專利名稱：一種硫氧還蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種半滑舌鰨硫氧還蛋白及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)是一種分子量約12 kDa的小分子還原蛋白，廣泛存在于各種原核和真核生物體。硫氧還蛋白擁有一個高度保守的、具還原活性的催化位點，其結(jié)構(gòu)特征為CXXC。硫氧還蛋白與各種不同的巰基蛋白作用，將其二硫鍵還原為雙巰基。借此功能，硫氧還蛋白調(diào)控多種重要生物過程，如氧化還原狀態(tài)的維持、基因表達、免疫反應(yīng)等。已知高等動物的硫氧還蛋白具有多種生物學(xué)活性，包括抗氧化活性、促生長作用、 抗細胞凋亡、抗腫瘤作用等。但是魚類硫氧還蛋白的研究很少，其作用和生物學(xué)活性皆不甚清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種硫氧還蛋白及其制備和應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種硫氧還蛋白，硫氧還蛋白為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。所述硫氧還蛋白為含有列表SEQ ID No. I的真核重組表達質(zhì)粒pETrx轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a獲得的重組蛋白。硫氧還蛋白的制備方法以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化后與載體 pBS-T連接,連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌,得質(zhì)粒pBSTrx ；將上述質(zhì)粒pBSTrx和質(zhì)粒pET259用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA 連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，得質(zhì)粒pETrx ；將上述所得質(zhì)粒pETrx轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，所得轉(zhuǎn)化子BL21 (DE3) /pETrx純化所得重組蛋白，為序列表SEQ ID No. I中的氣基酸序列所不的硫氧還蛋白；所述Fl 為 5’ -GATATCATGGTTTACGAAGTGAAAG -3’ ； RI 為 5’ -GATATCTTCTTTTTCATACTGCTTC -3’。硫氧還蛋白的應(yīng)用，所述序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列編碼的硫氧還蛋白作為還原酶活性、抗氧化或促細胞生長的制劑。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明的硫氧還蛋白制備簡單，具有明顯的還原酶活性、抗氧化作用和促細胞生長能力。


圖I為本發(fā)明實施例提供的純化得到的硫氧還蛋白電泳圖譜(其中，純化得到的硫氧還蛋白為泳道2 ;泳道I :分子量marker。)。
圖2為本發(fā)明實施例提供的硫氧還蛋白的還原酶活性檢測圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法I.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell Molecular Cloning A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001);酵母轉(zhuǎn)化按 Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20);聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)按照 Sambrook and Russell Molecular Cloning A Laboratory MannuaI. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001o3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術(shù)有限公司”，北京。實施例I本發(fā)明的硫氧還蛋白為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列。序列表SEQ ID No. I 為MVYEVKDYNDFTQQLKRAGNKLVVVDFTATWCQPCKNISPVFEELANQYKNVVFLKVDVDEADDVSTEC E I NCMPTFLFYRNEKRVHSFSGANSDTLRAAVKQYEKE(a)序列特征 長度107·類型氨基酸序列·鏈型單鏈·拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源半滑舌鰨結(jié)構(gòu)特點該蛋白預(yù)期含有一個CXXC結(jié)構(gòu)域，由氨基酸35-38構(gòu)成，實施例2硫氧還蛋白的制備方法I)質(zhì)粒pETrx的構(gòu)建以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR條件為94°C 60s 預(yù)變性模板 DNA，然后 94°C 40s, 48°C 60s, 72°C 60s，5 個循環(huán)后改為 94°C 40s, 58°C 60s， 72°C 60s，30個循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)7-10min。PCR產(chǎn)物純化后與載體pBS_T (購于 “天根生化科技(北京)有限公司”)于室溫連接4-6小時，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci 后在含安卡青霉素(100ug/ml)、Xgal (40ug/ml)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(24ug/ml) 的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBSTrx。將pBSTrx和質(zhì)粒 pET259(質(zhì)粒 pET259 構(gòu)建過程參見 Zheng, ff. J.，Hu, Y. H.，Sun, L. ,2010. Cloningand analysis of a ferritin subunit from turbot(Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Immunol. 28,829-836)用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切后回收0. 3kb和5. 4kb片段， 將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，在含卡那霉素(30ug/ml) 的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pETrx。所述LB組成成分按重量百分比計1. O %蛋白胨，O. 5 %酵母粉，I. O % 氯化鈉,97. 5 % 蒸餾水。所述 Fl 為 5’ -GATATCATGGTTTACGAAGTGAAAG -3’ ；R1 為 5’ -GATATCTTCTTTTTCATACTGCTTC -3’。2)硫氧還蛋白的表達和制備將步驟I)的質(zhì)粒pETrx轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)(購于“天根生化科技(北京)有限公司”)，在含有卡那霉素(30ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子即為BL21(DE3)/pETrx。 將BL21 (DE3)/pETrx在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)至0D_為0. 6，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其終濃度達到0. 4mM，30°C繼續(xù)搖動培養(yǎng)4-5小時，而后用GE Healthcare (美國)公司的nickel-nitrilotriacetic acid親和層析柱純化重組蛋白(層析條件用4-5ml Wash buffer洗柱兩次，隨后用0. 5_lml Elution buffer洗柱,收集所有洗脫液)。將洗脫液中的重組蛋白進行質(zhì)譜分析，證實其為序列表SEQ ID No. I中氨基酸序列所示的硫氧還蛋白。將重組蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，發(fā)現(xiàn)其分子量與表SEQ ID No. I中序列的分子量一致(參見圖I)。上述Wash buffer 成分為50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole, pH 8. 0 ； 上述 Elution buffer 成分為50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mMimidazole, pH 8. 0.實施例3硫氧還蛋白的還原酶活性將純化的硫氧還蛋白Trx 加入 A buffer (0. IM PBS，2mM DTT，2mMEDTA_Na2， I. 25mg/ml insulin)至終濃度為4uM。對照組加入等體積的PBS。25 保溫不同時間后在 650nm測定吸光值(A65tl)。結(jié)果表明，對照組的A650幾乎為零，而加入Trx組的A650值隨著保溫時間延長而顯著加強，說明硫氧還蛋白具有明顯的還原酶活性(參見圖2)。所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12H20,0. 024% NaH2PO4,余量為水。實施例4硫氧還蛋白的保護細胞抗氧化作用將半滑舌鰨頭腎淋巴細胞于含有L-15培養(yǎng)基(購于Thermo Scientific HyClone, Beijing, China)的96-孔平板培養(yǎng)。頭腎淋巴細胞提取、培養(yǎng)方法參見參考文獻 Hu Y, Chen L, Sun L. CXCL8 of Scophthalmus maximus-expression, biological activity, and immunoregulatory effect. Dev Comp Tmmunol. 2011 ;35 :1030_7o 將 15ul 硫氧還蛋白或PBS (對照)與15ul20mM DTT混合，25°C保溫0. 5h。將保溫后的Trx加入淋巴細胞至終濃度為3ug/ml，隨后加入H2O2至終濃度為200uM。22°C保溫lh，加入20 μ 15mg/ ml MTT (Sangon, Shanghai, China)，22°C保溫 4h,加入 200 μ ldimethyl sulfoxide,隨后在在490nm測定吸光值(A49tl)。結(jié)果表明，加入Trx的細胞的A49tl是對照細胞的3倍，說明Trx 能夠保護細胞抵抗H2O2的氧化作用。實施例5
硫氧還蛋白的促細胞生長作用將硫氧還蛋白Trx或PBS (對照)加入如上述實施例4所述培養(yǎng)的淋巴細胞中至終濃度為I. 5ug/ml。將細胞于22°C保溫2天，加入20 μ I 5mg/mlMTT，22°C保溫4h，加入 200 μ I dimethyl sulfoxide,隨后在在490nm測定吸光值(A49tl)。結(jié)果表明，加入Trx的細胞的A49tl是對照細胞的2. 5倍，說明Trx能夠有效促進細胞增殖。綜上所述，本發(fā)明的硫氧還蛋白具有明顯的還原酶活性、抗氧化作用和促細胞生長能力。
權(quán)利要求
1.一種硫氧還蛋白，其特征在于硫氧還蛋白為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。
2.按權(quán)利要求I所述的硫氧還蛋白，其特征在于所述硫氧還蛋白為含有列表SEQID No. I的真核重組表達質(zhì)粒pETrx轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α獲得的重組蛋白。
3.—種權(quán)利要求I所述的硫氧還蛋白的制備方法，其特征在于以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化后與載體pBS-T 連接，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得質(zhì)粒pBSTrx ；將上述質(zhì)粒PBSTrx和質(zhì)粒PET259用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，得質(zhì)粒pETrx ；將上述所得質(zhì)粒pETrx轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，所得轉(zhuǎn)化子BL21 (DE3)/pETrx純化所得重組蛋白，為序列表SEQ ID No. I中的氣基酸序列所不的硫氧還蛋白；所述 Fl 為 5’ -GATAT CAT GGTTTACGAAGTGAAAG -3’ ； R I 為 5’ -GATATCTTCTTTTTCATACTGCTTC -3’。
4.一種權(quán)利要求I所述的硫氧還蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列編碼的硫氧還蛋白作為還原酶活性、抗氧化或促細胞生長的制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種半滑舌鰨硫氧還蛋白及其制備和應(yīng)用。硫氧還蛋白為序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。制備方法構(gòu)建質(zhì)粒pETrx，將其轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，獲得BL21(DE3)/pETrx，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)后，利用親和層析柱純化重組蛋白，即為硫氧還蛋白。所述硫氧還蛋白具有顯著的還原酶活性、抗氧化作用和促細胞生長作用。
文檔編號C12N15/70GK102586202SQ20121006609
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者孫黎, 李永鑫 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所