專利名稱：禽腦脊髓炎病毒lamp檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
禽腦脊髓炎(avian encephalomyelitis,AE)又稱流行性震顫,是由禽腦脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)引起的青年雞、雉雞、鶴鵓和火雞的一種急性、 高度接觸性傳染病。該病通過(guò)消化道感染家禽，侵害雞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其它實(shí)質(zhì)性器官， 病毒經(jīng)蛋垂直傳播，導(dǎo)致孵化率下降，感染雛雞在1-7日齡出現(xiàn)震顫、運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀，隨著雞日齡的增長(zhǎng)，這些臨床神經(jīng)癥狀慢慢不表現(xiàn)。另外，病毒感染產(chǎn)蛋雞，可導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量輕微下降，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)尤其是種禽飼養(yǎng)業(yè)危害極大。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)腦脊髓炎病毒的方法有病毒分離、PCR方法和熒光PCR檢測(cè)方法等，但是病毒分離鑒定存在耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性較低、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。目前已建立的禽腦脊髓炎病毒PCR方法和熒光PCR檢測(cè)方法，雖然檢測(cè)的敏感性也比較高，但是常規(guī)PCR需要使用PCR儀和進(jìn)行凝膠電泳等，而熒光PCR檢測(cè)方法需要昂貴的熒光PCR儀和昂貴的試劑，不利于在臨床中推廣。LAMP具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速且成本低、操作方法更簡(jiǎn)單，適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組。本發(fā)明提供的引物組，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物組中，還包括引物5和引物6，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列5和序列6 ；上述引物組由所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6組成；所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比具體為 7. 5-8. 5 7. 5-8. 5 15-17 15-17 7. 5-8. 5 7. 5-8. 5 ;所述引物 I、 所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比進(jìn)一步具體為 8 : 8 : 16 : 16 : 8 : 8。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑。本發(fā)明提供的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，由上述的引物組、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、抑制劑(inhibitor)、DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)、dNTPs、硫酸鎂、甜菜堿、 鈣黃綠素、氯化錳和水組成。上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中，所述引物組中的引物I在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為 7. 5u mol/ μ L_8. 5u mol/ μ L ；所述引物組中的引物2在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為7.5u mo μ L~8. 5u mol/μ L ；所述引物組中的引物3在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為15u mo μ L-17u mol/μ L ；所述引物組中的引物4在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為15u mo μ L-17u mol/μ L ；所述引物組中的引物5在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為7.5u mo μ L~8. 5u mol/μ L ；所述引物組中的引物6在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為7.5u mo] μ L~8. 5u mol/μ L ；所述引物組中的引物I在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為 8umol/μ L ；所述引物組中的引物2在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為 8umol/μ L ；所述引物組中的引物3在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為 16umol/μ L ；所述引物組中的引物4在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為 16umol/μ L ；所述引物組中的引物5在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為 8umol/μ L ；所述引物組中的引物6在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為 8umol/μ L0本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑。上述的引物組或上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或上述試劑盒在制備檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有禽腦脊髓炎病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，所述檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有禽腦脊髓炎病毒為用上述的引物組或上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或上述試劑盒對(duì)所述待測(cè)樣品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；上述應(yīng)用中，所述反應(yīng)的模板為待測(cè)樣品的RNA。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明建立了禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，本試劑盒根據(jù)禽腦脊髓炎病毒的VP2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物、兩個(gè)特異性外引物和兩個(gè)特異性環(huán)引物，該保守基因序列為禽腦脊髓炎病毒所共有。常規(guī)的LAMP方法,需要在反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入SYBR Green I或 Gene Finder染料來(lái)顯色，反應(yīng)產(chǎn)物易形成氣溶膠而污染周圍環(huán)境，容易污染環(huán)境而造成假陽(yáng)性，同時(shí)SYBR Green I或Gene Finder染料還會(huì)因?yàn)橐锒垠w而引起假陽(yáng)性。因此本發(fā)明使用鈣黃綠素+氯化錳替代了 SYBR Green I和Gene Finder這些染料，在配置LAMP反應(yīng)液時(shí)就可以加入反應(yīng)液中，無(wú)需LAMP反應(yīng)后開蓋，并且鈣黃綠素+氯化錳僅在發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)才出現(xiàn)翠綠色,避免了 SYBR Green I和Gene Finder染料造成的假陽(yáng)性問(wèn)題,具有更好的特異性?？傊?，本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，且比PCR檢測(cè)方法有更高的靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需要普通的水浴鍋即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳來(lái)觀察，簡(jiǎn)單而快速，特別適用于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒。


圖I為L(zhǎng)AMP方法檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒的特異性2為L(zhǎng)AMP方法檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒的敏感性試驗(yàn)3為PCR方法檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒敏感性試驗(yàn)4為禽腦脊髓炎病毒LAMP反應(yīng)對(duì)臨床樣品檢測(cè)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、引物的設(shè)計(jì)及其試劑盒的制備根據(jù)禽腦脊髓炎(avian encephalomyelitis, AE)的VP2基因保守區(qū)域(序列號(hào) BU327593)，設(shè)計(jì)如下引物內(nèi)引物I 為CAATCGATTCAATGTCAACCTGATC-AACATCTTTTCAAGCTGGAG(序列 I)；內(nèi)引物2 為CCGCTATGACCACATATTGCC-TGTATATGTAAGGAACTTTCATCC(序列 2)；外引物I 為GGACTAGACGTTATTGTTCAGAT(序列 3)；外引物2 為GGTTGTAGCAACCCCTAC(序列 4)；環(huán)引物I 為GCACAAGGGCTGCTATGAGAC(序列 5)；環(huán)引物2 為ACGGTAAGCTGAATTGCAACA(序列 6)。2、LAMP鑒別試劑及試劑盒24ul反應(yīng)液體系如下2. 5ul IOX等溫反應(yīng)緩沖液(中國(guó)大連寶生物工程公司 Takara產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)DR100A)、lul 5U/ul AMV(中國(guó)大連寶生物工程公司Takara產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)D2620，反應(yīng)體系中的終濃度為O. 2U/ul)、lul 40U/ul inhibitor(抑制劑，中國(guó)大連寶生物工程公司Takara產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)D2313A，反應(yīng)體系中的終濃度為
1.6U/ul)、lul 8U/ul Bst DNA 聚合酶(反應(yīng)體系中的終濃度為 O. 35U/ul)、3. 5ul IOmM dNTPs (中國(guó)大連寶生物工程公司Takara產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)D4030RA，反應(yīng)體系中的終濃度為I. 4mM)、5ul 25mM硫酸鎂(反應(yīng)體系中的終濃度為5mM)、lul 200uM/uL的外引物I (反應(yīng)體系中的終濃度8uM/uL)、lul 200uM/uL的外引物2 (反應(yīng)體系中的終濃度8uM/uL)、2ul 200uM/uL的內(nèi)引物I (反應(yīng)體系中的終濃度16uM/uL)、2ul 200uM/uL的內(nèi)引物2(反應(yīng)體系中的終濃度16uM/uL)、lul 200uM/uL的環(huán)引物I (反應(yīng)體系中的終濃度8uM/uL)、Iul 200uM/uL的環(huán)引物2 (反應(yīng)體系中的終濃度8uM/uL)，O. 5ul 5M甜菜堿、Iul 625 μ M鈣黃綠素、Iul 12. 5mM氯化猛和3ul雙蒸水。鑒別檢測(cè)試劑盒包括上述反應(yīng)液，也可以包括是各獨(dú)立包裝的引物。實(shí)施例2、禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測(cè)方法的特異性和敏感性試驗(yàn)
I、禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)禽腦脊髓炎病毒Van株(AE Van株)、禽腦脊髓炎病19株(AE 19株)、禽腦脊髓炎病毒W(wǎng)l株(AE Wl株)、禽腦脊髓炎病毒W(wǎng)2株(AE W2株)、禽腦脊髓炎病毒1163株(AEl 163 株)(上述 5 株病毒均詳見 Zhiqin Xie (謝志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus, Avian Disease (美國(guó)禽病雜志)，2005，49 :227-230,公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。)、雞馬立克氏病毒(MDV)株(購(gòu)自南京梅里亞動(dòng)物保健品公司)、雞傳染性支氣管炎病毒株(Mass 41)、 雞傳染性喉氣管炎病毒株(北京株)、禽呼腸孤病毒株(S1133)、禽巴氏桿菌(C48-1)、雞毒霉形體(MG)、雞新城疫病毒(Lasota)(記載上述6株病毒的文獻(xiàn)詳見Zhiqin Xie (謝志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus, Avian Disease (美國(guó)禽病雜志)，2005,49 :227-230 ;謝志勤等，應(yīng)用二溫式多重PCR技術(shù)鑒別雞傳染性支氣管炎病毒和雞傳染性喉氣管炎病毒，廣西科學(xué)，2001，8(2) :152-153，公眾可從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。)。分別提取禽腦脊髓炎病毒Van株(AE Van株)、禽腦脊髓炎病19株(AE 19株)、 禽腦脊髓炎病毒W(wǎng)l株(AE Wl株)、禽腦脊髓炎病毒W(wǎng)2株(AE W2株)、禽腦脊髓炎病毒 1163株(AE 1163株)、雞馬立克氏病毒(MDV)株、雞傳染性支氣管炎病毒株(Mass41)、雞傳染性喉氣管炎病毒株(北京株)、禽呼腸孤病毒株(S1133)、禽巴氏桿菌(C48-1)、雞毒霉形體(MG)、雞新城疫病毒(Lasota)的RNA為模板，在上述24ul由實(shí)施例I得到的反應(yīng)體系中分別加入上述Iul模板。LAMP反應(yīng)程序如下62°C 90min，然后80°C 5min。以正常雞腦組織(表型正常，且經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證為陰性，用的引物為Pl CTTATGCTGGCCCTGATCGT, P2 TCCCAAATCCACAAACCTAGCC,詳見 Zhiqin Xie (謝志勤)等，Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian Encephalomyelitis virus, Avian Disease (美國(guó)禽病雜志)，2005，49 :227-230)提取的RNA為陰性對(duì)照。LAMP反應(yīng)結(jié)果可以通過(guò)以下兩個(gè)方法判斷在可見光下直接用肉眼觀察顏色變化，陽(yáng)性結(jié)果顯示翠綠色，陰性結(jié)果顯示淡桔紅色；在紫外線下觀察陽(yáng)性結(jié)果顯示明亮的綠色熒光，陰性結(jié)果顯示無(wú)顏色。可見光下觀察結(jié)果如圖I所示，I為AE Van株；2為AE 19株；3為AE Wl株；4為 AE W2株；5為AE 1163株；6為雞馬立克氏病(MDV)株；7為雞傳染性支氣管炎病毒(Mass 41) ;8為雞傳染性喉氣管炎病毒(北京株)；9為禽呼腸孤病毒(S1133) ;10為禽巴氏桿菌 (C48-1) ;11為雞毒霉形體(MG) ;12為雞新城疫病毒(Lasota) ;13為陰性對(duì)照，可以看出， AE Van株、AE 19株、AE Wl株、AE W2株、AE 1163株檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果(可見光下顯示翠綠色)，而對(duì)雞馬立克氏病(MDV)株、雞傳染性支氣管炎病毒(Mass 41)、雞傳染性喉氣管炎病毒(北京株)、禽呼腸孤病毒(S1133)、禽巴氏桿菌(C48-1)、雞毒霉形體(MG)、雞新城疫病毒(Lasota)的檢測(cè)均為陰性(可見光下顯示淡桔紅色)。在紫外光下判斷，結(jié)果與上述可見光判斷結(jié)果一致。說(shuō)明引物及檢測(cè)方法用于檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒的特異性高。因此，上述引物及判斷標(biāo)準(zhǔn)可用來(lái)判斷未知樣本是否含有禽腦脊髓炎病毒。2、禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)將禽腦脊髓炎病毒AE Van株的RNA按10倍遞增稀釋成10ng/ul、lng/ul、100p g/ul、10pg/ul、lpg/ul、100fg/ul、10fg/ul、lfg/ul,然后按照上述I的體系和反應(yīng)程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，肉眼觀察結(jié)果如圖 2 所示，I lng/ul ；2 100pg/ul ；3 10pg/ul ；4 lpg/ul ；5 100fg/ ul ；6 10fg/ul ；7 :lfg/ul，可以看出，1-5為翠綠色，6-7為桔紅色，禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測(cè)方法的檢測(cè)限為lOOfg/ul。用常規(guī)的RT-PCR進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，具體如下在50ul 的反應(yīng)體系中含 25mM MgCl2 2. 5ul, 10XPCR buffer 5ul, IOmM dNTPs 2ul，Taq 聚合酶(5U)0. 5ul，AMV(5U) I μ L，RI (40U) I μ L，上游弓丨物 5-CTTATGCTGGCCCTGATCGT-3 和下游引物 5-TCCCAAATCCACAAACCTAGCC-3 各 lul，禽腦脊髓炎病毒AE Van株的RNA按10倍遞增作為模板lul，35ul雙蒸水。擴(kuò)增程序?yàn)?2V 45分鐘， 94°C變性2分鐘，然后進(jìn)入94°C變性I分鐘，62°C退火I分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后再經(jīng) 62°C延伸10分鐘。結(jié)果如圖3 所示，I 100ng/ul ；2 10ng/ul ；3 lng/ul ；4 100pg/ul ；5 10pg/ul ； 6 lpg/ul ；7 100fg/ul, 1-5得到619bp的PCR產(chǎn)物(經(jīng)過(guò)測(cè)序，為禽腦脊髓炎病毒Van株 VP2基因genbank號(hào)為AY517471的第570-1187位核苷酸)，檢測(cè)限為10pg/ul?？梢钥闯?，禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測(cè)方法的檢測(cè)限為IOOfg/ul，而常規(guī)RT-PCR的檢測(cè)限為10pg/ul，RT-LAMP方法敏感性比常規(guī)RT-PCR高100倍。實(shí)施例3、禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)I、臨床組織樣品中RNA的提取A.分別取臨床編號(hào)為17、23、45、116的雞(7日齡的麻雞，出現(xiàn)頭部震顫，四肢運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀)腦組織5g，用碾磨磨碎后加入，反復(fù)凍融3次，10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集 IOOul上清液，加入900ul Trizol液后，劇烈混勻，室溫(25°C )放置IOmin ；B.加入200ul氯仿，劇烈混勻，室溫放置5min ；C. 12000 Xg 離心 15min ；D.收集500ul上清，加入500ul異丙醇，混勻，室溫放置IOmin ；E. 12000X g 離心 15min,去上清,加入 IOOOul 75% 乙醇，12000X g 離心 15min,去
上清；F.在超凈臺(tái)內(nèi)用自然干燥IOmin后加入20ul DEPC H2O溶解，即為待檢RAN，_20°C 保持備用，得到編號(hào)為17、23、45、116的待檢RNA。2、禽腦脊髓炎病毒LAMP反應(yīng)對(duì)臨床樣品檢測(cè)分別以上述I編號(hào)為17、23、45、116的待檢RNA為模板，按照實(shí)施例2的I中的 LAMP反應(yīng)體系和LAMP反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)。以AE Van株的RNA為陽(yáng)性對(duì)照，以正常雞腦組織的RNA為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖4所示，I AE Van株陽(yáng)性對(duì)照；2 :編號(hào)為17雞腦樣品；3 :編號(hào)為23雞腦樣品；4 :編號(hào)為45雞腦樣品45 ；5 :編號(hào)為116雞腦樣品；6 :陰性對(duì)照，通過(guò)肉眼直接觀察結(jié)果，1-3為翠綠色,4-6為淡桔紅色,因此說(shuō)明雞腦樣品17和23含有禽腦脊髓炎病毒。采用實(shí)施例2的2中的常規(guī)的RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，模板分別為編號(hào)為17雞腦樣品的RNA、編號(hào)為23雞腦樣品的RNA、編號(hào)為45雞腦樣品的RNA、編號(hào)為116雞腦樣品的RNA， 結(jié)果為編號(hào)為17雞腦樣品和編號(hào)為23雞腦樣品的RNA、均得到619bp的PCR產(chǎn)物(經(jīng)過(guò)測(cè)序，為禽腦脊髓炎病毒Van株VP2基因genbank號(hào)為AY517471的第570-1187，而編號(hào)為45雞腦樣品的RNA、編號(hào)為116雞腦樣品的RNA沒(méi)有該大小的目的片段。因此，說(shuō)明本方法正確。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物組，其特征在于所述引物組還包括引物5和引物6，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列5和序列6 ；所述弓I物組由所述弓I物I、所述弓I物2、所述弓I物3、所述弓I物4、所述弓I物5和所述弓I物 6組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的引物組，其特征在于所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比為7 5-8.5 7. 5-8. 5 15-17 15-17 7. 5-8. 5 7. 5-8. 5 ;所述引物 I、所述引物2、所述引物 3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比進(jìn)一步具體為8 : 8 : 16 : 16 : 8 : 8。
4.檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，由權(quán)利要求1-3中任一所述的引物組、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、抑制劑、DNA聚合酶、dNTPs、硫酸鎂、甜菜堿、鈣黃綠素、氯化錳和水組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，其特征在于所述弓丨物組中的弓丨物I在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述弓丨物組中的弓丨物2在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述引物組中的弓丨物3在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為15u nDl/yL-17u hdI/uL；所述引物組中的弓丨物4在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為15u nDl/yL-17u hdI/uL； 所述弓丨物組中的弓丨物5在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述弓丨物組中的弓丨物6在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度為7. 5u π /μ L-8. 5u ncl/yL； 所述引物組中的引物I在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為8umol/y L ； 所述引物組中的引物2在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為Sumol/μ L ； 所述引物組中的引物3在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為16umol/y L ； 所述引物組中的引物4在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為16umol/y L ； 所述引物組中的引物5在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為Sumol/μ L ； 所述引物組中的引物6在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為Sumol/
6.檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，包括權(quán)利要求1-3中任一所述的引物組或權(quán)利要求4或5所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑。
7.權(quán)利要求1-3中任一所述的引物組或權(quán)利要求4或5所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或權(quán)利要求6所述試劑盒在制備檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有禽腦脊髓炎病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于所述檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有禽腦脊髓炎病毒為用權(quán)利要求1-3中任一所述的引物組或權(quán)利要求4或5所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或權(quán)利要求6所述試劑盒對(duì)所述待測(cè)樣品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；所述反應(yīng)的模板具體為待測(cè)樣品的RNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種禽腦脊髓炎病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的引物組，包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。所述引物組還包括引物5和引物6，所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列5和序列6；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強(qiáng)，且比PCR檢測(cè)方法有更高的靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需要普通的水浴鍋即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳來(lái)觀察，簡(jiǎn)單而快速，特別適用于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)禽腦脊髓炎病毒。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102586486SQ20121006850
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者劉加波, 龐耀珊, 范晴, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所