列(BAC克隆或基因)通過其Genbank登錄號(hào)表示。啟動(dòng)子SEQ ID NO啟動(dòng)子編號(hào)CDS名稱CDS SEQ ID NOCDS TCBAC克隆 ?；蚧?IPR00110RCc 323TC89946AC0374262PR00005推定的P-淀粉酶24TC90358AC0224573PR00009推定的維素合酶25TC83635AC0224574PR00058蛋白酶抑制因子Rgp i 926TC83117AF0440595PR00061β棒曲霉素EXPB927TC89913AC0206666PR00063結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)28TC89985ΑΡ0012787PR00081推定的咖啡酰-輔酶A3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶29TC89891ΑΡ0003648PR00091醇溶谷蛋白R(shí)P530TC89670AF156714*9PR00095推定的曱破氨酸氣肽酶31TC89883AC02713310PR00111uclacyanin3-樣蛋白質(zhì)32TC90434AJ30766211PR0011626s蛋白酶體調(diào)控粒子非 -ATPase亞單位1133TC83072ΑΡ00096912PR00117推定的‘Os核糖體蛋白34TC90038AC09087113PR00122葉綠素a/b-結(jié)合蛋白前體 (Cab27)35TC82936ΑΡ00470014PR00123推定的原葉綠素酸酯還原酶36TC89839AL60645615PR00133殼多糖酶Cht-337TC85888D16223.16PR00151WSI1838TC84300ΑΡ00302317PR00169通道蛋白39TC89687ΑΡ00510818PR00170高遷移率組蛋白40TC89846ΑΡ00400419PR00171可逆糖基化蛋白R(shí)GPl41TC82935AC09087420PR00173胞質(zhì)MDH42TC82977AC03742521PR00175RAB2143TC83646Υ00842*22PR00177Cdc2-144TC90619ΑΡ004765稻基因啟動(dòng)子區(qū)域的鑒定和分離根據(jù)基因的序列情況以及其在稻基因組中的定位，基因的啟動(dòng)子區(qū)域作為翻譯起始密碼子(即第一個(gè)ATG，其密碼子被排除)上游跨度約I. 2kb的DNA區(qū)域而被分離。當(dāng)在基因的5’非翻譯區(qū)存在插入序列如內(nèi)含子時(shí)，該分離的DNA區(qū)域視為跨度約I. 2kb加上插入序列長(zhǎng)度的區(qū)域。通過利用特異引物的PCR從日本稻(Oryza Sativa Japonica)或偶爾從印度稻(Oryza Sativa Indica)的基因組DNA中分離啟動(dòng)子區(qū)域。這些特異引物包括 AttB重組位點(diǎn)，適于分離的啟動(dòng)子區(qū)域的重組克隆。這些特異引物在此以SEQ ID NO 45至 88表示且列于表2中。PCR條件如下94°C 2分鐘的I個(gè)循環(huán)，94°C I分鐘，58°C I分鐘和 680C 2分鐘的35個(gè)循環(huán)，以及68°C 5分鐘的I個(gè)循環(huán)。預(yù)期的PCR片段長(zhǎng)度也顯示在表 2中。相應(yīng)的PCR片段通過凝膠電泳以及隨后用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, Orange, California)的純化從PCR反應(yīng)混合物中純化。表2 :用于分離本發(fā)明稻啟動(dòng)子的引物和稻啟動(dòng)子區(qū)域長(zhǎng)度的概述。
權(quán)利要求
1.能驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)表達(dá)的分離的啟動(dòng)子，包含(a)SEQ ID NO I至22中任一項(xiàng)或與SEQ ID NO I至22任一項(xiàng)互補(bǔ)的分離核酸；或(b)與SEQID NO I至22任一項(xiàng)所示的任何DNA序列具有至少90%序列同一性的分離核酸；或(c)與SEQID NO I至22任一項(xiàng)的任何DNA序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下特異性雜交的分離核酸；或(d)(a)至(C)中任一項(xiàng)中定義的分離核酸，其通過插入序列而間斷；或(e)(a)至(d)中定義的任何核酸的片段，其片段能驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)表達(dá)。
2.權(quán)利要求I的啟動(dòng)子，其為包含權(quán)利要求I中定義的啟動(dòng)子的至少一部分以及啟動(dòng)子的其它部分的雜合啟動(dòng)子。
3.遺傳構(gòu)建體，包含(a)權(quán)利要求I或2中定義的分離的啟動(dòng)子；和(b)與(a)的所述啟動(dòng)子有效連接的異源核酸序列；和任選的(C) 3’轉(zhuǎn)錄終止子。
4.包含權(quán)利要求3定義的遺傳構(gòu)建體的表達(dá)盒。
5.包含權(quán)利要求3定義的遺傳構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化載體。
6.包含權(quán)利要求3定義的遺傳構(gòu)建體的表達(dá)載體。
7.包含權(quán)利要求I或2定義的分離的啟動(dòng)子，或權(quán)利要求3定義的遺傳構(gòu)建體，或權(quán)利要求4定義的表達(dá)盒，或權(quán)利要求5定義的轉(zhuǎn)化載體，或權(quán)利要求6定義的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，選自細(xì)菌、藻類、真菌、酵母、植物、昆蟲和動(dòng)物宿主細(xì)胞。
9.包含權(quán)利要求I或2定義的分離的啟動(dòng)子，或權(quán)利要求3定義的遺傳構(gòu)建體，或權(quán)利要求4定義的表達(dá)盒，或權(quán)利要求5定義的轉(zhuǎn)化載體，或權(quán)利要求6定義的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其為單子葉植物植物細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其為雙子葉植物植物細(xì)胞。
12.包含權(quán)利要求10或11定義的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。
13.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自稻、玉米、小麥、大麥、粟、燕麥、黑麥、高粱、大豆、向日葵、蕓苔、甘蔗、紫花苜蓿、豆、豌豆、亞麻、羽扇豆屬、油菜籽、煙草、番茄、馬鈴薯、南瓜、番木瓜、白楊和棉花。
14.權(quán)利要求13或14定義的植物的植物部分，優(yōu)選可收獲的部分，繁殖體或子代。
15.在植物或植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的方法，包括(a)將所述核酸有效連接至權(quán)利要求I定義的任一分離的核酸，和(b)將得到的遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入植物或植物細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的表達(dá)是組成型的或組織特異性的。
17.用于轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的方法，包括(a)將權(quán)利要求I或2定義的分離的啟動(dòng)子，或權(quán)利要求3定義的遺傳構(gòu)建體，或權(quán)利要求4定義的表達(dá)盒，或權(quán)利要求5定義的轉(zhuǎn)化載體，或權(quán)利要求6定義的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，和(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞。
18.權(quán)利要求I定義的任何分離核酸驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)有效連接的核酸表達(dá)的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了從稻分離的若干啟動(dòng)子，其能在植物中驅(qū)動(dòng)和/或調(diào)節(jié)有效連接的核酸的表達(dá)。已在稻中研究了本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)模式且一些啟動(dòng)子在植物特定的細(xì)胞、組織或器官中顯示特異的活性，而其它的在基本上整個(gè)植物中呈現(xiàn)組成型表達(dá)。一些啟動(dòng)子顯示弱表達(dá)，而其它的具有強(qiáng)活性。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102586251SQ201210062389
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2004年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月4日
發(fā)明者W·布羅克特, Y·哈茨費(fèi)爾特 申請(qǐng)人:作物培植股份有限公司