專利名稱：用于華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因snp位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒及其pcr擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒及其PCR擴(kuò)增方法，特別涉及一種檢測(cè)影響臨床華法林用藥劑量的維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物I基因VKORCl (-1639G/A)與細(xì)胞色素P450酶2C9基因CYP2C9 (1075A/C)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的試劑盒以及PCR擴(kuò)增方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的臨床檢測(cè)技木。
背景技術(shù)：
華法林是臨床上廣泛使用的一種雙香豆素衍生物類ロ服抗凝藥，通過(guò)干擾環(huán)氧化型維生素K與氫醌型維生素K之間的轉(zhuǎn)化循環(huán)而產(chǎn)生抗凝效應(yīng)。主要用于預(yù)防和治療血栓性疾病如血栓栓塞性靜脈炎、肺梗塞、心房纖顫等，在外科心臟瓣膜置換術(shù)、血管移植術(shù)等術(shù)后也需要常規(guī)服用華法林，特別是人工機(jī)械瓣膜置換術(shù)后患者需終生服用。但華法林的有效治療范圍較窄且不同個(gè)體之間給藥劑量存在較大的差異，除了受患者年齡、性別、體重、體表面積、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、肝腎功能、飲食及使用藥物等臨床因素的影響外，華法林的靶酶VKORCl和用藥劑量酶CYP2C9的基因遺傳多態(tài)性是影響華法林用藥劑量差異性的主要因素，而當(dāng)前確定華法林需求劑量時(shí)無(wú)法考慮遺傳因素的影響，常常造成患者嚴(yán)重的出血并發(fā)癥。華法林是維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)的特異性抑制劑，VKOR主要由維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位I (VKORCl)基因編碼，該基因位于染色體16pll. 2，全長(zhǎng)約4kb ；VK0R可使無(wú)活性的環(huán)氧化型維生素K轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘臍漉途S生素K，氫醌型維生素K是Y-谷氨酰基羧化酶(GGCX)的必要輔助因子，凝血因子II、VII、IX、X、蛋白質(zhì)C和蛋白質(zhì)S經(jīng)過(guò)GGCX的羧化作用后而活化，進(jìn)而發(fā)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起血液凝固。大量研究發(fā)現(xiàn)，在VKORCl編碼區(qū)和非編碼區(qū)存在大量的多態(tài)性位點(diǎn)，其中VKORCl啟動(dòng)子的基因多態(tài)性(-1639G/A)是影響華法林需求劑量中種族差異和個(gè)體差異的最主要因素，其機(jī)制是啟動(dòng)子多態(tài)現(xiàn)象改變了能夠影響啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的E-盒(CANNTG)共有序列。研究表明，G基因的VKORCl啟動(dòng)子活性比A基因的啟動(dòng)子活性高出44%。GG基因型的個(gè)體VKORCl啟動(dòng)子活性增高，引起VKORClmRNA表達(dá)增加，VKOR生成也相應(yīng)增多。VKOR增多，有活性的氫醌型維生素K生成和凝血因子生成也増加，因此需要較高劑量的華法林才能達(dá)到抗凝效果；而啟動(dòng)子區(qū)域-1639G > A的突變可引起VKOR mRNA的表達(dá)下降，從而使肝臟中VKOR的生成也相應(yīng)地減少，進(jìn)而引起環(huán)氧化型維生素K還原成氫醌型維生素K減少，此時(shí)只需要很少劑量的華法林就能達(dá)到抗凝效果，最終導(dǎo)致患者對(duì)華法林敏感；其中華法林敏感者(< I. 5mg/d)的基因型為純合子AA，而華法林抵抗者(彡6. Omg/d)則為基因型AG或者GG。華法林在體內(nèi)的用藥劑量主要是通過(guò)肝臟細(xì)胞色素氧化酶P450 (CYP)系，華法林含S型和R型2種異構(gòu)體，S型主要經(jīng)肝臟CYP2C9用藥劑量，R型由CYP3A4用藥劑量，其中S型華法林的抗凝活性比R型華法林強(qiáng)3 5倍，因此CYP2C9是影響華法林用藥劑量的主要酶之一。CYP2C9是CYP系統(tǒng)的亞家族，該酶的基因位于染色體10q24. 2上，全長(zhǎng)約55kb，含有8個(gè)內(nèi)含子，9個(gè)外顯子(mRNA長(zhǎng)I. 47kb)，編碼490個(gè)氨基酸殘基、分子量為55kD的蛋白質(zhì)，它是人類肝臟中ー種重要的藥物用藥劑量酶，大約10%的臨床常用藥物由CYP2C9氧化用藥劑量，人類的CYP2C9基因同樣具有遺傳多態(tài)性，其中與亞洲人群最為密切的是CYP2C9基因第7外顯子的第1075位核苷酸存在A/C多態(tài)(1075A/C)，導(dǎo)致多肽鏈第359位氨基酸Ile被Leu取代，突變后其編碼的酶活性比野生型降低了 80%，導(dǎo)致CYP基因突變個(gè)體對(duì)華法林的用藥劑量能力以及清除能力大大降低，從而導(dǎo)致患者對(duì)華法林敏感，攜帯CYP2C9突變基因的個(gè)體在使用華法林的初期就有較高的出血危險(xiǎn)性。
綜上所述，VKORCl (-1639G/A)和CYP2C9 (1075A/C)基因多態(tài)性是導(dǎo)致華法林需求劑量民族差異和個(gè)體差異的重要因素；國(guó)人VKORCl (-1639)等位基因G和A頻率分別為14%和86%，以AA和AG型為主，GG型少見(jiàn)；CYP2C9 (1075)等位基因A和C頻率分別為95%和 5%，以 AA 和 AC 型為主，CC 型罕見(jiàn)。因此，VKORCl (-1639)G — A、CYP2C9 (1075) A — C 的
變異均可導(dǎo)致患者華法林用量的顯著減少。然而，目前檢測(cè)與華法林用藥劑量相關(guān)的基因遺傳多態(tài)性的方法比較單一，常規(guī)是首先從患者體內(nèi)抽取全血，提取DNA，擴(kuò)增VKORCI啟動(dòng)區(qū)域DNA片段，再進(jìn)行DNA測(cè)序，最終得到相應(yīng)的結(jié)果，這種常規(guī)檢測(cè)SNP位點(diǎn)的方法雖然可以達(dá)到檢測(cè)的目的，但試驗(yàn)周期長(zhǎng)、步驟過(guò)于繁瑣、不能及時(shí)得到結(jié)果和不能迅速做出醫(yī)療診斷的同時(shí)還給患者以及醫(yī)療單位帶來(lái)較大經(jīng)濟(jì)支出；還有應(yīng)用較廣的方法為限制性內(nèi)切酶酶解片段長(zhǎng)度多態(tài)性，這一方法具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和可靠的特點(diǎn)，但這一方法的顯著弱點(diǎn)是難以直接應(yīng)用于高通量平行分析；普通PCR技術(shù)采用ー對(duì)普通引物和低保真Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的結(jié)果特異性不高，常常造成假陽(yáng)性。這三種方法都無(wú)法滿足后基因時(shí)代對(duì)VK0RC1(-1639G/A)和CYP2C9 (1075A/C) SNP位點(diǎn)分析的要求。

發(fā)明內(nèi)容
華法林的靶酶VKORCl和代謝酶CYP2C9的基因遺傳多態(tài)性分別所起的重要作用已經(jīng)被我們所認(rèn)識(shí)，二者的基因突變直接或間接影響華法林在體內(nèi)的代謝過(guò)程和抗凝效果。本發(fā)明提供一種檢測(cè)影響臨床華法林個(gè)體化用藥劑量的維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物I基因VKORCl (-1639G/A)與細(xì)胞色素P450酶2C9基因CYP2C9 (1075A/C)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的試劑盒及其PCR擴(kuò)增方法，目的是解決現(xiàn)有用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)VKORCl (-1639G/A)和CYP2C9 (1075A/C)的SNP位點(diǎn)時(shí)價(jià)格昂貴、低效率低通量以及特異性不高的問(wèn)題。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的第一種技術(shù)方案是ー種用于華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括檢測(cè)基因CYP2C9SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及ー個(gè)反向引物；所述檢測(cè)基因CYP2C9SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及ー個(gè)反向引物的堿基序列如下所示正向引物5，-TGCACGAGGTCCAGAGATACAT-3，；5 ’ -TGCACGAGGTCCAGAGATACCT-3，；反向引物5’-ACTGGAAACAAGAGAAAGTCCA-3，；
其中，所述正向引物的3’端-1，-2，-3位堿基之間硫代磷酸化修飾為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的第一種技術(shù)方案是一種檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增方法，預(yù)變性的條件為溫度為95 °C，時(shí)間為5分鐘；PCR擴(kuò)增由第一階段和第二階段構(gòu)成第一階段由15次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為變性溫度為95 °C，時(shí)間為30秒；退火起始溫度為68°C，每一次擴(kuò)增循環(huán)溫度遞減1°C，直至擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束，時(shí)間為30秒；延伸溫度為72°C，時(shí)間為30秒； 第二階段由25次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為 變性溫度為95 °C，時(shí)間為30秒；退火溫度為58 °C，時(shí)間為30秒；延伸溫度為72°C，時(shí)間為30秒；終延伸的條件為溫度為72°C，時(shí)間為10分鐘。上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下I、上述技術(shù)方案中所述引物(primer)是PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)中重要的組成部分，它是ー小段單鏈DNA,作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn),在核酸合成反應(yīng)時(shí),作為姆個(gè)多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3' -OH上，核苷酸以ニ酯鍵形式進(jìn)行合成，因此引物的3' -OH必須是游離的。2、上述方案中，所述硫代磷酸化修飾是指在普通弓I物合成的基礎(chǔ)上，3'端兩個(gè)單核苷酸之間ニ酯鍵上的-OH被-SH所取代，從而達(dá)到耐核酸外切酶消化的效果。本發(fā)明工作原理是PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增是一種體外擴(kuò)增DNA片段的方法，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。采用這種方法，在反應(yīng)系統(tǒng)中只要有一個(gè)拷貝的待擴(kuò)增DNA片段，在短時(shí)間內(nèi)就能擴(kuò)增出大量拷貝數(shù)的特異性DNA片段。該方法廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)。PCR擴(kuò)增的基本原理是模仿細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過(guò)程，以DNA互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)靶DNA變性、弓I物與模板DNA(待擴(kuò)增DNA) —側(cè)的互補(bǔ)序列退火復(fù)性、耐熱性DNA聚合酶催化引物延伸等過(guò)程的多次循環(huán)，產(chǎn)生待擴(kuò)增的特異性DNA片段。由于上一次循環(huán)合成的兩條互補(bǔ)鏈均可作為下一次循環(huán)的模板DNA鏈，所以每循環(huán)一次，底物DNA的拷貝數(shù)增加一倍，因此PCR經(jīng)過(guò)η次循環(huán)后，理論上，待擴(kuò)增的特異性DNA片段可達(dá)到2η個(gè)拷貝數(shù)。TouchdownPCR，即降落PCR。是優(yōu)化和改良后的ー種PCR方法，指每ー個(gè)(或η個(gè))循環(huán)降低1°C (或n°C )退火溫度，直至達(dá)到ー個(gè)較低的退火溫度(touchdown退火溫度)。然后以此溫度進(jìn)行多個(gè)循環(huán)。正確和非正確退火溫度1°C差異將造成PCR產(chǎn)物量4倍的差異，如果相差n°C，就會(huì)產(chǎn)生4的η次方倍的優(yōu)勢(shì)，因此，相對(duì)于非正確產(chǎn)物，正確產(chǎn)物可以得到大量的富集。退火溫度起始在高于計(jì)算的Tm值15°C左右，再接下來(lái)的循環(huán)中，退火溫度以每次1-2°C逐漸降低，直到Tm值以下5°C，當(dāng)達(dá)到特異的引物-模板結(jié)合的Tm值時(shí)，擴(kuò)增就會(huì)開(kāi)始。當(dāng)退火溫度降到非特異擴(kuò)增發(fā)生的水平吋，特異產(chǎn)物會(huì)在與非特異擴(kuò)增的競(jìng)爭(zhēng)中勝出，成為主導(dǎo)的擴(kuò)增產(chǎn)物避免非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)。此擴(kuò)增方法有利于PCR產(chǎn)物的純化和假陽(yáng)性的降低。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果I、本發(fā)明采用特殊設(shè)計(jì)的引物，并且在其引物的3'端用雙硫代磷酸化修飾，其PCR產(chǎn)物特異性非常高。利用該檢測(cè)方法，在完成PCR反應(yīng)和凝膠電泳后，可通過(guò)直接觀察產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)判斷VKORCl和CYP2C9的基因型以及檢測(cè)基因VKORCl (-1639G/A)與CYP2C9(1075A/C)的 SNP 位點(diǎn)。2、本發(fā)明采用特殊的PCR程序，大大減少了由于Tm值太低而導(dǎo)致的引物與模板在錯(cuò)誤位點(diǎn)的結(jié)合，從而提高了 PCR效率和靈敏度，為臨床華法林用藥劑量提供可靠的依據(jù)。3、本發(fā)明經(jīng)濟(jì)，不需測(cè)序，在節(jié)省了大量資本的同吋，大大縮短了試驗(yàn)周期，提高了實(shí)驗(yàn)效率。4、本發(fā)明的試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)高效率高通量VKORCl (-1639G/A)與CYP2C9(1075A/C)的SNP位點(diǎn)檢測(cè)，從而達(dá)到對(duì)華法林劑量量化的控制，甚至對(duì)血栓性疾病的預(yù)防、抗凝藥物的選擇、新抗凝藥的研發(fā)、血栓性的疾病預(yù)后也起到一定的作用。


附圖I為采用試劑盒中的檢測(cè)基因VKORCl (-1639G/A) SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及ー個(gè)反向弓I物檢測(cè)三個(gè)樣品得到凝膠電泳圖。附圖2為附圖I中所示的左側(cè)樣品DNA測(cè)序圖。附圖3為附圖I中所示的中間樣品DNA測(cè)序圖(采用反向引物)。附圖4為附圖I中所示的右側(cè)樣品DNA測(cè)序圖(采用反向引物)。附圖5為采用試劑盒中的檢測(cè)基因CYP2C9(1075A/C)SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及ー個(gè)反向弓I物檢測(cè)三個(gè)樣品得到凝膠電泳圖。附圖6為附圖5中所示的左側(cè)樣品DNA測(cè)序圖。附圖7為附圖5中所示的中間樣品DNA測(cè)序圖。附圖8為附圖5中所示的中間樣品DNA測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步描述實(shí)施例一一種檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒包含10 X PCR Buffer、dNTP (2. 5mM)、Pfu DNA 聚合酶(2·5υ/μ1)以及引物(各 IOmM)。檢測(cè)基因VKORCl (-1639G/A)的SNP位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示正向引物CCTGAAAAACAACCATTGGTCG(VK0RCl-1639Gss)；CCTGAAAAACAACCATTGGTCA(VK0RCI-1639Ass)；反向引物AGTTTGGACTACAGGTGCCTG(VK0RC1-1639R)。檢測(cè)基因CYP2C9 (1075A/C) SNP位點(diǎn)的引物的堿基序列如下所示(5’ 一 3’)正向引物TGCACGAGGTCCAGAGATACAT(CYP2C91075Ass)；TGCACGAGGTCCAGAGATACCT(CYP2C91075Css)；反向引物ACTGGAAACAAGAGAAAGTCCA(CYP2C91075R)。四個(gè)正向引物的3’端-1，-2，-3位堿基之間均進(jìn)行硫代磷酸化修飾。實(shí)施例ニ 一種檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒采、用的PCR擴(kuò)增方法包括下列步驟第一步準(zhǔn)備DNA(I)、從患者甲抽取血液樣本。(2)、從血液樣本中獲取DNA，我們采用上海生物工程技術(shù)有限公司生產(chǎn)的UNIQ-10試劑盒進(jìn)行提取。從患者甲的血樣中獲取DNA過(guò)程a.取 500ul 已カ[]入 ACD (O. 48 % Citric Acid (朽1 樣酸)；1.32 % Sodium Citrate (朽1檬酸鈉)；I. 47% Glucose (葡萄糖))抗凝劑的血樣。b. 500ul血樣中加入Iml無(wú)菌水，5000轉(zhuǎn)/分，離心兩分鐘去上清，用200ul TE將
白細(xì)胞懸浮起來(lái)。c.在b步驟制備的200ul樣品中，加入200ul Digestion Buffer混勻，再加入20ul 的 Proteinase K(蛋白酶 K) (10mg/ml)，混勻，55°C 保存 30 分鐘。d.加入 200ul BD Buffer，70°C孵育 10 分鐘。e.加入200ul無(wú)水こ醇，混勻，然后用1-ml Tip頭將樣品全部轉(zhuǎn)移到UNIQ-10柱，柱子放入 2. 0-ml Collection Tube。f.用臺(tái)式離心機(jī)，10000轉(zhuǎn)/分，室溫離心I分鐘。g.取下UNIQ-10柱，棄去Collection Tube中的廢液。將柱子放回同一根Collection Tube 中，加入 500ul Pff Solution, 10000 轉(zhuǎn) / 分，室溫離心 I 分鐘。h.取下UNIQ-10柱，棄去Collection Tube中的廢液。將柱子放回同一根Collection Tube 中，加入 500ul Wash Solution, 10000 轉(zhuǎn) / 分，室溫離心 I 分鐘。i.取下UNIQ-10柱,棄去Collection Tube中的全部廢液。將柱子放回同一根Collection Tube中，10000轉(zhuǎn)/分,室溫離心I分鐘以除去殘留的Wash Solution。j.將柱子放入新的無(wú)菌的I. 5ml離心管中，在柱子中央加入50ul 60度預(yù)熱的Elution Buffer,室溫放置5分鐘。k. 10000轉(zhuǎn)/分，室溫離心I分鐘，離心管中的液體即為血液中基因組DNA。第二步對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增PCR擴(kuò)增進(jìn)行兩次，分別采用檢測(cè)基因VK0RC1 (-1639G/A)的SNP位點(diǎn)的引物和檢測(cè)基因CYP2C9 (1075A/C) SNP位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增的方法相同采用30ng/50ul的反應(yīng)體系,具體操作為I、將上述一系列引物分別與獲取的血液基因組DNA、4種堿基、PCR反應(yīng)緩沖液、高保真Pfu DNA聚合酶、去離子水按一定比例混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系，具體見(jiàn)下表
ddH2039 μ I
10XPCR Buffer5μ I
dNTP(2. 5mM)4. 0μ I
引物(各IOmM)各0·8μ1
Pfu DNA聚合酶(2. 511/ μ I) O. 2 μ I 基因組 DNA(約 60ng/u lF[ O. 5μ I
2、對(duì)上述反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)條件見(jiàn)下表
_步驟__溫度__時(shí)間—
基因組DNA變性 _95 0C__5分鐘—
變性 _95 0C_ 30秒
_ A, 起始溫度為68°C,每ー次循環(huán)M
15次迮火30秒 __溫度遞減rc，_直到循環(huán)結(jié)束__
ィノ目延伸72°C30秒
環(huán)----
變性 _95 0C__30秒—
25次退火 _ 580C _ 30秒
___延伸__720C__30 秒 _
延伸72°C10分鐘
保存J4°CΓ ...... I第三步凝膠電泳采用凝膠電泳系統(tǒng)對(duì)上述DNA擴(kuò)增后的體系做凝膠電泳，得到的凝膠電泳圖如附圖I的左側(cè)所示。第四步觀測(cè)結(jié)果采用檢測(cè)基因VKORCl (-1639G/A)的SNP位點(diǎn)的引物得到的凝膠電泳如附圖I的左側(cè)所示，只在Ass泳道中有產(chǎn)物，說(shuō)明患者是VKORCl (-1639A/A)突變純合子，患者對(duì)華法林極為敏感，該患者甲在使用華法林時(shí)應(yīng)降低劑量。該結(jié)果可以通過(guò)DNA測(cè)序圖附圖2證實(shí)(采用正向引物測(cè)序)。采用檢測(cè)基因CYP2C9 (1075A/C) SNP位點(diǎn)的引物得到的凝膠電泳如附圖5的左側(cè)所示，只在Ass泳道中有產(chǎn)物，，說(shuō)明患者是CYP2C9-1075A/A野生純合子，患者對(duì)華法林的代謝能力正常，患者不對(duì)華法林敏感。該結(jié)果可以通過(guò)DNA測(cè)序圖附圖6證實(shí)(采用正向引物測(cè)序)。實(shí)施例三一種檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒采用的PCR擴(kuò)增方法血液樣本是從患者こ抽取。其他的實(shí)驗(yàn)條件均與實(shí)施例二相同。結(jié)果是采用檢測(cè)基因VKORCl (-1639G/A)的SNP位點(diǎn)的引物得到的凝膠電泳如附圖I的中間所示，在Ass和Gss泳道中都有產(chǎn)物，說(shuō)明患者是VK0RC1(-1639A/G)突變雜合子，患者對(duì)華法林較為敏感，該患者在使用華法林時(shí)應(yīng)適當(dāng)降低劑量。該結(jié)果可以通過(guò)DNA測(cè)序圖附圖3證實(shí)(采用反向引物測(cè)序)。采用檢測(cè)基因CYP2C9 (1075A/C) SNP位點(diǎn)的引物得到的凝膠電泳如附圖5的中間所示，只在Ass泳道中有產(chǎn)物，，說(shuō)明患者是CYP2C9 (1075A/A)野生純合子，患者對(duì)華法林的代謝能力正常，患者不對(duì)華法林敏感。該結(jié)果可以通過(guò)DNA測(cè)序圖附圖7證實(shí)(采用正向引物測(cè)序)。實(shí)施例四一種檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒采用的PCR擴(kuò)增方法血液樣本是從患者丙抽取。其他的實(shí)驗(yàn)條件均與實(shí)施例二相同。結(jié)果是采用檢測(cè)基因VKORCl (-1639G/A)的SNP位點(diǎn)的引物得到的凝膠電泳如附圖I的右側(cè)所示，只在Gss泳道中有產(chǎn)物，說(shuō)明患者是VKORCl (-1639G/G)野生純合子，患者對(duì)華法林耐藥，該患者在使用華法林時(shí)必須加大劑量。該結(jié)果可以通過(guò)DNA測(cè)序圖附圖4證實(shí)(采用反向引物測(cè)序)。
采用檢測(cè)基因CYP2C9 (1075A/C) SNP位點(diǎn)的引物得到的凝膠電泳如附圖5的右側(cè)所示，只在Ass泳道中有產(chǎn)物，，說(shuō)明患者是CYP2C9 (-1075A/A)野生純合子，患者對(duì)華法林的代謝能力正常，患者不對(duì)華法林敏感。該結(jié)果可以通過(guò)DNA測(cè)序圖附圖8證實(shí)(采用正向引物測(cè)序)。上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括檢測(cè)基因CYP2C9SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及ー個(gè)反向引物；所述檢測(cè)基因CYP2C9SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及ー個(gè)反向引物的堿基序列如下所示 正向引物5’ -TGCACGAGGTCCAGAGATACAT-3’ ；5’ -TGCACGAGGTCCAGAGATACCT-3’ ； 反向引物5’ -ACTGGAAACAAGAGAAAGTCCA-3’ ； 其中，所述正向引物的3’端-1，-2，-3位堿基之間硫代磷酸化修飾。
2.ー種采用權(quán)利要求I所述的檢測(cè)華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因的試劑盒PCR擴(kuò)增方法，其特征在于 預(yù)變性的條件為 .溫度為95°C，時(shí)間為5分鐘； PCR擴(kuò)增由第一階段和第二階段構(gòu)成 第一階段由15次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為 變性 .溫度為95°C，時(shí)間為30秒； 退火起始溫度為68°C，每一次擴(kuò)增循環(huán)溫度遞減1°C，直至擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束，時(shí)間為30秒； 延伸 .溫度為72°C，時(shí)間為30秒； 第二階段由25次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為 變性 .溫度為95°C，時(shí)間為30秒； 退火 .溫度為58°C，時(shí)間為30秒； 延伸 .溫度為72°C，時(shí)間為30秒； 終延伸的條件為 .溫度為72°C，時(shí)間為10分鐘。
全文摘要
用于華法林個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP檢測(cè)的試劑盒及其PCR擴(kuò)增方法，所述試劑盒包括檢測(cè)基因VKORC1(-1639G/A)SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及一個(gè)反向引物和/或檢測(cè)基因CYP2C9(1075A/C)SNP位點(diǎn)的兩個(gè)正向引物以及一個(gè)反向引物。本發(fā)明的試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)高效率高通量VKORC1(-1639G/A)與CYP2C9(1075A/C)的SNP位點(diǎn)檢測(cè)，從而達(dá)到對(duì)華法林劑量量化的控制，甚至對(duì)血栓性疾病的預(yù)防、抗凝藥物的選擇、新抗凝藥的研發(fā)、血栓性的疾病預(yù)后也起到一定的作用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102719524SQ20121007838
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者劉二平, 王進(jìn), 秦正紅, 繆麗燕 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué), 蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司