專利名稱：克隆虉草Actin基因的PCR引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及用于克隆薦草Actin基因的PCR引物及克隆薦草Actin基因的方法。
背景技術(shù)：
薦草(Phalaris arundinacea),別名草蘆、園草蘆，為禾本科薦草屬(Phalaris) 植物。因其具有較強的抗逆性和較高的產(chǎn)量及營養(yǎng)價值而被廣泛用于飼草、人工濕地植物、 造紙原料和生物質(zhì)能源等。薦草是禾本科多年生大型直立C3植物，根系強大具根狀莖，根系深度達3m以上。與其他禾本科牧草比較，薦草具有生物產(chǎn)量高、維護成本低、抗逆性強、 木質(zhì)纖維含量高、易于管理和收獲等特點，是可再生的能源，在北方氣候條件下可以栽培后連續(xù)收割10 12年，具有開發(fā)成生物質(zhì)能源的潛力。在芬蘭，約I %的農(nóng)作物區(qū)種植薦草。 芬蘭的農(nóng)業(yè)部和林業(yè)部官方制訂到2015年薦草栽培面積是現(xiàn)在5倍的目標，超過了現(xiàn)在油菜，馬鈴薯、甜菜、白菜型油菜的總面積。薦草育成品種相對較少，第一個薦草注冊品種是在 1946年由美國公布的“Ioreed”。目前已培育出十幾個栽培品種，我國目前通過國家牧草品種審定委員會審定的薦草新品種只有3個“通選7號”草蘆、“川草3號”薦草和威寧草蘆。 為了加快育種進程，育種工作者在傳統(tǒng)的育種基礎(chǔ)上，通過分子育種手段，可以縮短育種周期和加快育種的速度。實時定量PCR方法在植物的分子育種領(lǐng)域具有重要的作用。該方法是檢測低豐度 mRNA的敏感方法，通過比較不同樣本的RNA產(chǎn)量、質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別，獲得目標基因特異性表達的真正差異。通過定量的方法，可以進行目標基因檢測或診斷，基因劑量或拷貝數(shù)檢測和基因突變分析及多態(tài)性研究。但是，在應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測基因的表達量中，必須選擇合適的內(nèi)參基因進行校正和標準化。內(nèi)參基因在PCR擴增中的變化可以反映RNA數(shù)量、質(zhì)量和cDNA合成效率的變化。實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)能夠快速、精確的檢測樣品mRNA擴增效率和鑒定基因轉(zhuǎn)錄數(shù)量。在這種分析中最重要的問題是mRNA分離和反轉(zhuǎn)錄效率的變化引起的樣品間遺傳物質(zhì)數(shù)量變異。因此，需要內(nèi)參基因?qū)悠纷儺愡M行標準化。內(nèi)參基因是在假設(shè)表達恒定的基礎(chǔ)上，應(yīng)用實時定量PCR檢測目標基因mRNA 表達水平的標準化。有內(nèi)參基因作標定，便能對基因進行定量。肌動蛋白(Actin)是真核生物中普遍存在的ー種重要的蛋白質(zhì)，是構(gòu)成細胞骨架和肌肉肌小節(jié)的主要成分，執(zhí)行著重要的生理功能，如細胞分裂、細胞運動、細胞形狀變化、 內(nèi)吞作用、胞吐作用以及多種細胞運動，如頂端生長、細胞器運動、胞質(zhì)環(huán)流、花粉管生長等。高等動植物中，肌動蛋白都是由多基因編碼。不同生物肌動蛋白具有高度保守性，這些基因高度相似，通過多輪復(fù)制由ー個基因祖先進化而來。Actin基因在各種組織中恒定表達，是ー種廣泛參與真核細胞生理過程的管家基因，因而常被作為研究其它基因的表達模式及調(diào)控機制的分子內(nèi)標。迄今為止，已在許多高等植物，如水稻、玉米、小麥、大麥、谷子、 玉蘭、花生、堿蓬、胡蘿卜、大豆、霸王、擬南芥、煙草和向日葵等中克隆到了 Actin基因。然而，有關(guān)薦草Actin基因的研究尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于擴增薦草Actin基因的特異性引物；本發(fā)明目的還在于提供利用特異性引物克隆薦草Actin基因的方法。根據(jù)已經(jīng)在GenBank上登錄的薦草近源植物Actin基因的cDNA序列,其中主要包括水稻、玉米、星星草、黒麥草和羊草等序列。用DNAMAN軟件分析這些cDNA序列的保守區(qū)， 用Premier Primer 5. 0檢查引物的特異性及其他各項指標,設(shè)計引物,并由上海生工合成引物。在所設(shè)計的引物中篩選特異性好的弓I物對繼續(xù)做回收轉(zhuǎn)化和鏈接試驗。本發(fā)明提供的擴增薦草Actin基因的特異性引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1， SEQ ID NO. 2 所示。本發(fā)明提供了克隆薦草Actin基因的方法，包括以下步驟I)提取薦草總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；2)以步驟I)獲得的cDNA為模板，以SEQ ID No. 1,SEQ ID NO. 2所示的特異性引物對為引物進行PCR反應(yīng)；3)回收和純化PCR產(chǎn)物；4) PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞；5)進行藍白斑篩選和菌落PCR，鑒定陽性菌落；6)將陽性菌落擴大培養(yǎng)。本發(fā)明提供的克隆薦草Actin基因的方法還包括將擴大培養(yǎng)的陽性菌落進行序列測定。將PCR檢測為陽性克隆的菌落，搖菌培養(yǎng)，甘油保種，送交生物技術(shù)公司測序。同源性檢索分析通過在線BLAST軟件進行。獲得的薦草Actin基因片段為453bp，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所不。共編碼150個氨基酸序列。上述方法中步驟I)所述的薦草總RNA提取自薦草葉片組織。將步驟I)提取的薦草總RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用紫外分光光度計測定提取的RNA在260nm和280nm處的光吸收值，確定RNA的純度及濃度。將經(jīng)檢測合格并定量的總RNA保存在_80°C低溫冰箱中或直接用于反轉(zhuǎn)錄。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成。按反轉(zhuǎn)錄體系依次加入各種試劑，每步在冰浴中進行。在PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄，條件為42°C溫育50min，65°C加熱15min終止反應(yīng)，冰上冷卻。產(chǎn)物保存于_20°C備用。20 U I的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為
組分反應(yīng)體積總 RNAI^iL
OligO ( dT ) I^iL dNTP混合物 1ル 5 xRT Buffer 4[iL
RNA酶抑制劑 0.5ル 反轉(zhuǎn)錄酶I^iL
無 RNA 的 H2O 11.5^iL 總體積2OpL
4
步驟2)所述的PCR反應(yīng)，其25 U I的反應(yīng)體系為
正向引物IO^iM0.5(^1反向引物IO^iM0.5(^1PCR Mix12.50ddH2010.50cDNAl[jl總體積25 ^iLPCR的反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性4min，I個循環(huán)；94°C變性30s，50_57°C退火30s， 72 °C lmin，35 個循環(huán)；72°C 5min。RT-PCR反應(yīng)的退火溫度優(yōu)選為54. 5 °C。本發(fā)明提供了含有引物核苷酸序列為SEQ ID No. 1，SEQ ID NO. 2的試劑盒。本發(fā)明提供了上述方法克隆得到的薦草Actin基因。本發(fā)明提供了上述方法克隆得到的薦草Actin基因作為內(nèi)參基因的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述方法克隆得到的薦草Actin基因在分子遺傳育種領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種簡單、快捷、高效的獲取薦草Actin基因的方法。本發(fā)明設(shè)計的引物不會出現(xiàn)影響PCR反應(yīng)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物ニ聚體和上下游引物交聯(lián)，同時適宜的PCR反應(yīng)溫度范圍大(適宜的退火溫度在50-57°C之間)。本發(fā)明以薦草葉片為材料，用同源克隆的方法獲得了薦草Actin基因部分片段，填補了該基因在研究薦草上的空白，為進一歩研究薦草該基因奠定了基礎(chǔ)。同時，用該基因作為內(nèi)參基因，為其他基因在薦草的表達和調(diào)控的研究方面奠定基礎(chǔ)，在增大薦草基因信息量的同時，還可用于薦草的目標基因檢測或診斷，基因劑量或拷貝數(shù)檢測和基因突變分析及多態(tài)性研究，在薦草的轉(zhuǎn)基因育種和新品種選育等方面，具有很大的科學(xué)價值與應(yīng)用價值。既可以加快育種進程，為后續(xù)工作提供指導(dǎo)作用，又可以提高分子輔助育種的效率，縮短育種年限。


圖I為本發(fā)明克隆薦草Actin基因的流程圖。圖2為本發(fā)明引物PCR擴增薦草Actin基因的電泳圖譜，其中1_4和6_9泳道均為特異引物的PCR產(chǎn)物，泳道5為DNA Marker I。圖3為菌落PCR結(jié)果的電泳圖譜，其中1-4和6-9泳道均為特異引物的菌落PCR 產(chǎn)物，泳道5為DNA Marker I。
具體實施例方式以下實施例進ー步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例II、試驗材料的準備將薦草種子預(yù)冷滅菌處理，發(fā)芽后種在塑料花盆中。育苗30天，用于提取RNA。2、RNA 的抽提(I)稱取約0.2g薦草葉片，用液氮研磨成細粉，分裝于兩個1.5mL的EP管中(動作盡量迅速，避免RNA降解)；(2)每管加入ImL TRIzol (總RNA提取試劑)用力搖動使之混合均勻，室溫下放置 5min(注意樣品的量不要超過TRIzoI的10% )；(3)當樣品中蛋白、脂肪、多糖含量較高時,在4°C條件下12000rpm離心IOmin,將上清液吸入干凈的I. 5mL的EP管中；(4)每管加0. 2mL氯仿，用カ振蕩15秒，室溫放置2_3min，在4°C條件下12000rpm 離心15min ；(5)將上清液吸入干凈的I. 5mL的EP管中(約600 U L)，加等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置IOmin ；(6)在 4°C條件下 I2OOOrpm 離心 IOmin ；(7)棄上清，加 ImL 75% こ醇，振蕩，4°C, 7500rpm 離心 5min ;(8)室溫干燥 15_20min ；(9)溶于適量(3O-5O U L) RNA-free water 中；(10) 55_60°C水浴I Omin，使RNA充分溶解；吸取部分用于下步反應(yīng)，其余儲存在_70°C的超低溫冰箱中待用。3、RNA完整性及純度檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用紫外分光光度計測定提取的RNA在260nm 和280nm處的光吸收值，RNA的0D26(l/0D28(l為2. 04，確定RNA的純度及濃度。將經(jīng)檢測合格并定量的總RNA保存在_80°C低溫冰箱中或直接用于反轉(zhuǎn)錄。4、反轉(zhuǎn)錄以提取的薦草總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成。按下列RT體系依次加入各種試劑，甸步在冰浴中進彳丁。加完各種試劑后，輕輕混勾，然后低速尚心。在 PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件42°C溫育50min，65°C加熱15min終止反應(yīng)，冰上冷卻。產(chǎn)物保存于_20°C備用。表I反轉(zhuǎn)錄體系
權(quán)利要求
1.擴增薦草Actin基因的特異性引物，其核苷酸序列如SEQIDNo. I, SEQ ID NO. 2 PJf/Jn ο
2.克隆薦草Actin基因的方法，其特征在于，包括以下步驟1)提取薦草總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA；2)以步驟I)獲得的cDNA為模板，以權(quán)利要求I所述的特異性引物對為引物進行PCR反應(yīng);3)回收和純化PCR產(chǎn)物；4)PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞；5)進行藍白斑篩選和菌落PCR，鑒定陽性菌落；6)將陽性菌落擴大培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，還包括將擴大培養(yǎng)的陽性菌落進行序列測定。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的薦草總RNA提取自薦草葉片組織。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的PCR反應(yīng)，其25μ I的反應(yīng)體系為10μΜ 正向引物 O. 5 μ 1，10 μ M 反向引物 O. 5 μ 1，PCR Mixl2. 5μ 1，ddH2010. 5 μ 1， cDNAlμ I。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR的反應(yīng)程序為941預(yù)變性41^11，1個循環(huán);94°C變性 30s，50-57°C退火 30s，72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C 5min。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，PCR反應(yīng)的退火溫度為54.50C。
8.權(quán)利要求2-7任一所述的方法獲得的薦草Actin基因。
9.權(quán)利要求2-7任一所述的方法獲得的薦草Actin基因作為內(nèi)參基因的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2-7任一所述的方法獲得的薦草Actin基因在分子遺傳育種領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種克隆虉草Actin基因的PCR引物及方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一對用于克隆虉草Actin基因的PCR特異性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還提供了克隆虉草Actin基因的方法，通過提取虉草葉片組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用本發(fā)明提供的特異引物進行PCR反應(yīng)，獲得序列長度為453bp的Actin基因部分片段，該基因片段可以作為內(nèi)參基因，為研究虉草其他的基因提供方便，該方法具有靈敏度高、特異性強，簡便快速的優(yōu)點，在虉草的分子技術(shù)育種方面具有較好的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/10GK102586245SQ201210075718
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者叢麗麗, 于曉丹, 劉斯佳, 張新全, 張?zhí)N薇, 李洪超, 楊富裕 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)