專利名稱：：擬南芥At168基因在提高作物賴氨酸和蛋白質(zhì)含量中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來源于擬南芥的一個(gè)蛋白質(zhì)和基因的用途，特別涉及擬南芥Atl68基因在提高作物賴氨酸和/或蛋白質(zhì)含量中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：賴氨酸作為人和單胃動(dòng)物所必需的氨基酸，在主要禾谷類作物如玉米、水稻、小麥的種子中含量很低，成為主要的限制性氨基酸，嚴(yán)重影響了其營養(yǎng)品質(zhì)。玉米中蛋白質(zhì)的合成受到120多個(gè)基因的控制，基因之間關(guān)系復(fù)雜，通常至少要選擇10代以上才能得到目的性狀的株系。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，采用傳統(tǒng)育種與分子育種相結(jié)合，可以打破物種生殖隔離的障礙，實(shí)現(xiàn)物種之間基因的自由交流。而利用植物基因工程改良作物營養(yǎng)及加工品質(zhì)，其應(yīng)用潛力不僅僅在于提高初級農(nóng)產(chǎn)品本身的價(jià)值，還涉及到加工成本的降低、加工工藝的簡化、產(chǎn)品市場競爭力的提高等多個(gè)環(huán)節(jié)。目前，通過轉(zhuǎn)基因途徑提高作物中的賴氨酸含量，主要有以下幾個(gè)途徑I、人工改造或設(shè)計(jì)高賴氨酸蛋白基因美國先鋒公司(PioneerHi-bredInc.)通過改造天然的基因編碼序列，用必需氨基酸替代天然蛋白中的部分非必需氨基酸，獲得了賴氨酸含量占14%的蛋白基因，將改造好的基因轉(zhuǎn)入植物，可以提高作物的賴氨酸含量。先鋒公司對該研究方法擁有專利(W09410315)。另外,少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了從頭合成(denovosynthesis)高賴氨酸蛋白基因的工作，是設(shè)計(jì)出自然界不存在的基因，因此難以全面了解其所編碼的蛋白的特性，目前只在模式植物(煙草)的種子上獲得表達(dá)(Othanietal.Normalandlysine-containingzeinsareunstableintransgenictobaccosweeds.PlantMolBiol1991,16(I):117-128;Keeleretal.Expressionofdenovohigh—lysinea-helicalcoiled—coilproteinsmaysignificantIyincreasetheaccumulatedlevelsoflysineinmatureseedsoftransgenictobaccoplants.PlantMolBiol.1997,34:15-29.)。2、改變氨基酸的合成和代謝途徑賴氨酸的合成受兩個(gè)關(guān)鍵酶——二氫吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)和天冬氨酸激酶(AK)的調(diào)控。酶的活性受產(chǎn)物的反饋抑制。用突變的方法篩選出對賴氨酸不敏感的AK和DHDPS，將對賴氨酸不敏感的AK和DHDPS基因轉(zhuǎn)入植物，可以提高植物中游離賴氨酸的含量(Perletal.Regulationoflysinesynthesisintransgenicpotatoplantsexpressingabacterialdihydrodipicolinatesynthaseintheirchloroplasts.PlantMolBiol,1992,19:815-823)。杜邦公司(DuPontCo.)在該研究領(lǐng)域擁有專利(US5773691)。Falco等將編碼對賴氨酸不敏感的谷氨酸棒狀桿菌的DHDPS的dapA基因與菜豆種子的蛋白特異啟動(dòng)子連接轉(zhuǎn)化油菜，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜的種子中游離賴氨酸的積累增加了100多倍。但游離賴氨酸在大豆及油菜種子中的高水平積累會(huì)影響種子的飽滿度和發(fā)芽率(Falcoetal.Transgeniccanolaandsoybeanseedswithincreasedlysine.Bio/Technol.1995,13:577-582)。3、降低醇溶蛋白含量，增加賴氨酸含量美國新澤西大學(xué)和孟山都公司的研究人員應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，抑制玉米種子中22KD(Segaletal.AnewopaquevariantofmaizebyasingledominantRNA-interference-inducingtransgene.Genetics,2003,165(I):387-397)或19KD(Huangetal.Generationofmarker-freetransgenicmaizebyregulartwo-borderAgrobacteriumtransformationvectors.TransgenicRes,2004,13(5):451-461)酉享溶蛋白基因的表達(dá)，降低籽粒中22KD或19KD醇溶蛋白的含量，結(jié)果使玉米籽粒中賴氨酸含量比對照提高了15%-20%，但讓人遺憾的是轉(zhuǎn)基因玉米的籽粒表型同o2突變體一樣，籽粒軟質(zhì)，易感病，不易貯存。后來，孟山都公司的Huang等(2005)把兩種不同的轉(zhuǎn)基因玉米雜交，得到同時(shí)轉(zhuǎn)19KDRNAi和dapA(來自微生物對賴氨酸不敏感的二氫吡啶二羧酸合成酶基因)的植株，其F1籽粒中總賴氨酸的含量由對照的0.27%提高到0.55%-0.62%，接近o2基因的水平，但其籽粒的表型缺陷(軟質(zhì)胚乳)仍然存在(Huangetal.High-Iysinecornproducedbythecombinationofenhancedlysinebiosynthesisandreducedzeinaccumulation.PlantBiotechJ，2005，3:555-569)。4、引入外源優(yōu)質(zhì)蛋白基因1997年美國夏威夷大學(xué)的辛世文等從四棱豆中分離得到一個(gè)高賴氨酸蛋白基因(W09707665)，該基因所編碼的蛋白質(zhì)賴氨酸含量約為11%(質(zhì)量比)。但研究發(fā)現(xiàn)該蛋白是一個(gè)過敏原，因此使其應(yīng)用受到限制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供蛋白質(zhì)Atl68及編碼核酸分子的新用途，所述蛋白質(zhì)Atl68的氨基酸序列如序列表中序列2所示。序列表中的序列2由168個(gè)氨基酸殘基組成，賴氨酸含量為20.3%(質(zhì)量比)。本發(fā)明所提供的一種新用途是培育高賴氨酸含量和/或高蛋白質(zhì)含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育高賴氨酸含量和/或高蛋白質(zhì)含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟將Atl68基因?qū)肽康闹参镏?，得到具有如下I)-3)中至少一種性狀的轉(zhuǎn)基因植物1)賴氨酸含量和蛋白質(zhì)含量均高于所述目的植物；2)賴氨酸含量高于所述目的植物；3)蛋白質(zhì)含量高于所述目的植物；所述Atl68基因是編碼序列表中序列2所不蛋白質(zhì)的DNA。其中所述Atl68基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入宿主中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果I)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明蛋白質(zhì)Atl68的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約60%；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括4組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來源于TMV，MCMV和AMV)。本發(fā)明中所述Atl68基因的編碼序列均具體可為序列表中序列I的第1-507位核苷酸。所述Atl68基因可通過Atl68基因表達(dá)盒或含有所述Atl68基因表達(dá)盒的Atl68基因表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物。本發(fā)明中所述At168基因表達(dá)盒均可含有At168基因和啟動(dòng)所述At168基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述Atl68基因編碼序列表中序列2所示蛋白質(zhì)Atl68。本發(fā)明中所述Atl68基因表達(dá)盒均指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)序列表中序列2所示蛋白質(zhì)Atl68的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)Atl68基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止Atl68基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述Atl68基因表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S;來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶("LAP"，Chao等人(1999)PlantPhysiol120:979-992);來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)I(PRl)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國專利5，187,267);四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國專利5，057，422);種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128(CN101063139B(中國專利200710099169.7))，種子忙存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動(dòng)子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053))。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcSE9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如0dell等人(I985)Nature313:810;Rosenberg等人(1987)Gene,56125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141;Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261;Munroe等人(1990)Gene，91:151;Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.，15:9627)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述Atl68基因表達(dá)盒中啟動(dòng)所述Atl68基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128，其核苷酸序列如序列表中的序列3?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述Atl68基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pR0KII、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因,賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。在本發(fā)明的實(shí)施例中，含有所述Atl68基因表達(dá)盒的Atl68基因表達(dá)載體含有兩個(gè)T-DNA區(qū)，一個(gè)T-DNA區(qū)含有選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒，另一個(gè)T-DNA區(qū)含有所述Atl68基因表達(dá)盒。所述選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒除了將所述Atl68基因表達(dá)盒中的Atl68基因替換為選擇標(biāo)記基因外，其它元件(如啟動(dòng)子、終止子和增強(qiáng)子)均可相同，其它元件也可不同，如啟動(dòng)子具體可為花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子。所述選擇標(biāo)記基因可為在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hpt，和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因,賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因hpt。在本發(fā)明的實(shí)施例中，含有所述兩個(gè)T-DNA區(qū)的Atl68基因表達(dá)載體具體為pSB130_FA168。pSB130_FA168是將所述谷子種子特異性啟動(dòng)子PF128插入pSB130的HindIII和BamHI位點(diǎn)，并將所述Atl68基因插入pSB130的BamHI和SacI位點(diǎn)得到的重組載體(圖2)。所述Atl68基因表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach,1998,MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，pp.411-463；GeisersonandCorey,1998，PlantMolecularBiology(2ndEdition)。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。當(dāng)所述目的植物為玉米等禾本科作物時(shí)，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下a)-c)中至少一種特性a)所述轉(zhuǎn)基因植物種子中賴氨酸含量和蛋白質(zhì)含量均高于所述目的植物的種子山)所述轉(zhuǎn)基因植物種子中賴氨酸含量高于所述目的植物的種子；c)所述轉(zhuǎn)基因植物種子中蛋白質(zhì)含量高于所述目的植物的種子。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。本發(fā)明所提供的另一種新用途是以下I)-4)中的任一種物質(zhì)在提高植物中賴氨酸含量和/或蛋白質(zhì)含量中的應(yīng)用I)編碼Atl68的核酸分子，所述Atl68是序列表中序列I所示的蛋白質(zhì)；2)所述At168;3)含有I)所述核酸分子的表達(dá)盒；4)含有I)所述核酸分子的載體。其中，序列表中的序列I由168個(gè)氨基酸組成。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子具體可為編碼Atl68的基因，所述基因的編碼序列具體可為序列表中序列2的第1-507位核苷酸。上述應(yīng)用中，3)所述的表達(dá)盒具體可為上述Atl68基因表達(dá)盒，4)所述的載體具體可為上述Atl68基因表達(dá)載體。上述方法和上述應(yīng)用中提到的所述Atl68基因表達(dá)盒或所述Atl68基因表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上文所述Atl68基因表達(dá)盒的重組微生物或含有上文所述Atl68基因表達(dá)載體的重組微生物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述重組微生物具體可為細(xì)菌，酵母，藻和真菌。其中，細(xì)菌可來自埃希氏菌屬(Escherichia),歐文氏菌(Erwinia),根癌農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium),產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes),假單胞菌屬(Pseudomonas),芽胞桿菌屬(Bacillus)等。實(shí)驗(yàn)證明，將Atl68基因轉(zhuǎn)入玉米制備的轉(zhuǎn)基因玉米種子中賴氨酸含量最高達(dá)種子干重O.43%，比野生型對照提高43.3%;蛋白質(zhì)含量最高達(dá)種子干重的13.94%，比野生型對照提高33.8%。而且高賴氨酸和高蛋白質(zhì)的性狀可以穩(wěn)定遺傳?？朔舜蠖鄶?shù)玉米品質(zhì)改良方法中所面臨的賴氨酸和蛋白質(zhì)含量不能同時(shí)提高的難題。本發(fā)明所用的目的基因?yàn)閬碜詳M南芥的Atl68基因，其編碼的蛋白質(zhì)賴氨酸含量為20.3%，高于迄今已報(bào)道的天然或經(jīng)改造過的高賴氨酸蛋白。本發(fā)明的Atl68基因可以顯著提高轉(zhuǎn)基因作物種子中賴氨酸和蛋白質(zhì)含量，可用于提高作用營養(yǎng)品質(zhì)。圖I為pSB130-FA168的構(gòu)建流程2為玉米的轉(zhuǎn)化和再生過程圖3為RO代玉米基因組DNA的PCR檢測結(jié)果圖4為Rl代玉米種子蛋白質(zhì)的Western檢測結(jié)果具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、利用Atl68基因培育高賴氨酸含量和高蛋白質(zhì)含量的轉(zhuǎn)基因玉米l、Atl68基因的分離根據(jù)擬南芥基因組序列(GenBankAB024024)設(shè)計(jì)引物Atl68Pl5/-GCGGATCCATGGGTTATTGGAAGTCGAAGG-3'和At168P25'-CCGAGCTCTCAAGCCTTTTGTGGCGCAGCC-3',5'端引物引入BamHI酶切位點(diǎn)，3'端引物引入SacI酶切位點(diǎn)。以擬南芥基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增At168基因。擴(kuò)增條件如下95°C，變性Imin;55°C，退火O.5min；72°C,延伸O.5min;擴(kuò)增循環(huán)數(shù)35;最后72°C，延伸IOmin;4°C保存。取適量PCR產(chǎn)物，O.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物用BamHI和SacI酶切后，連接到pGEM_7Zf(+)(Promega)的BamHI和SacI位點(diǎn)上，進(jìn)行酶切和序列測定，將含有Atl68基因的重組載體命名為pGEM-7Zf(+)-A168。Atl68基因的核苷酸序列如序列表中序列I所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。2、Atl68基因表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌本步驟構(gòu)建的Atl68基因表達(dá)載體是pSB130-FA168，它含有兩個(gè)T-DNA區(qū)，一個(gè)T-DNA區(qū)含有選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒，另一個(gè)T-DNA區(qū)含有Atl68基因表達(dá)盒。Atl68基因表達(dá)盒由Atl68基因、啟動(dòng)Atl68基因轉(zhuǎn)錄的谷子種子特異啟動(dòng)子pF128和胭脂堿合成基因nos的3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域組成。其中，谷子種子特異啟動(dòng)子PF128，其驅(qū)動(dòng)的目的基因主要在授粉后15-25天表達(dá)，可避免目的基因的表達(dá)對植株生長發(fā)育的影響。此外，利用來源于谷子的調(diào)控序列還可避免用玉米中的序列如19Z啟動(dòng)子等可能引起的轉(zhuǎn)基因植物中同源抑制和重組的發(fā)生，使目的基因的表達(dá)更穩(wěn)定。選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒由潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因、啟動(dòng)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因轉(zhuǎn)錄的花椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶(NOS)基因的3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域(終止子)組成。其中，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因編碼氨基糖苷4-磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(4)-I。pSB130-FA168的構(gòu)建流程如圖I所示，具體構(gòu)建方法如下用HindIII和BamHI將谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128(其核苷酸序列為序列表中的序列3)從質(zhì)粒pBIpF128(CN101063139B(中國專利200710099169.7))上切下，連接到雙-T載體pSB130(于恒秀，劉巧泉，王玲等，無抗性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)APl基因抗病水稻新品系的選育，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005,38(12)=2373-2379;來自香港中文大學(xué)辛世文教授；公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；該質(zhì)粒上有兩個(gè)T-DNA，一個(gè)包含選擇標(biāo)記基因hpt，另一個(gè)T-DNA上有多克隆位點(diǎn)，可以克隆目的基因)，形成重組質(zhì)粒PSB130-F128。再用BamHI和SacI酶切pGEM-7Zf(+)-A168，回收含有Atl68基因的小片段，與BamHI和SacI酶處理的質(zhì)粒PSB130-F128連接，構(gòu)建得到質(zhì)粒pSB130_FA168(圖2)。采用凍融法將質(zhì)粒pSB130_FA168直接轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌LBA4404，獲得含有重組質(zhì)粒pSB130-FA168的農(nóng)桿菌LBA4404(pSB130-FA168)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)為公知技術(shù)。3、用pF128::Atl68嵌合基因轉(zhuǎn)化玉米農(nóng)桿菌LBA4404(pSB130-FA168)轉(zhuǎn)化及玉米的再生過程如圖2所示，具體步驟如下取授粉后10-12天的玉米雜交組合178X黃A(玉米自交系178和黃A:(《山西玉米品種志》，P386-387。賈明進(jìn)等，中國農(nóng)業(yè)出版社ISBN:7-109-07847-7，2003年5月。玉米自交系178和黃A由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)許啟鳳教授提供，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)雌穗，滅菌后剝?nèi)∮着?，放于培養(yǎng)基A上(N6培養(yǎng)基，含2mg/L2，4_D，O.69g/LL-脯氨酸，100mg/L酪蛋白水解物，2%蔗糖)。農(nóng)桿菌LBA4404(pSB130-FA168)在YEB固體培養(yǎng)基(含鏈霉素(Sm)125μg/mL，卡那霉素(Kan)100μg/mL)上培養(yǎng)兩天后，在平板上刮菌，用適量D_inf培養(yǎng)基懸浮農(nóng)桿菌，黑暗條件下以75rpm震蕩培養(yǎng)2_4小時(shí)后備用。選取大小在I.5-2.Omm的幼胚放入2mL離心管中，加入不含農(nóng)桿菌的D-inf培養(yǎng)基，浸泡并沖洗2次后，倒去剩余培養(yǎng)基，加入OD600為O.3-0.4的農(nóng)桿菌LBA4404(pSB130-FA168)懸浮液，侵染IOmin左右。將侵染過的幼胚放在濾紙上吹干后，移入D-共培養(yǎng)培養(yǎng)基，22°C暗培養(yǎng)3天。將共培養(yǎng)3天后的幼胚在含1/1000噻孢霉素(Cef)的無菌水中洗三次，然后用濾紙吸干，轉(zhuǎn)入含250mg/LCef的D-共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C暗處恢復(fù)培養(yǎng)7天；將恢復(fù)培養(yǎng)后的幼胚轉(zhuǎn)移到D-篩選培養(yǎng)基上，2周繼代一次，共篩選三輪，潮霉素濃度依次為10、15、20mg/mL。6周后，將抗性愈傷轉(zhuǎn)移到D-恢復(fù)培養(yǎng)基上，28°C條件下暗培養(yǎng)2周；然后轉(zhuǎn)到D-誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)。2周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)到D-分化培養(yǎng)基上，在光照周期為亮/暗=16小時(shí)/8小時(shí)，28°C條件下培養(yǎng)，每兩周繼代一次。將發(fā)生綠芽的愈傷組織切分，當(dāng)小植株長到23cm高時(shí)，轉(zhuǎn)移進(jìn)三角瓶中(含生根培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)。34葉期且根系較發(fā)達(dá)時(shí)，將小苗移栽花盆中，外罩塑料袋保溫保濕。57天后，去掉塑料袋，在溫室中培養(yǎng)，直至開花結(jié)實(shí)。該步驟中所用的培養(yǎng)基組成如下D基本培養(yǎng)基N6培養(yǎng)基大量元素+B5培養(yǎng)基微量元素+D有機(jī)物+100mg/L肌醇+0.5g/L水解干酪素+0.7g/LL-脯氨酸D有機(jī)物100X母液濃度氯化膽堿9.7mg/L核黃素4.89mg/L生物素10.016mg/L葉酸4.85mg/L煙酸19.94mg/LVBl47.222mg/LD-泛酸鈣10.0mg/LVB619.94mg/LVB120.0135mg/L對氨基苯甲酸4.94mg/LD-inf培養(yǎng)基D基本培養(yǎng)基附加:2，4_D2mg/L,68.4g.L—1蔗糖，36g.L—1葡萄糖，100μM乙酰丁香酮(AS)，pH5.2οD-共培養(yǎng)培養(yǎng)基D基本培養(yǎng)基附加硝酸銀O.85mg·L_\半胱氨酸300mg·L_S100μMAS,MESO.5g·Λ2，4-2mg/L，30g·L—1蔗糖，凝膠3g·ΛpH5.8。D-篩選培養(yǎng)基D基本培養(yǎng)基附加硝酸銀0.85π^·ΛMESO.5g·L—1，Cef250mg·L-1,Hyg10_20mg·L-1,2,4-D2mg/L,30g·L-1鹿糖，瓊脂8g·L1,pH5.8。D-恢復(fù)培養(yǎng)基D基本培養(yǎng)基附加硝酸銀O.85mg·L—1，MESO.5g·L1，Cef250mg·L1,2,4-D0.4mg/L,6-BA2mg/L,30g·L1鹿糖，凝膠3g·L\pH5.8。D-誘導(dǎo)培養(yǎng)基D基本培養(yǎng)基附加2，4-DO.4mg/L,6-BA2mg/L,50g-Γ1蔗糖，瓊脂8g·λρΗ5.8οD-分化培養(yǎng)基D基本培養(yǎng)基附加30g·L-1蔗糖，瓊脂8g·L1，pH5.8。生根培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基+NAAO.5-1.Omg1714、轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA的PCR檢測提取RO代(轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株)玉米基因組DNA，PCR擴(kuò)增Atl68基因，引物Atl68P3:5'-ATGGGTTATTGGAAGTCGAAGG-3',Atl68P45'-TCAAGCCTTTTGTGGCGCAGCC-3'PCR反應(yīng)體系如下成分_體積_植物基因組DNA(0.51.0μLPgW2XTaqMasterMix0.5μΕ3’引物(ΙΟμΜ)0.5pL5’引物(ΙΟμΜ)0.5pLddH20補(bǔ)足至20μL擴(kuò)增條件為95°C，變性Imin;55°C，退火O.5min;72°C，延伸O.5min;擴(kuò)增循環(huán)數(shù)30;72°C，再延伸IOmin;取適量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段長度約500bp。其余產(chǎn)物_20°C保存。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明被檢的10株RO代植株，有9株均擴(kuò)增得到Atl68基因，而野生型植株未檢測出(圖3)。圖3中，M為D2000Plus(GenStar)，ck_為玉米雜交組合178X黃A;其它為10株RO代植株的編號。5、PCR檢測Tl代玉米植株Atl68基因和抗性基因hpt的分離將RO代PCR檢測陽性的玉米植株自交，獲得Rl代種子，種植，提取Rl代植株葉片基因組DNA，分別用Atl68引物(Atl68P3和Atl68P4)和hpt引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Atl68基因和抗性基因hptοhpt引物為hptPl5'-TCGGCTCCAACAATGTCCTG-3'和hptP25'-CGGTCGGCATCTACTCTATTCC-3'，反應(yīng)體系同步驟4，hpt基因擴(kuò)增條件為95°C，變性Imin;52°C，退火O.5min;72°C，延伸O.5min;擴(kuò)增循環(huán)數(shù)30;72°C，再延伸IOmin;取適量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段長度約500bp。其余產(chǎn)物_20°C保存。結(jié)果顯示，Rl代植株中目的基因和選擇標(biāo)記基因發(fā)生分離，獲得了13株只含有目的基因，沒有抗性基因的轉(zhuǎn)基因植株，表明利用雙-T載體系統(tǒng)是獲得Marker-free轉(zhuǎn)基因玉米的一個(gè)可行途徑。然后選擇Rl代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行加代種植，對每代植株進(jìn)行PCR檢測，通過后代基因分離，選出無抗性標(biāo)記基因且目的基因(Atl68基因)純合的株系，目前已經(jīng)得到R4代植株。其中，部分Rl代植株P(guān)CR檢測結(jié)果如表I所示。表I.部分Rl代植株P(guān)CR檢測結(jié)果權(quán)利要求1.培育高賴氨酸含量和/或高蛋白質(zhì)含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟將Atl68基因?qū)肽康闹参镏?，得到具有如?)-3)中至少一種性狀的轉(zhuǎn)基因植物1)賴氨酸含量和蛋白質(zhì)含量均高于所述目的植物；2)賴氨酸含量高于所述目的植物；3)蛋白質(zhì)含量高于所述目的植物；所述Atl68基因編碼序列表中序列2所不蛋白質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述基因的編碼序列是序列表中序列I的第1-507位核苷酸。3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述基因通過權(quán)利要求7所述的Atl68基因表達(dá)盒或權(quán)利要求7所述的Atl68基因表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物。4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的方法，其特征在于所述目的植物為禾本科作物，如玉米；所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下a)-c)中至少一種特性a)所述轉(zhuǎn)基因植物種子中賴氨酸含量和蛋白質(zhì)含量均高于所述目的植物的種子山)所述轉(zhuǎn)基因植物種子中賴氨酸含量高于所述目的植物的種子；c)所述轉(zhuǎn)基因植物種子中蛋白質(zhì)含量高于所述目的植物的種子。5.以下1)-4)中的任一種物質(zhì)在提高植物中賴氨酸含量和/或蛋白質(zhì)含量中的應(yīng)用1)編碼Atl68的核酸分子，所述Atl68是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；2)所述At168；3)含有I)所述核酸分子的表達(dá)盒；4)含有I)所述核酸分子的載體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述表達(dá)盒為權(quán)利要求7所述的Atl68基因表達(dá)盒，所述載體為權(quán)利要求7所述的Atl68基因表達(dá)載體。7.Atl68基因表達(dá)盒或含有所述Atl68基因表達(dá)盒的Atl68基因表達(dá)載體；所述Atl68基因表達(dá)盒含有Atl68基因和啟動(dòng)所述Atl68基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述Atl68基因編碼序列表中序列2所不蛋白質(zhì)。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)盒或表達(dá)載體，其特征在于所述啟動(dòng)子為谷子種子特異性啟動(dòng)子PF128。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體含有兩個(gè)T-DNA區(qū)，一個(gè)T-DNA區(qū)含有選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒，另一個(gè)T-DNA區(qū)含有所述Atl68基因表達(dá)盒。10.含有權(quán)利要求7或8所述Atl68基因表達(dá)盒的重組微生物或含有權(quán)利要求7-9中任一所述Atl68基因表達(dá)載體的重組微生物。全文摘要本發(fā)明公開了擬南芥At168基因在提高作物賴氨酸和/或蛋白質(zhì)含量中的應(yīng)用。其中的一個(gè)應(yīng)用是培育高賴氨酸含量和/或高蛋白質(zhì)含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法包括如下步驟將At168基因?qū)肽康闹参镏?，得到具有如?)-3)中至少一種性狀的轉(zhuǎn)基因植物1)賴氨酸含量和蛋白質(zhì)含量均高于所述目的植物；2)賴氨酸含量高于所述目的植物；3)蛋白質(zhì)含量高于所述目的植物；所述At168基因編碼序列表中序列2所示蛋白質(zhì)。本發(fā)明的At168基因可以顯著提高轉(zhuǎn)基因作物種子中賴氨酸和蛋白質(zhì)含量，可用于提高作用營養(yǎng)品質(zhì)。文檔編號C12N1/15GK102586320SQ20121006378公開日2012年7月18日申請日期2012年3月12日優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日發(fā)明者于靜娟,常玉潔,敖光明,文柳瓔,朱登云,申二麗,趙倩申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)