專利名稱：非對稱發(fā)夾探針及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物反應(yīng)技術(shù)，特別是涉及一種非對稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
核酸分子固相雜交法、DNA測序法、毛細(xì)管電泳分析、基因芯片技術(shù)等檢測方法的先后建立，將細(xì)菌分子檢測方法提高到一個嶄新的階段，但是這些檢測方法大多需要特殊的大型儀器，技術(shù)難度大，難以在臨床中普及應(yīng)用。此外，大多需要預(yù)先對樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，嚴(yán)重干擾了致病菌的定量檢測，同時PCR技術(shù)存在的實驗室污染問題也極大地影響了這些檢測方法的準(zhǔn)確性。DNA探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對的高度精確性，對某一特異性DNA序列進(jìn)行探查的新技術(shù)。DNA探針是利用同位素、生物素 等標(biāo)記的特定DNA片斷，該片斷可大至寄生蟲基因組DNA，小至20個堿基。當(dāng)DNA探針與待測的非標(biāo)記單鏈DNA (或RNA)按堿基順序互補(bǔ)結(jié)合時，以氫鍵將2條單鏈連接而形成標(biāo)記DNA-DNA (或標(biāo)記DNA-RNA)的雙鏈雜交分子。將未配對結(jié)合的探針洗去稀后用檢測系統(tǒng)(放射自顯影或酶檢測等)檢測雜交反應(yīng)結(jié)果。由于DNA分子堿基互補(bǔ)的精確性，單連DNA探針僅與樣品中變性處理的DNA單鏈出現(xiàn)配對雜交，由此決定了探針的特異性；用放射性同位素(如32P)或生物素標(biāo)記探針，使雜交試驗同時具有高度的敏感性。Applied Gene Technologies公司的專利名稱為“發(fā)夾形核酸探針技術(shù)”(NucleicAcid Hairpin Probes),專利號為6380377涉及到一種莖環(huán)形DNA探針技術(shù),與標(biāo)準(zhǔn)的單鏈核酸探針相比結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，酶反應(yīng)更高效，對錯配更加敏感，產(chǎn)生了更少的非特異性靶位結(jié)合。這些優(yōu)點(diǎn)都提高了基因分析的特異性。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述領(lǐng)域中的缺陷，本發(fā)明設(shè)計了非對稱發(fā)夾探針，并發(fā)明了一種非對稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)技術(shù)，巧妙地結(jié)合了分子雜交的高特異性和鏈?zhǔn)骄酆系母咝?，通過DNA聚合釋放的自由能驅(qū)動分子級聯(lián)放大，其反應(yīng)體系簡單，檢測效率高，且有效地避免了 PCR等傳統(tǒng)技術(shù)存在的實驗室污染問題。非對稱發(fā)夾探針1，其特征在于包括回文序列、兩條莖臂和連接于一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接于回文序列的兩端且具有互補(bǔ)的核酸序列，所述回文序列為無關(guān)序列，所述莖臂與其連接的粘性末端具有靶序列的互補(bǔ)核酸序列。所述粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針I(yè)的5’端。非對稱發(fā)夾探針2，其特征在于包括回文序列、兩條莖臂和連接于一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接于回文序列的兩端且具有互補(bǔ)的核酸序列，所述回文序列與其相連的一條莖臂具有靶序列，所述另一莖臂上相連的粘性末端具有和上述無關(guān)序列的互補(bǔ)核酸序列。所述粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針2的3’端。
所述粘性末端為6-8個堿基。 非對稱發(fā)夾探針在快速檢測待測靶序列中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為液相雜交鏈反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系中同時加入有非對稱發(fā)夾探針I(yè)和非對稱發(fā)夾探針2以及待測靶序列，其中所述非對稱發(fā)夾探針I(yè)的粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針I(yè)的5’端，所述非對稱發(fā)夾探針2的粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針I(yè)的3’端；或者所述非對稱發(fā)夾探針I(yè)的粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針I(yè)的3’端，所述非對稱發(fā)夾探針2的粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針I(yè)的5’端。所述待測靶序列為細(xì)菌的16S rDNA序列。所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌,所述非對稱發(fā)夾探針I(yè)、非對稱發(fā)夾探針2和待測靶 序列分別為SA-Hl TTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGCAAAGTCCGTCCGCCGCTAACATC,SA-H2 CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAAGATGTTAGCGGCGGACGGACTTTG,Tsa:CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAA。所述細(xì)菌為銅綠假單胞菌，所述非對稱發(fā)夾探針I(yè)、非對稱發(fā)夾探針2和待測靶序列分別為PA-HlCGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC,PA-H2 ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGT,Tpa :ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。所述細(xì)菌為肺炎克雷伯菌，所述非對稱發(fā)夾探針I(yè)、非對稱發(fā)夾探針2和待測靶序列分別為KP-Hl GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC，KP-H2 AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG，Tkp :AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC。本發(fā)明的基本原理是兩條特異性自組裝探針由靶核酸特異序列和一回文序列組成，在無靶序列存在的情況下，處于亞穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而一旦加入待測靶序列，即觸發(fā)無需酶參與的鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，此時特異性自組裝探針的靶核酸特異序列部分與對應(yīng)靶核酸位點(diǎn)結(jié)合，其余探針則兩兩復(fù)性成兩端均為回文序列的部分雙鏈探針，在分子識別雜交的同時大幅度地增強(qiáng)檢測信號，從而實現(xiàn)了待測靶序列的快速檢測。其原理如圖I所示。其反應(yīng)過程如下(A)待測靶序列I從探針Hl的粘性末端開始發(fā)生嚴(yán)格堿基配對的鏈置換反應(yīng)從而打開探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，廣生新的粘性末端；(B)Hl的粘性末端與H2的粘性末端發(fā)生反應(yīng)繼續(xù)打開探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，繼而探針Hl和H2之間發(fā)生交替雜交反應(yīng)，形成鏈?zhǔn)骄酆象w大幅度放大信號。與傳統(tǒng)的PCR、固相核酸雜交等技術(shù)相比,該技術(shù)具有更為突出的優(yōu)點(diǎn)(I)液相雜交反應(yīng)。更加接近分子反應(yīng)的自然狀態(tài)，克服了固相雜交存在的空間位阻大的問題，提高了雜交反應(yīng)的效率。(2)檢測效率高，檢測速度快。傳統(tǒng)核酸檢測技術(shù)通常需要幾小時甚至十幾小時，而該技術(shù)同時進(jìn)行分子識別和級聯(lián)信號放大，可在10分鐘內(nèi)完成核酸檢測。(3)反應(yīng)體系簡單，成本低廉。無需酶及其他復(fù)雜的分子生物學(xué)試劑，反應(yīng)體系更為簡單，試劑可制備成干粉運(yùn)輸及保存。(4)單管反應(yīng)，操作簡便。所有檢測在單一閉管中進(jìn)行，操作步驟簡單，并且有效地避免了 PCR等傳統(tǒng)技術(shù)存在的實驗室污染問題。(5)適合與其他檢測方法整合。針對細(xì)菌的特異性核酸靶序列，設(shè)計多重特異性非對稱發(fā)夾探針，結(jié)合一種高效、靈敏的信號檢測方法，就可實現(xiàn)快速并行檢測細(xì)菌的目的。


圖I.非對稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)技術(shù)原理中H1、H2、I :發(fā)夾探針I(yè)、發(fā)夾探針2、待測靶序列；A和a、B和b、C和c為互補(bǔ)
核酸序列。圖2金黃色葡萄球菌非對稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)電泳結(jié)果，圖3銅綠假單胞菌非對稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)電泳結(jié)果， 圖4肺炎克雷伯菌非對稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)電泳結(jié)果(粘性末端12個堿基)，圖5肺炎克雷伯菌非對稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)電泳結(jié)果(粘性末端6-8個堿基)，圖6肺炎克雷伯菌非對稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)電泳結(jié)果(粘性末端4個堿基)，圖中第一泳道MM:DL 2,000 DNA maker。
具體實施例方式本發(fā)明的具體實施例主要針對于三種病原菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照本發(fā)明的原理，將其應(yīng)用于任何微生體的檢測，只要找到合適的特異性的待測靶序列。實施例II、I技術(shù)方法及實驗結(jié)果I、檢測靶序列的選擇及非對稱發(fā)夾探針的設(shè)計(I)根據(jù)16S rDNA的分子生物學(xué)特點(diǎn)選擇檢測的靶序列。16S rRNA是研究細(xì)菌進(jìn)化和親緣關(guān)系的重要指標(biāo)，其含量大(約占細(xì)菌RNA總量的80% )，具有多個拷貝，在細(xì)菌中高度保守，有“細(xì)菌化石”之稱?；谏鲜?6S rDNA分子生物學(xué)特征，通過文獻(xiàn)或Genbank數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)查獲致病菌16SrDNA序列,采用Vector NTI Suite 9軟件對致病菌的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較,確定檢測靶序列。(2)特異性非對稱HCR發(fā)夾探針的設(shè)計米用Array Designer 4. O和Primer Premier 5. O軟件設(shè)計非對稱發(fā)夾式探針，用Omiga 2. O軟件進(jìn)行探針間、探針與靶序列的互補(bǔ)性分析，設(shè)計的備選探針序列提交Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行特異性分析。表I :三種病原菌探針及靶序列設(shè)計
權(quán)利要求
1.非對稱發(fā)夾探針1，其特征在于包括回文序列、兩條莖臂和連接于一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接于回文序列的兩端且具有互補(bǔ)的核酸序列，所述回文序列為無關(guān)序列，所述莖臂與其連接的粘性末端具有靶序列的互補(bǔ)核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的非對稱發(fā)夾探針I(yè)，所述粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針I(yè)的5’端。
3.非對稱發(fā)夾探針2，其特征在于包括回文序列、兩條莖臂和連接于一條莖臂上的粘性末端，所述兩條莖臂連接于回文序列的兩端且具有互補(bǔ)的核酸序列，所述回文序列與其相連的一條莖臂具有靶序列，所述另一莖臂上相連的粘性末端具有和權(quán)利要求I中所述的無關(guān)序列的互補(bǔ)核酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非對稱發(fā)夾探針2，所述粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針2的3，端。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的非對稱發(fā)夾探針I(yè)或2，所述粘性末端為6-8個堿基。
6.非對稱發(fā)夾探針I(yè)或2在快速檢測待測靶序列中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，為液相雜交鏈反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系中同時加入有非對稱發(fā)夾探針I(yè)和非對稱發(fā)夾探針2以及待測靶序列，其中所述非對稱發(fā)夾探針I(yè)的粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針I(yè)的5’端，所述非對稱發(fā)夾探針2的粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針I(yè)的3’端；或者所述非對稱發(fā)夾探針I(yè)的粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針I(yè)的3，端，所述非對稱發(fā)夾探針2的粘性末端位于非對稱發(fā)夾探針I(yè)的5’端。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，所述待測靶序列為細(xì)菌的16SrDNA序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌，所述非對稱發(fā)夾探針I(yè)、非對稱發(fā)夾探針2和待測靶序列分別為SA-Hl TTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGCAAAGTCCGTCCGCCGCTAACATC,SA-H2 CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAAGATGTTAGCGGCGGACGGACTTTG，Tsa :CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAA。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，所述細(xì)菌為銅綠假單胞菌，所述非對稱發(fā)夾探針I(yè)、非對稱發(fā)夾探針2和待測靶序列分別為PA-H I CGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC,PA-H2 :ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGT，Tp a :ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，所述細(xì)菌為肺炎克雷伯菌，所述非對稱發(fā)夾探針I(yè)、非對稱發(fā)夾探針2和待測靶序列分別為KP-Hl GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC,KP-H2 AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG, Tkp AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC。
全文摘要
本發(fā)明涉及“非對稱發(fā)夾探針及其應(yīng)用”，屬于生物檢測領(lǐng)域。非對稱發(fā)夾探針由靶核酸特異序列和一回文序列組成，在無靶序列存在的情況下，處于亞穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而一旦加入待測靶序列，即觸發(fā)無需酶參與的鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，非對稱發(fā)夾探針的靶核酸特異序列部分與對應(yīng)靶核酸位點(diǎn)結(jié)合，其余探針則兩兩復(fù)性成兩端均為回文序列的部分雙鏈探針，在分子識別雜交的同時大幅度地增強(qiáng)檢測信號，從而實現(xiàn)了待測靶序列的快速檢測。本發(fā)明的非對稱發(fā)夾探針鏈反應(yīng)技術(shù)，巧妙地結(jié)合了分子雜交的高特異性和鏈?zhǔn)骄酆系母咝?，通過DNA聚合釋放的自由能驅(qū)動分子級聯(lián)放大，其反應(yīng)體系簡單，檢測效率高，且有效地避免了PCR等傳統(tǒng)技術(shù)存在的實驗室污染問題。
文檔編號C12Q1/68GK102864214SQ20121007664
公開日2013年1月9日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者夏涵, 梁盼盼, 黃慶, 府偉靈 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院