專利名稱：治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)醫(yī)藥生物工程與技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵エ藝。
背景技術(shù)：
單克隆抗體(抗體類)藥物靶向性強(qiáng)，副作用低，療效顯著，目前廣泛用于腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，并產(chǎn)生了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。在2011年，全球抗體類藥物銷售額突破400億美元。在銷售額排名前10位的生物技術(shù)藥物中，抗體藥物共6個(gè)，且前5個(gè)藥物均為治療性抗體。單克隆抗體從最初的鼠源性單抗歷經(jīng)嵌合單抗、人源化單抗， 目前已經(jīng)發(fā)展到全人源單抗和全人源抗體片段階段。全人源單抗因其不含有鼠源性成分， 在臨床應(yīng)用上安全性更高、療效顯著，受到國(guó)內(nèi)外單克隆抗體研制単位的高度重視。目前全球已經(jīng)批準(zhǔn)20個(gè)以上的全人源單抗，有100多種正在進(jìn)行臨床研究，全人源單抗成為治療用單克隆抗體研究開(kāi)發(fā)的主流和熱點(diǎn)。在中國(guó)，抗體藥物產(chǎn)業(yè)發(fā)展相對(duì)落后，主要表現(xiàn)為原創(chuàng)性抗體藥物品種不足和哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)核心技術(shù)如細(xì)胞密度、抗體表達(dá)量等總體水平落后。限制中國(guó)治療性抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題為1)基礎(chǔ)研究起點(diǎn)低治療性抗體研發(fā)力量薄弱，少有具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的候選抗體，尤其是在抗體篩選的技術(shù)平臺(tái)方面沒(méi)有自主創(chuàng)新；2)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)/基礎(chǔ)差大量生產(chǎn)抗體的動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)仍然處發(fā)展階段。人們目前解決這些問(wèn)題的方法集中在研發(fā)哺乳細(xì)胞大規(guī)模エ業(yè)培養(yǎng)技術(shù)(設(shè)備和過(guò)程エ藝)。但是，或許是仰慕于世界范圍內(nèi)15年來(lái)人源化單克隆全分子抗體的巨大成功， 人們過(guò)多的關(guān)注在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的全分子單克隆抗體。但是世界治療性抗體技術(shù)在本世紀(jì)的飛速發(fā)展為中國(guó)解決在中國(guó)發(fā)展治療性抗體產(chǎn)業(yè)提供了另ー個(gè)切實(shí)可行的新方法和機(jī)遇，這就是治療性抗體片段分子藥物的開(kāi)發(fā)。人源化抗體可變區(qū)片段的優(yōu)點(diǎn)是(I)它是較小的抗體有效結(jié)合部位(VL和VH)， 分子量只有全抗體分子的1/5 - 1/10; (2)可以有效地在大腸桿菌、酵母菌、哺乳細(xì)胞等多個(gè)表達(dá)體系內(nèi)進(jìn)行較高水平和高質(zhì)量的可溶性表達(dá)；(3)由于其分子小，它的穩(wěn)定性優(yōu)于全分子抗體，這個(gè)特性可以簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程的下游純化；(4)由于其分子小，它可以發(fā)展多種劑型，比如注射劑、吸入劑、ロ服劑等，同時(shí)它還可以進(jìn)入組織和細(xì)胞內(nèi)部作用與細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)，應(yīng)用范圍廣；(5)由于其分子量小，它的單位重量分子數(shù)是全分子抗體的5-10倍，因此單位劑量的抗體起作用效能遠(yuǎn)高于全分子抗體，進(jìn)而顯著降低用藥成本；(6)由于其分子量小，可以發(fā)展同時(shí)作用于兩個(gè)靶點(diǎn)的雙功能的治療性抗體，全分子抗體相對(duì)難以完成這個(gè)任務(wù)；(7)由于其分子量小，可以采用多種可能的延長(zhǎng)半衰期的技術(shù)方法并不增加表達(dá)的技術(shù)難度，等等。目前，在世界范圍內(nèi)，研究人員對(duì)大腸桿菌發(fā)酵制備治療性抗體或抗體片段ェ藝有廣泛的嘗試，但在治療性抗體或抗體片段的生產(chǎn)效率的提高上遇到諸多困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝，能夠高效地從大腸桿菌發(fā)酵體系中可溶性表達(dá)治療性抗體或抗體片段。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是一種治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝，包括如下步驟
(1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備在新鮮配制的含有IO-IOOmM四環(huán)素的盧波平板上均勻涂布大腸桿菌菌液，在37°C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取分散良好的大腸桿菌菌株，轉(zhuǎn)移至含有IO-IOOmM四環(huán)素的盧波培養(yǎng)基中，在37°C搖床培養(yǎng)16小時(shí)，最后將上述盧波培養(yǎng)基按I :10-1 :1000的接種比例接種到IOOmf IOOOml的盧波培養(yǎng)基中，在37°C搖床培養(yǎng)8小時(shí)；
(2)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)液的制備
培養(yǎng)基的制備將酵母提取物35-55g、蛋白胨25-50g、磷酸二氫鉀l_5g、磷酸氫二鉀 10_50g、抗生素I μ g-lmg、消泡劑100-500 μ mol,均勻混合,加入O. 6L的水，室溫下攪拌 30min至液體澄清，然后加入甘油10-90g，室溫?cái)嚢鑜Omin，待混合均勻，繼續(xù)加入水為IL溶液，然后使用25%氨水或35%磷酸調(diào)整pH至6-8，在100-120°C高壓滅菌20分鐘；
流加培養(yǎng)液的制備將酵母菌提取物50-100g、硫酸銨IO-IOOg,均勻混合，加入0. 6L 水,室溫下攪拌30分鐘至液體澄清，然后加入甘油400-800g,室溫?cái)嚢?0分鐘，待混合均勻，補(bǔ)水至1L，在100-120°C高壓滅菌20分鐘。(3)發(fā)酵在發(fā)酵罐中填充培養(yǎng)基，當(dāng)溫度為25_35°C后，按照1:100的接種比例接種IOOml的吸光度八_為1-2的大腸桿菌菌種到10L發(fā)酵罐中，同時(shí)加入四環(huán)素，發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為溫度 T=25-37°C，酸堿度 ρΗ=6· 0-7. 5，轉(zhuǎn)速 S=500rpm-1400rpm，通氣量為 V=l_5vvm， 發(fā)酵12-15h后，發(fā)酵液中溶氧(DOT)出現(xiàn)顯著波動(dòng)時(shí)，開(kāi)始流加培養(yǎng)液，流速為50-200ml/ h，發(fā)酵到16 20小時(shí)后加入誘導(dǎo)素；調(diào)整發(fā)酵溫度至T=20-25°C，流加速度調(diào)整為25_50ml/ ho發(fā)酵進(jìn)行到60-90小時(shí)后收集發(fā)酵液，清洗罐體，結(jié)束發(fā)酵。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的培養(yǎng)基的組成為酵母提取物35-55g、蛋白胨 25-50g、磷酸二氫鉀l_5g、磷酸氫二鉀10-50g、抗生素、消泡劑100-500 μ mol、甘油10_90g、 水 0.9-1L。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的流加培養(yǎng)液的制備是酵母菌提取物50-100g、 硫酸銨 IO-IOOg,甘油 400-800g、水 0. 6-1L。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的抗生素為四環(huán)素、卡那霉素或羧芐青霉素中的一種。
在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的治療性抗體或抗體片段是指功能基團(tuán)抗體、片段抗體、單鏈抗體或納米抗體中的一種。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的治療性抗體是單鏈抗體中的一種。在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述的大腸桿菌是指腸桿菌科埃希氏菌屬的埃希氏菌及其亞種。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)液能充分滿足大腸桿菌在發(fā)酵過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)要求，而且有效控制了發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)，采用本發(fā)明的發(fā)酵工藝， 可高效從大腸桿菌發(fā)酵體系中可溶性表達(dá)制備治療性抗體分子，有效降低治療性抗體的生產(chǎn)成本，具有獨(dú)特的創(chuàng)新性，其產(chǎn)品可以滿足醫(yī)藥，科研和臨床診斷對(duì)相關(guān)人源化抗體產(chǎn)品的需求。


圖I是SDS-PAGE法檢測(cè)發(fā)酵反應(yīng)生成的治療性單鏈治療性抗體的電泳圖，I、蛋白質(zhì)分子量marker ;2、誘導(dǎo)前上清液#I ;3、誘導(dǎo)前上清#2 ;4、誘導(dǎo)前上清#3 ;5、發(fā)酵上清液；
6、發(fā)酵胞質(zhì)空間組分I ;7、發(fā)酵胞質(zhì)空間組分II ;8、1.0 8/1標(biāo)準(zhǔn)品；9、1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)品； 10、1.0 g/L 標(biāo)準(zhǔn)品；
圖2是誘導(dǎo)前發(fā)酵上清液和誘導(dǎo)后發(fā)酵上清液的免疫印跡檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果圖3是SDS-PAGE法檢測(cè)發(fā)酵反應(yīng)生成的片段抗體電泳圖，M、蛋白質(zhì)分子量marker ;1、 誘導(dǎo)后上清液；2、誘導(dǎo)前上清液；3、52kD片段抗體純化結(jié)果；
圖4是SDS-PAGE法檢測(cè)發(fā)酵反應(yīng)生成的功能基團(tuán)抗體電泳圖，M、蛋白質(zhì)分子量 marker ;1、誘導(dǎo)前菌體總蛋白；2、誘導(dǎo)后菌體總蛋白；3、總蛋白過(guò)層析柱后流出樣品。4-12 純化19kD功能基團(tuán)抗體；
圖5是SDS-PAGE法檢測(cè)發(fā)酵反應(yīng)生成的納米抗體電泳圖，I、Marker ;2、標(biāo)準(zhǔn)品(lg/ L) ； 3、標(biāo)準(zhǔn)品(0. 5g/L) ； 4、誘導(dǎo)前上清液；5、誘導(dǎo)前胞質(zhì)空間組分I ;6、誘導(dǎo)前胞質(zhì)空間組分II ;7、誘導(dǎo)后發(fā)酵上清；8，誘導(dǎo)后胞質(zhì)空間I組分；9誘導(dǎo)前胞質(zhì)空間II組分。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的大腸桿菌菌種來(lái)源為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)。實(shí)施例I 單鏈治療性抗體(Single Chain Antibody Fragment, scFv)
(I)囷種制備
在新鮮配制的含有四環(huán)素的盧波(Luria Broth, LB)平板上均勻涂布大腸桿菌菌液， 37°C培養(yǎng)16小吋。挑取分散良好的大腸桿菌菌株，在LB含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)，16小時(shí)。將上述過(guò)夜培養(yǎng)的I :100接種到200ml的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)8小時(shí)左右作為發(fā)酵菌種使用。(2)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)液的制備
培養(yǎng)基的制備將酵母提取物35-55g、蛋白胨25-50g、磷酸ニ氫鉀l_5g、磷酸氫ニ 鉀10g-50g、抗生素Iii g-lmg、消泡劑100-500ii L，均勻混合，加入0. 6L的水，室溫下攪拌 30min至液體澄清，然后加入甘油10-90g，室溫?cái)嚢鑜Omin，待混合均勻，繼續(xù)加入水為IL溶液，然后使用25%氨水或35%磷酸調(diào)整pH至6-8，在100_120°C高壓滅菌20分鐘；
流加培養(yǎng)液的制備將酵母菌提取物50-100g、硫酸銨IO-IOOg,均勻混合，加入0. 6L 水,室溫下攪拌30分鐘至液體澄清，然后加入甘油400-800g,室溫?cái)嚢?0分鐘，待混合均勻，補(bǔ)水至1L，在100-120°C高壓滅菌20分鐘。(3)發(fā)酵
在發(fā)酵罐中填充培養(yǎng)基，當(dāng)溫度為30°C后，接種200ml吸光濃度A6tltl=I的大腸桿菌菌種到20L發(fā)酵罐中，同時(shí)加入四環(huán)素，將接種時(shí)間記錄為發(fā)酵時(shí)間的開(kāi)始，發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為溫度 T=25°C _37°C，酸堿度 pH=6. 0-7. 5 轉(zhuǎn)速 S=500rpm_1400rpm，通氣量為 V=l_5vvm。 發(fā)酵12-15h發(fā)酵液中溶氧(DOT)出現(xiàn)顯著波動(dòng)時(shí)，開(kāi)始流加加入營(yíng)養(yǎng)液，流速為50-200ml/ ho發(fā)酵16-20小時(shí)后加入lmol/L的誘導(dǎo)素，到終濃度為0. ImM-IOmM,同時(shí)調(diào)整發(fā)酵溫度T=20-25°C°C，流加速度為25-50ml/h。發(fā)酵進(jìn)行期間測(cè)定發(fā)酵液A600處吸光值用于判斷菌體擴(kuò)增情況。發(fā)酵進(jìn)行到80小時(shí)后收集發(fā)酵液，清洗罐體,結(jié)束發(fā)酵。(4)發(fā)酵液處理
發(fā)酵液采用滲透壓沖擊法處理釋放目的蛋白，分別將誘導(dǎo)前發(fā)酵液#1、誘導(dǎo)前發(fā)酵液#2、誘導(dǎo)前發(fā)酵液#3和誘導(dǎo)后發(fā)酵液，經(jīng)5000rpm離心處理60分鐘后分別收集誘導(dǎo)前發(fā)酵上清液#1、誘導(dǎo)前發(fā)酵上清液#2、誘導(dǎo)前發(fā)酵上清液#3和誘導(dǎo)后上清液，誘導(dǎo)后上清液使用蔗糖、乙二胺四乙酸緩沖液重懸沉淀菌體，靜置16小時(shí)后按照再次離心。收集離心發(fā)酵胞質(zhì)空間組分0SI，并使用ImM鎂離子溶液重新懸沉淀，4°C震蕩過(guò)夜。再次離心，棄去菌體，收集發(fā)酵胞質(zhì)空間組分0SII。(5)抗體純化
蛋白純化采用陽(yáng)離子交換預(yù)裝柱進(jìn)行純化。樣品準(zhǔn)備將誘導(dǎo)前發(fā)酵液#1、誘導(dǎo)前發(fā)酵液#2、誘導(dǎo)前發(fā)酵液#3、誘導(dǎo)后上清液與發(fā)酵胞質(zhì)空間組分OSII和發(fā)酵胞質(zhì)空間組分 OSII經(jīng)1:50稀釋后，高速離心30min，分別取上清對(duì)O. 02mM的PB柱透析過(guò)夜，隨后對(duì)蛋白溶液進(jìn)行12000rp，4°C離心30分鐘，再經(jīng)O. 22 μ m的濾膜過(guò)濾；每個(gè)CMM預(yù)裝離子交換柱使用O. OlmM PB緩沖液平衡，采用10倍體積O. 02mM的PB平衡柱子洗脫雜蛋白至A28tl檢測(cè)線與基線平行；使用精氨酸鹽緩沖液分步洗脫；同時(shí)檢測(cè)洗脫蛋白量(A28tl)收集各部分蛋白并在濃縮后通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)。(6)檢測(cè)結(jié)果
經(jīng)過(guò)80小時(shí)的發(fā)酵反應(yīng)，按照上述參數(shù)控制嚴(yán)格發(fā)酵工藝流程。發(fā)酵過(guò)程中將16小時(shí)，48小時(shí)，64小時(shí)，72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的菌液樣本濃度進(jìn)行檢測(cè)，獲得A_處吸光度分別為 70.0, 82.8，130，99.8。發(fā)酵液經(jīng)滲透壓沖擊處理，分成誘導(dǎo)前發(fā)酵液#1、誘導(dǎo)前發(fā)酵液#2、誘導(dǎo)前發(fā)酵液#3、誘導(dǎo)后上清液與發(fā)酵胞質(zhì)空間組分OSII和發(fā)酵胞質(zhì)空間組分0SII，同時(shí)取I. Og/L,
0.5 g/L, O. 25 g/L標(biāo)準(zhǔn)品，利用12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)各個(gè)組分中重組蛋白含量，電泳結(jié)果顯示抗體在誘導(dǎo)后上清液與發(fā)酵胞質(zhì)空間組分OSII和發(fā)酵胞質(zhì)空間組分OSII上清中均有高效表達(dá)(檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖I)。將收獲時(shí)發(fā)酵上清液(lane I)和誘導(dǎo)前發(fā)酵上清液(lane 2)的12% SDS-PAGE膠電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后使用HRP-protein A偶聯(lián)物檢測(cè)，通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光底物產(chǎn)生光信號(hào)，曝光底片。免疫印跡分析顯示所表達(dá)蛋白可以為protein-A所識(shí)別，指示其正確的抗體結(jié)構(gòu)(檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖2)。實(shí)施例2 片段抗體(Fragment Antibody, Fab)。本實(shí)施例前5步同實(shí)施例一前5步；
發(fā)酵液經(jīng)滲透壓沖擊處理，分成誘導(dǎo)前上清液，誘導(dǎo)后上清液和，52kD Fab純化結(jié)果利用12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)各個(gè)組分中重組蛋白含量，電泳結(jié)果顯示抗體在誘導(dǎo)后上清液與 52kD Fab純化結(jié)果中均有高效表達(dá)(檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖3)。實(shí)施例3 功能基團(tuán)抗體(Domain Antibody, dAb)。本實(shí)施例前5步同實(shí)施例一前5步，，表達(dá)結(jié)果和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖4?？贵w分子主要存在于培養(yǎng)上清內(nèi)
實(shí)施例 4 納米抗體(Single Domain Antibody, SdFv / Nanobody)本實(shí)施例的5步前操作基本上同實(shí)施例一的前5歩。大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)Nanobody的結(jié)果見(jiàn)附圖4,目標(biāo)抗體蛋白分子量為16kDa,所表達(dá)抗體分布于大腸桿菌培養(yǎng)液上清和細(xì)胞胞質(zhì)空間內(nèi)。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝，其特征在于，包括如下步驟(1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備在新鮮配制的含有IO-IOOmM四環(huán)素的盧波平板上均勻涂布大腸桿菌菌液，在37°C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取分散良好的大腸桿菌菌株，轉(zhuǎn)移至含有IO-IOOmM四環(huán)素的盧波培養(yǎng)基中，在37°C搖床培養(yǎng)16小時(shí)，最后將上述盧波培養(yǎng)基按I :10-1 :1000的接種比例接種到IOOmf IOOOml的盧波培養(yǎng)基中，在37°C搖床培養(yǎng)8小時(shí)；(2)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)液的制備培養(yǎng)基的制備將酵母提取物35-55g、蛋白胨25-50g、磷酸二氫鉀l_5g、磷酸氫二鉀 10_50g、抗生素I μ g-lmg、消泡劑100-500 μ mol,均勻混合,加入O. 6L的水，室溫下攪拌 30min至液體澄清，然后加入甘油10-90g，室溫?cái)嚢鑜Omin，待混合均勻，繼續(xù)加入水為IL溶液，然后使用25%氨水或35%磷酸調(diào)整pH至6-8，在100-120°C高壓滅菌20分鐘；流加培養(yǎng)液的制備將酵母菌提取物50-100g、硫酸銨IO-IOOg,均勻混合，加入0. 6L 水,室溫下攪拌30分鐘至液體澄清，然后加入甘油400-800g,室溫?cái)嚢?0分鐘，待混合均勻，補(bǔ)水至1L，在100-120°C高壓滅菌20分鐘。
2.(3)發(fā)酵在發(fā)酵罐中填充培養(yǎng)基，當(dāng)溫度為25-35°C后，按照1:100的接種比例接種IOOml的吸光度八_為1-2的大腸桿菌菌種到10L發(fā)酵罐中，同時(shí)加入四環(huán)素，發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為溫度 T=25-37°C，酸堿度 ρΗ=6· 0-7. 5，轉(zhuǎn)速 S=500rpm-1400rpm，通氣量為 V=l_5vvm， 發(fā)酵12-15h后，開(kāi)始流加培養(yǎng)液，流速為50-200ml/h，發(fā)酵到16 20小時(shí)后加入誘導(dǎo)素；調(diào)整發(fā)酵溫度至T=20-25°C，流加速度調(diào)整為25-50ml/h。
3.發(fā)酵進(jìn)行到60-90小時(shí)后收集發(fā)酵液，清洗罐體，結(jié)束發(fā)酵。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的培養(yǎng)基的組成為酵母提取物35-55g、蛋白胨25-50g、磷酸二氫鉀l_5g、磷酸氫二鉀 10-50g、抗生素、消泡劑 100-500 μ mol、甘油 10_90g、水 0. 9-1L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝， 其特征在于，所述的流加培養(yǎng)液的制備是酵母菌提取物50-100g、硫酸銨10-100g，甘油 400-800g、水 0.6-1L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的抗生素為四環(huán)素、卡那霉素或羧芐青霉素中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的治療性抗體或抗體片段是指功能基團(tuán)抗體、片段抗體、單鏈抗體或納米抗體中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的治療性抗體或抗體片段體是單鏈抗體中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的大腸桿菌是指腸桿菌科埃希氏菌屬的埃希氏菌及其亞種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種治療性抗體或抗體片段的高效大腸桿菌表達(dá)發(fā)酵工藝，步驟為(1)發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備；(2)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)液的制備；(3)發(fā)酵在發(fā)酵罐中填充培養(yǎng)基，當(dāng)溫度為25℃-35℃后，按照1:100的接種比例接種100ml的吸光度A600為1-2的大腸桿菌菌種到10L發(fā)酵罐中，同時(shí)加入四環(huán)素，進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵進(jìn)行到60-90小時(shí)后收集發(fā)酵液，清洗罐體，結(jié)束發(fā)酵。采用本發(fā)明的發(fā)酵工藝，可高效從大腸桿菌發(fā)酵體系中可溶性表達(dá)制備治療性抗體分子，有效降低治療性抗體的生產(chǎn)成本，具有獨(dú)特的創(chuàng)新性，其產(chǎn)品可以滿足醫(yī)藥，科研和臨床診斷對(duì)相關(guān)人源化抗體產(chǎn)品的需求。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102586368SQ201210074128
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者劉冰, 張芃芃, 楊冬, 楊艷坤, 龍泉 申請(qǐng)人:拜明(蘇州)生物技術(shù)有限公司