專利名稱：γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法
技術領域：
本發(fā)明屬于聚谷氨酸的生產方法，具體涉及一種Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產的新方法。
背景技術：
Y -聚谷氨酸(Poly-Y-glutamatic acid, Y-PGA),是一種由多種微生物產生的水溶性和可生物降解的聚氨基酸。聚谷氨酸是一種對人體和環(huán)境無毒害的新型天然高分子，其獨特的結構特性賦予高度吸水性、良好的滲透性、生物相容性和生物可降解性，廣泛應用于農業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品等許多領域，是一種公認的極有發(fā)展?jié)摿Φ木G色化學產品。 Y-聚谷氨酸的生產主要利用芽孢桿菌屬的一些菌株，直接發(fā)酵生產。相對以石油衍生品為基礎的聚合物，Y -聚谷氨酸合物能夠通過可再生原料合成，具有相當大的市場潛力。Y-PGA生產方法分為兩類一類是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加L-谷氨酸作為Y-PGA 合成的前體，由微生物吸收培養(yǎng)基中的谷氨酸，并利用其合成酶系將單體谷氨酸聚合產生 Y -PGA,即谷氨酸依賴性合成方法，例如專利CN1644677A所述的Y -PGA生產方法；另外一類是在發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加L-谷氨酸，有微生物直接將培養(yǎng)基中的糖質原料轉化為內源性谷氨酸，再由自身的合成酶系聚合產生Y-PGA，這稱為從頭合成，即谷氨酸非依賴性合成方法，也稱為從頭合成，例如專利CN 1932007A所述的Y -PGA生產方法。兩種生產方法中，Y -聚谷氨酸生產水平很大程度上受到培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的影響。許多研究已經(jīng)確定了生產Y-PGA的最佳培養(yǎng)基成分。通常使用的培養(yǎng)基包括碳源，氮源和無機鹽類，L-谷氨酸依賴性合成方法需要加入大量外源谷氨酸作為聚谷氨酸的前體。一般來說合適的碳源通常是葡萄糖，甘油，麥芽糖，檸檬酸，果糖，蔗糖，淀粉等，合適的氮源通常是氯化銨，硫酸銨，蛋白胨，酵母膏等。已有大量文獻報道了谷氨酸依賴性合成方法生產聚谷氨酸的方法，包括培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，間歇發(fā)酵和流加發(fā)酵方法，Y-PGA的提取分離方法等。流加發(fā)酵的方式包括流加糖類為細胞生長和聚合物合成提供能量(參見專利CN1556859A);流加L-谷氨酸前體增加聚谷氨酸產量。目前的發(fā)酵生產聚谷氨酸的方法中，培養(yǎng)基中需要添加谷氨酸作為前體導致了高的原料成本，成為工業(yè)化生產和應用的主要瓶頸之一。而不添加谷氨酸的發(fā)酵過程，只能產生低濃度的聚谷氨酸，過低的生產效率不適合工業(yè)化規(guī)模的生產。因此，通過開發(fā)新的發(fā)酵生產方法，以較為廉價的底物替代L-谷氨酸，生產高濃度的Y-聚谷氨酸，成為市場的新需求。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種Y -聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法，能夠以較為廉價的成本，生產高濃度的Y -聚谷氨酸。本發(fā)明方法所采用的技術方案包括如下步驟將芽孢桿菌屬微生物接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中，在有氧條件下培養(yǎng)，發(fā)酵過程中持續(xù)攪拌，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入草酸，使其產生Y-聚谷氨酸。草酸采用流加方式加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在補料分批發(fā)酵條件下培養(yǎng)芽孢桿菌屬微生物，使其產生Y-聚谷氨酸；當草酸濃度低于lg/L時，開始流加草酸溶液，使其維持到l_12g/L。其中芽孢桿菌屬微生物選自具有Y-聚谷氨酸合成能力的枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌中的任意一種，優(yōu)選枯草芽孢桿菌C10(Bacillus subtilis CIO)(保藏號 CGMCC No. 4924)或枯草芽孢桿菌 ZJU7 (Bacillus subtilis zju_7)(保藏號 CGMCC No. 1250)菌株。本方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基不包含谷氨酸。草酸可由草酸鹽代替。在補料分批發(fā)酵過程中機酸是以間歇流加的方式加入發(fā)酵培養(yǎng)基。向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加草酸的同時也可以流加氮源，使氮源濃度維持在I 10g/L，其中氮源選自氯化銨，硫酸銨、蛋白胨或酵母膏中的任意一種。本發(fā)明的方法中，草酸添加到培養(yǎng)基中，其作用是作為Y-PGA合成的刺激劑，刺激菌體細胞產生高濃度的Y-PGA，Y-PGA的前體谷氨酸來自于菌體自身合成，發(fā)酵過程中，草酸被菌體吸收并分解為二氧化碳。因此，該方法同時也為草酸或草酸鹽提供了一種新的用途。發(fā)酵培養(yǎng)基中除草酸之外的其他成分包括現(xiàn)有用于生產Y-聚谷氨酸的氮源、碳源和無機鹽。如使用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、淀粉作為碳源；使用氯化銨、硫酸銨、蛋白胨、 牛肉膏、酵母膏、玉米粉等作為氮源；也包括菌體生長所需的各種無機鹽如鐵鹽，鎂鹽，鉀鹽,鈣鹽,磷酸鹽。本發(fā)明所說的“草酸采用流加方式加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在補料分批發(fā)酵條件下培養(yǎng)芽孢桿菌屬微生物，使其產生Y -聚谷氨酸”是指在發(fā)酵過程中，不斷向培養(yǎng)基中加入草酸，使草酸的濃度維持在一定的范圍內，即不斷的對草酸進行補料?！伴g歇流加的方式”是指加入草酸的時候是時斷時續(xù)的加入或者不是以恒速加入。本發(fā)明和現(xiàn)有技術相比具有以下有益效果本發(fā)明方法使微生物持續(xù)產生高濃度Y -聚谷氨酸，而所使用的培養(yǎng)基中避免了添加昂貴的谷氨酸，合成所需要的底物為廉價糖質原料和草酸，具有成本優(yōu)勢。使用本發(fā)明的方法生產聚谷氨酸，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加草酸使其維持在一定的濃度范圍內，一方面避免了草酸對于菌體細胞的毒性和生長抑制作用，另一方面促使菌體持續(xù)不斷合成Y-PGA，顯著增加Y-PGA產量，其濃度最高可達到37. 5g/L。本發(fā)明的方法周期短，易于操作，可用于工業(yè)規(guī)模的生產。


圖I是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO在IOL發(fā)酵罐中添加草酸分批發(fā)酵過程曲線圖。圖2是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO在IOL發(fā)酵罐中補料分批發(fā)酵過程曲線圖(間歇流加草酸溶液)。圖3分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵的結果比較圖。
具體實施例方式以下結合說明書附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范
4
α -酮戊二酸延胡索酸
琥珀酸
13. 6 8. 2 12. 8 25. 3 11. 5 13. 6 15. 4 8. 2
3. 486
2.814
3.108 5. 958
2.319
3.221 3. 745 2. 172實施例I是在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO中一次性加入各種有機酸 (分批發(fā)酵方式)產生的Y-PGA產量，其中加入草酸的Y-PGA產量最高。實施例2實施例2與實施例I的區(qū)別在于步驟3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖80g/L，氯化銨18g/L，KH2P04 O. 5g/L， MgS04 · 7H20 O. 5g/L, FeC130. 05g/L, MnS04 · H20 0. lg/L, CaC120. I lg/L, pH 7。除上述組圍。實施例IY-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法，包括以下步驟步驟I)菌株活化將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO在平板上劃線, 37°C，培養(yǎng)12h。平板培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L，葡萄糖IOg/ L，瓊脂 15g/L，pH 7。步驟2)種子的制備將活化的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ClO菌種挑取接入液體種子培養(yǎng)基，裝液量為250ml三角瓶20ml培養(yǎng)基，37°C，200rpm (轉/分鐘)，振蕩培養(yǎng)12h。上述的種子培養(yǎng)基組成蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L,氯化鈉5g/L,葡萄糖10g/L, pH 7。步驟3)搖瓶發(fā)酵將制備好的種子液按5%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為 250ml三角瓶30ml培養(yǎng)基，37 °C，200rpm,振蕩培養(yǎng)36h。上述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖120g/L，氯化銨18g/L，KH2P04 5g/L，MgS04 ·7Η20 O. 5g/L,FeC13 0. 05g/L，MnS04 · H20 0. lg/L, CaC120. I lg/L, pH 7。除上述組分外，該發(fā)酵培養(yǎng)基中添加草酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、草酰乙酸、異檸檬酸、α -2 ‘酮戊二酸或延胡索酸中的任意一種，添加量為10g/L。步驟4)產物分離提取發(fā)酵結束后離心除去發(fā)酵液中的菌體，上清液中加入4倍體積甲醇，4°C放置lh，離心收集沉淀，冷凍干燥后得到白色γ-PGA。不同種類草酸對細胞生長和Y-PGA產量的影響見表I。實驗結果表明，添加10g/L草酸，產生最高濃度的Y-PGA，Y-PGA產量達到25. 3g/ L0表I草酸對細胞生長和Y -PGA產量的影響
草酸(10g/L)細胞干重(g/L)Y-PGA (g/L)
平果fe 梓檬酸草酸草酰乙異檸檬分外，該發(fā)酵培養(yǎng)基中另外添加草酸，取6種添加量(分別在6個實驗罐中)，添加量分別為 0g/L，5g/L，10g/L、12g/L、15g/L、20g/L。其余步驟特征都與實施例I相同。草酸添加量對細胞生長和Y -PGA產量的影響見表2。實驗結果表明，隨著加入草酸濃度的增加，產生的Y-PGA濃度增加，最終當加入 12g/L草酸的條件下，產生最高濃度的γ-PGA，達到27. lg/L，當草酸濃度超過15g/L時嚴重抑制了菌體的生長和Y -PGA產生。表3草酸添加量對聚谷氨酸產量的影響
權利要求
1.Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法，其特征在于，其過程如下將芽孢桿菌屬微生物接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中，在有氧條件下培養(yǎng)，發(fā)酵過程中持續(xù)攪拌；向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入草酸，使其產生Y-聚谷氨酸。
2.根據(jù)權利要求I所述的Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法，其特征在于，所述的草酸采用流加方式加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在補料分批發(fā)酵條件下培養(yǎng)芽孢桿菌屬微生物，使其產生Y-聚谷氨酸。
3.根據(jù)權利要求2所述的Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法，其特征在于，當草酸濃度低于lg/L時，開始流加草酸溶液，使其維持到l_12g/L。
4.根據(jù)權利要求3所述的Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法，其特征在于，所述的芽孢桿菌屬微生物選自枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌中的任意一種。
5.根據(jù)權利要求4所述的Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌選用枯草芽孢桿菌CIO (Bacillus subtilis CIO)(保藏號CGMCC No. 4924) 或枯草芽抱桿菌 ZJU7 (Bacillus subtilis z ju_7)(保藏號 CGMCC No. 1250)菌株。
6.根據(jù)權利要求5所述Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法，其特征在于，向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加草酸的同時也流加氮源，使氮源濃度維持在I 10g/L。
7.根據(jù)權利要求6所述Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法，其特征在于，所選的氮源選自氯化銨、硫酸銨、玉米粉、牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的任意一種。
8.根據(jù)權利要求1-7任一權利要求所述的Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法， 其特征在于，所述草酸由草酸鹽代替。
全文摘要
本發(fā)明公開了提供了一種γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴性生產方法。現(xiàn)有技術生產的γ-聚谷氨酸濃度低的、成本高。本發(fā)明在培養(yǎng)需氧芽孢桿菌(Bacillus sp.)過程中，通過向培養(yǎng)基中流加有機酸或有機酸與氮源的混合物，促使菌體將糖質原料和有機酸轉化為γ-聚谷氨酸，培養(yǎng)基中不需要另外添加前體物L-谷氨酸。本發(fā)明生產γ-聚谷氨酸的發(fā)酵方法周期短，易于操作，可用于工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵，具有很好的應用價值。
文檔編號C12R1/07GK102586354SQ20121006269
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月9日 優(yōu)先權日2012年3月9日
發(fā)明者張慧莉, 徐志南, 蔡謹, 黃磊 申請人:浙江德清匯寧生物科技有限公司