專利名稱：鵝過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是鵝過氧化物酶體增殖物激活受體PPAR Y基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其在畜禽育種中的應用。
背景技術：
基因突變是指基因的核苷酸順序或數(shù)目發(fā)生改變。涉及DNA分子中單個堿基改變者稱為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP),包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等。目前對SNP進行檢測的方法較多，而大多數(shù)實驗室采用的是成本相對較低、技術易掌握、檢出率較高和操作步驟簡單的PCR-SSCP技術。該方法原理經(jīng)PCR擴增的DNA片段在變性劑(如甲酰胺)或低離子濃度下經(jīng)高溫處理使之解鏈并保持在DNA單鏈狀態(tài)下，然后在一定濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構象。在非變性條件下，DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構的構象，這種構象由DNA單鏈堿基決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用(主要為氫鍵)來維持。相同長度的DNA單鏈其順序不同，甚至單個堿基不同，所形成的構象不同，電泳遷移率也不同，PCR產(chǎn)物變性后，單鏈產(chǎn)物經(jīng)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，因靶DNA中發(fā)生單堿基置換，或個別堿基插入或缺失時，因遷移產(chǎn)生變化會出現(xiàn)泳動變位，從而可將變異DNA與正常DNA區(qū)分開。相同長度的單鏈DNA因其順序不同或單個堿基差異，所形成的構象就會不同，其在凝膠中泳動速度不一樣，從而顯示出帶型的差異，即多態(tài)型。PPARy是過氧化物酶體增殖物激活受體家族(PPARs)的成員之一。是一種由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于II型核受體超家族成員，是影響脂肪細胞分化、內(nèi)分泌功能的重要調(diào)節(jié)因子，是噻唑烷二酮類藥物(TZDs)作用的靶分子，TZDs通過與PPAR Y結(jié)合而發(fā)揮降低血糖、血脂及增加胰島素敏感性的作用，人的PPARy基因常見的多態(tài)與胰島素敏感性、肥胖和心血管發(fā)病有關。常見多態(tài)Prol2Ala變異即使對肥胖有作用，需要與其他基因的相互作用表現(xiàn)出來，如Prol2Ala與0腎上腺素能受體(P 3-adrenergic receptor, BAR3)基因的Trp64Arg突變的相互作用，在墨西哥美國人中PPAR Y Ala等位基因攜帶者比Pro個體更肥胖，但這些個體需攜帶BAR3Arg64等位基因[1]。PPARy在脂肪和免疫器官表達。PPARy過表達可以誘導成纖維細胞和脂肪細胞間的轉(zhuǎn)化，與C/EBP a協(xié)同作用，可以誘導成肌細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化。孟和等已經(jīng)克隆出鵝PPAR Y基因的⑶S區(qū)，并證實基因在肝臟和肌肉中無表達，高表達于脂肪，其次是腦和腎臟，低量表達于脾臟、心臟、肺臟、胃和小腸。王娉等構建PPARy基因的真核表達載體免疫小鼠使其產(chǎn)生抗體，獲得的重組蛋白和抗血清。蘇勝彥等研究朗德鵝填飼后不同組織PPAR Y基因表達量差異結(jié)果顯示，肝臟組織中， 填飼組PPARy基因表達量極顯著高于對照組中該基因的表達量(P < 0.01)，且表達量與肝臟指數(shù)、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量呈顯著正相關(P < 0. 05)，說明肝臟、皮下脂肪、腹脂組織PPARy基因的表達水平與朗德鵝肥肝形成有一定的關系。韓清等構建了雞PPARy基因5’側(cè)翼區(qū)的3個多態(tài)性位點單倍型，證明對雞脂肪性狀和骨骼性狀有一定的影響[5]。PPARy可由多種脂肪酸及其衍生物激活，是脂肪細胞分化、脂質(zhì)代謝重要調(diào)節(jié)因子。Koutnikova等研究表明，肌肉中PPARy主要負責協(xié)調(diào)能量利用，而不是單純的控制糖穩(wěn)態(tài)或胰島素敏感性。Verma等證實PPAR y對肌肉分化有調(diào)節(jié)作用，PPAR y活性對C2C12肌細胞分化具有重要作用，上調(diào) 和下調(diào)PPAR Y蛋白水平均能抑制肌細胞分化。Cock等證實在脂肪組織中抑制PPARy表達，可以抑制間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)向脂肪細胞分化，促進MSC向成骨干細胞分化，進一步研究發(fā)現(xiàn)可能是由于PPARy表達量下降，限制了脂肪細胞分泌瘦素等抗成骨信號因子的能力，從而提高骨骼強度并增加骨量。迄今為止，國內(nèi)外均未見鵝PPAR Y基因遺傳變異的研究，由于中國地方鵝PPAR Y基因遺傳變異領域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與屠宰性狀(如屠體重、胸肌重、腿肌重等)關聯(lián)的研究仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種鵝過氧化物酶體增殖物激活受體PPAR Y基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其本發(fā)明的技術方案如下一種鵝過氧化物酶體增殖物激活受體PPAR Y基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，包括提取鵝血樣基因組DNA，對基因組DNA進行PCR擴增，使用的上游引物序列為CCAITTGTTAITTATGACATGAACT，下游引物序列為GATCAITCAGGTCAAGAITCACA，PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)雙向測序鑒定后，與NCBI公布的序列進行比較發(fā)現(xiàn)存在A/G多態(tài)性。所述的檢測方法，其中PCR擴增體系2 X Taq PCR MasterMix 5 U L, ddH20
3.6 u LUOpmol/u L 引物各 0. 3 u L,50ng/mL 模板 DNA0. 8 u L ;PCR 擴增參數(shù)94°C 4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ；35 個循環(huán)，72°C 8min。所述的檢測方法，PCR擴增片段長度為205bp。鵝PPAR Y基因位點A/G多態(tài)性在畜禽育種中的應用，用于篩選屠宰性能高的鵝。采用上述方案，本發(fā)明利用PCR-SSCP技術檢測鵝PPAR Y基因的多態(tài)性，并將其與屠宰性狀進行關聯(lián)分析，驗證表明其可以作為鵝分子育種中輔助選擇的分子標記。檢測鵝PPAR y編碼區(qū)存在I個SNP，呈現(xiàn)兩種基因型(AA、AG)，對浙東白鵝腿肌率的遺傳效應達到顯著水平(P < 0. 05)，AG基因型個體的腿肌率顯著地高于AA型個體。選出的單核苷酸多態(tài)性位點可以輔于育種，從而加快畜禽育種進程。。


圖I :PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；圖2 :PCR擴增產(chǎn)物的測序圖；圖3 =PCR擴增產(chǎn)物的SSCP電泳圖。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
(I)特定引物的設計
針對鵝PPARY基因發(fā)生密碼子突變而可能引起剪接位點的活性進而影響基因功能的單核苷酸多態(tài)性，以NCBI公布的鵝序列(Gene ID AF481798. I)為參考，利用Primer5. O設計PCR引物，其引物序列為上游引物CCATTTGTTATTTATGACATGAACT，下游引物GATCATTCAGGTCAAGATTCACA。擴增片段長度為205bp。對浙東白鵝的血樣提取DNA為模板，應用該對引物進行擴增，得到與目的片段大小一致的片段(圖1)，經(jīng)雙向測序鑒定后，與NCBI公布的序列進行比較發(fā)現(xiàn)存在A/G多態(tài)性。(2)鵝樣本的采集以浙東白鵝為檢測對象，具體采集樣本見下表。
品種樣品數(shù)樣品名稱樣品來源采樣方式
浙東白鵝I 172個 I血樣上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所翅下靜脈采血(3)鵝血樣基因組DNA的提?、倮鋬鲅涸谑覝厝诨院?，取150 μ L移至離心管中，加入100 μ L鹽酸胍緩沖液(O. 47g/ml)和 400 μ L 裂解液(Tris 堿 O. 6057g ；Nacl 4. 383g ；EDTA 0. 29225g ；SDS 5g ;定容至500ml，NaOH調(diào)pH值至8· 0)，加入20 μ L蛋白酶K (濃度為100mg/mL)，上下顛倒試管充分混合，55 °C水浴過夜。②加入600 μ L氯仿抽提兩次,每次振蕩混勻15min, 12000r/min。③取上清至另一潔凈離心管中，加入等體積異丙醇,沉淀數(shù)小時,4°C，12000r/min離心15分鐘，棄上清。④取上清，加入2倍體積的預冷_20°C冰乙醇洗滌沉淀DNA。⑤將DNA置于室溫下自然風干干燥(注意不能太干燥)，根據(jù)沉淀的量加入適量(100-200 μ L) TE (ρΗ8. O)緩沖液溶解，置4°C冰箱溶解過夜；溶解后的DNA可貯于_20°C中備用。(4) DNA濃度和純度的檢測用I. 2 %的瓊脂糖凝膠檢測總DNA，并用DNA定量儀測定濃度及純度。①瓊脂糖凝膠電泳檢測取5 μ L待測DNA溶液和I μ L溴酚藍置入混勻，上樣于I. 2%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測，觀察電泳條帶，無明顯拖尾，條帶明亮則符合實驗要求。②分光光度法測定取6 μ L待測DNA溶液稀釋500倍至3mL，分別在紫外分光光度計260nm和280nm處測定OD值。DNA 濃度(ul/ml) = 0D260X 稀釋倍數(shù) X 50 ；DNA 純度=0D260/0D280 ；(5) PCR 擴增PCR 擴增體系2XTaq PCR MasterMix 5 μ L、ddH20 3· 6 μ L、引物(lOpmol/μ L)各 O. 3μ L、模板 DNA(50ng/mL)0. 8μ Lo PCR 擴增參數(shù):94 °C 4min ；94 °C 30s, 55 °C 30s,72°C Imin ；35 個循環(huán)，72°C 8min。(6)電泳及基因型判定和測序圖將擴增產(chǎn)物99°C變性5min后于12%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，電泳完畢后進行硝酸銀染色拍照。根據(jù)電泳結(jié)果直接判定個體基因型，引物的擴增產(chǎn)物在12%的聚丙烯酰胺凝膠上分別呈現(xiàn)兩種帶型，見圖2、圖3。(7)鵝PPAR Y基因SNP位點的基因和基因型頻率統(tǒng)計分析①基因型頻率指一個群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。由于PCR-SSCP方法的檢測結(jié)果為共顯性等位基因，因此，表型頻率即為基因型頻率。基因型頻率=基因型個數(shù)/檢測群體總數(shù)②等位基因頻率記為Pi，表示在一個群體中某一等位基因的數(shù)量與占據(jù)同一基因座位的全部等位基因總數(shù)的比例，取值0-1之間。Pi = [2(ii) + (ijl) + (ij2)+......(ijn)]/2NPi :第i個等位基因的頻率i :純合復等位基因jl、j2、......jn :與i共顯的第I到第η個等位基因計算PPARy基因不同位點的基因型頻率和等位基因頻率，結(jié)果見表。SNP的AA基因型和A等位基因頻率明顯聞于AG基因型和G等位基因。表PPAR Y基因各位點在浙東白鵝群體中的基因型和基因頻率
權利要求
1.一種鵝過氧化物酶體增殖物激活受體PPAR y基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于，包括提取鵝血樣基因組DNA，對基因組DNA進行PCR擴增，使用的上游引物序列為CCAITTGTTAITTATGACATGAACT，下游引物序列為GATCAITCAGGTCAAGAITCACA，PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)雙向測序鑒定后，與NCBI公布的序列進行比較發(fā)現(xiàn)存在A/G多態(tài)性。
2.根據(jù)權利要求I所述的檢測方法，其特征在于，其中PCR擴增體系2XTaqPCRMasterMix 5 u L, ddH20 3. 6 u LUOpmol/u L 引物各 0. 3 y L、50ng/mL 模板 DNA0. 8 y L ；PCR擴增參數(shù)94°C 4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ;35 個循環(huán)，72°C 8min。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，PCR擴增片段長度為205bp。
4.鵝PPARy基因位點A/G多態(tài)性在畜禽育種中的應用，用于篩選屠宰性能高的鵝。
全文摘要
本發(fā)明公開了鵝過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ基因的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其在畜禽育種中的應用，包括提取鵝血樣基因組DNA，對基因組DNA進行PCR擴增，使用的上游引物序列為CCATTTGTTATTTATGACATGAACT，下游引物序列為GATCATTCAGGTCAAGATTCACA；PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)雙向測序鑒定后，與NCBI公布的序列進行比較發(fā)現(xiàn)存在A/G多態(tài)性。檢測鵝PPAR γ編碼區(qū)存在1個SNP，呈現(xiàn)兩種基因型(AA、AG)，對浙東白鵝腿肌率的遺傳效應達到顯著水平(P＜0.05)，AG基因型個體的腿肌率顯著地高于AA型個體。選出的單核苷酸多態(tài)性位點可以輔于育種，從而加快畜禽育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK102643900SQ20121007128
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月19日 優(yōu)先權日2012年3月19日
發(fā)明者何大乾, 劉毅, 吳華莉, 朱慶, 胡耀東 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院