專利名稱：提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸強度和濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)發(fā)酵有機酸技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸強度和濃度的方法，具體的是一種添加表面活性劑提高丁二酸濃度和生產(chǎn)強度的方法。
背景技術(shù)：
丁二酸，俗稱琥珀酸，作為一種常見的天然有機酸，廣泛存在于動植物和微生物中，許多厭氧微生物以丁二酸作為其能量代謝的主要末端產(chǎn)物。作為一種優(yōu)秀的C4平臺化合物，丁二酸可被廣泛用于藥物、精細化工產(chǎn)品以及可生物降解的聚合物前體，如可作為 1，4-丁二醇、四氫呋喃、脂肪酸、Y-丁內(nèi)酯等的中間物，而這些化學(xué)制品都具有很大的市場潛力。利用生物法轉(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)丁二酸，成本低，污染小，環(huán)境友好，且在微生物發(fā)酵過程中可吸收大量的CO2用于菌株的代謝，能夠有效減輕溫室效應(yīng)，這也是丁二酸生產(chǎn)有別于傳統(tǒng)有機酸生產(chǎn)的一個重要特點。US5504004、US5573931、US5723322、EP0389103B1 公開了丁二酸生產(chǎn)菌及其發(fā)酵方法，這些生產(chǎn)菌株大多是從瘤胃、狗的口腔等特征性厭氧環(huán)境中篩選出來的，在發(fā)酵過程中存在產(chǎn)物收率較低、副產(chǎn)物較多、丁二酸濃度偏低、生產(chǎn)強度較低的問題，因此尋找高效的丁二酸生產(chǎn)方法是目前丞待解決的問題。表面活性劑破壞細胞膜，有利于充分發(fā)揮細胞內(nèi)酶的催化活性，對細菌生長和丁二酸的的合成有較大促進作用，達到縮短細胞生長周期的目的。而且，在丁二酸的發(fā)酵過程中，表面活性劑增大細胞滲透性，可以使甲酸、乙酸等副產(chǎn)物的抑制作用得到緩解?，F(xiàn)有技術(shù)《改善細胞通透性促進1，3-丙二醇生物合成》公開了一種提高1，3-丙二醇發(fā)酵產(chǎn)率的新工藝，發(fā)明了一些表面活性劑對1，3-丙二醇產(chǎn)出的影響，從而提高1，3-丙二醇發(fā)酵產(chǎn)率。 而目前國內(nèi)外還未見利用表面活性劑應(yīng)用于丁二酸的發(fā)酵生產(chǎn)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供一種提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸生產(chǎn)強度的方法，以提高丁二酸的生產(chǎn)強度與濃度。為了實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下?！N提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸強度和濃度的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的步驟；其特征在于，在所述的發(fā)酵產(chǎn)丁二酸步驟開始后6 7 h向發(fā)酵體系中加入
O.25 5 g/L的表面活性劑，且表面活性劑選自Tween-80、壬基酚聚氧乙烯醚-IO(OP-IO)、 曲拉通X-100、十二烷基磺酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，聚乙二醇(PEG)中的一種。具體地，菌種活化步驟是將產(chǎn)丁二酸微生物菌種在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在37°C厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h。種子培養(yǎng)步驟是將活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)10 12 h 后作為種子液。
發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的步驟將種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為體積比3 10%，溫度為37°C，始終通入CO2氣體來保持厭氧環(huán)境，整個發(fā)酵過程中pH控制在
6.5 7. O。其中，本發(fā)明所述的菌種，即厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的微生物，為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌 (.ActinobaciIlus succinogenes ) NJ113 (CGMCC NO. 1716)。作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式所述的表面活性劑為PEG，且其加入量最佳值為
O.5 g/L。本發(fā)明的有益效果在于，通過在丁二酸發(fā)酵體系中添加適量的表面活性劑，使細胞膜的通透性改變，從而加快菌體的生長，促進丁二酸產(chǎn)物的分泌，提高產(chǎn)物的濃度和生產(chǎn)強度。并且減緩甲酸、乙酸等副產(chǎn)物的抑制，從而提高了生產(chǎn)效率，具有工業(yè)化應(yīng)用價值。其原理是表面活性劑具有兩親結(jié)構(gòu)，根據(jù)相似相容的原理，表面活性劑的疏水基會和磷脂的疏水基作用，或者表面活性劑的基團與細胞膜上蛋白質(zhì)基團作用，從而使細胞膜通道增大， 使底物更容易進入細胞內(nèi)，發(fā)揮胞內(nèi)酶的活性，促進細胞的生長和丁二酸的合成。
具體實施例方式以下所述實施例對本發(fā)明做了詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。實施例I
菌種產(chǎn)玻拍酸放線桿菌succinogenes NJl 13 (CGMCC NO. 1716)該
菌已申請專利并獲得授權(quán)，專利授權(quán)公告號為CN100537744C。發(fā)酵條件如下
菌種活化菌種在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在37°C厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 ho種子培養(yǎng)活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)10 12 h后作為種子液。發(fā)酵產(chǎn)丁二酸將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為5 % (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，0)2通氣量為O. 25 vvm ;該步驟開始時計時，至第6小時，向發(fā)酵體系中添加濃度O 5 g/L Tween-80 ;培養(yǎng)時間共計15h,整個發(fā)酵過程中pH控制在6. 5。其中，斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10 (分消)，酵母膏5,NaHCO3 10，NaH2PO4CH2O
9.6, K2HPO4*3H20 15. 5, NaCl 1，瓊脂 20，pH 7. 0，121°C滅菌 15 min。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10 (分消)，酵母膏 5，NaHCO3 10，NaH2PO4CH2O 9.6, K2HPO4·3Η20 15. 5，玉米漿干粉 2. 5，NaCl 1，pH 7. 0,121 °C滅菌 15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) :Tween_80 O 5,葡萄糖30 (以總還原糖濃度計)并分開滅菌單獨加入，酵母粉 10，乙酸鈉 I. 36，KH2PO4 3，MgCl2·6Η20 O. 2，CaCl2 O. 2，NaCl 1， NaH2PO4·2Η200· 31，NaH2PO4 ·2Η20 I. 6，玉米漿干粉 7. 5，pH 7. 0,121°C滅菌 15 min。發(fā)酵結(jié)果見表I。
由上表可知，當初始匍萄糖濃度為30 g/L, 0P-10添加濃度為O. 5 g/L時，丁二酸產(chǎn)量最高，達20. 3 g/L，比原始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了 21%。所以，0P-10對丁二酸的生產(chǎn)具有較大的促進作用。實施例3
菌種活化及斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)方法同實施例I。發(fā)酵產(chǎn)丁二酸將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為3 % (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，0)2通氣量為O. 25 vvm ;該步驟開始時計時，至第6. 6小時，向發(fā)酵體系中添加濃度O 5 g/L SDS ;培養(yǎng)時間共計15h，整個發(fā)酵過程中pH 控制在6. 8。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) :SDS O 5，葡萄糖30 60 (以總還原糖濃度計)并分開滅菌單獨加入，酵母粉 10，乙酸鈉 I. 36，KH2PO4 3，MgCl2·6Η20 O. 2，CaCl2 O. 2，NaCl 1， NaH2PO4CH2O O. 31, NaH2PO4 ·2Η20 I. 6，玉米漿干粉 7. 5，pH 7. 0,121°C滅菌 15 min。由上表可知，當初始葡萄糖濃度為30 g/L，Tween-80添加濃度為O. 5 g/L時，丁二酸產(chǎn)量最高，達17. 15 g/L，但原始發(fā)酵培養(yǎng)基幾乎相等。所以Tween-80對丁二酸的生產(chǎn)的促進作用很小。實施例2
菌種活化及斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)方法同實施例I。發(fā)酵產(chǎn)丁二酸將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為10 % (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，0)2通氣量為O. 25 vvm ;該步驟開始時計時，至第7小時，向發(fā)酵體系中添加濃度O 5 g/L 0P-10 ;培養(yǎng)時間共計15h，整個發(fā)酵過程中pH 控制在7。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) :0P-10 O 5，葡萄糖30 (以總還原糖濃度計)并分開滅菌單獨加入，酵母粉 10，乙酸鈉 I. 36, KH2PO4 3，MgCl2·6Η20 0.2，CaCl2 0.2，NaCl 1， NaH2PO4·2Η20 O. 31，NaH2PO4 ·2Η20 I. 6，玉米漿干粉 7. 5，pH 7. 0,121°C滅菌 15 min。發(fā)酵結(jié)果見表2。
表10.75
8.49
706444M
1818.7.H發(fā)酵結(jié)果見表3。
表
SDS(g/L) OD(660rim) pH 耗糖速率(g/Uh)乙酸(g/L) 丁二酸(g/L)由上表可知，當初始葡萄糖濃度為30 g/L,隨著SDS添加濃度的遞增，對菌體生長及丁二酸的生產(chǎn)起到抑制作用。實施例4
菌種活化及斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)方法同實施例I。發(fā)酵產(chǎn)丁二酸將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為6 % (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，0)2通氣量為O. 25 vvm ;該步驟開始時計時，至第6. 8小時，向發(fā)酵體系中添加濃度O 5 g/L Triton X-100 ;培養(yǎng)時間共計15h，整個發(fā)酵過程中pH控制在6. 9。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) :Triton X-100 O 5，葡萄糖30 60 (以總還原糖濃度計) 并分開滅菌單獨加入，酵母粉10，乙酸鈉I. 36，KH2PO4 3，MgCl2·6Η20 O. 2，CaCl2 O. 2，NaCl I，NaH2PO4·2Η20 O. 31，NaH2PO4 ·2Η20 I. 6，玉米漿干粉 7. 5，pH 7· 0，121°C滅菌 15 min。發(fā)酵結(jié)果見表4。
表4
Tnton X-100(gl·)QD(660nm)pH耗糖速率(g/L/h)乙觀(g/L)丁二O15.645.641.8 7.3115.210.2513,45.721.837,3617.550.514.915.71L786.5215.57I13.585.711.795.5112.04212.545.651.787.8215.6852.27.220.25.944.72由上表可知，當初始葡萄糖濃度為30 g/L，隨著Triton X-100添加濃度為O. 25 g/ L時，丁二酸產(chǎn)量最高，達17. 55 g/L，比原始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了 15. 4%。所以，Triton X-100 對丁二酸的生產(chǎn)也具有很好地促進作用。實施例5
菌種活化及斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)方法同實施例I。發(fā)酵產(chǎn)丁二酸將活化好的種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵罐中，接種量為4 % (v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，37°C發(fā)酵培養(yǎng)，0)2通氣量為O. 25 vvm ;該步驟開始時計時，至第6. 6小時，向發(fā)酵體系中添加濃度O 5 g/L CTAB ;培養(yǎng)時間共計15h，整個發(fā)酵過程中
8^41
2.96
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5pH控制在6. 9。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) =CTAB O 5，葡萄糖30 60 (以總還原糖濃度計)并分開滅菌單獨加入，酵母粉 10，乙酸鈉 I. 36，KH2PO4 3, MgCl2·6Η20 O. 2，CaCl2 O. 2，NaCl 1， NaH2PO4CH2O O. 31，NaH2PO4 ·2Η20 I. 6，玉米漿干粉 7. 5，pH 7. 0,121°C滅菌 15 min。發(fā)酵結(jié)果見表5。
權(quán)利要求
1.一種提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸強度和濃度的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的步驟；其特征在于，在所述的發(fā)酵產(chǎn)丁二酸步驟開始后6 7 h向發(fā)酵體系中加入O.25 5 g/L的表面活性劑，且表面活性劑選自Tween-80、壬基酚聚氧乙烯醚-10、曲拉通 X-100、十二烷基磺酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨，聚乙二醇中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸強度和濃度的方法，其特征在于所述的菌種活化步驟是將產(chǎn)丁二酸微生物菌種在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在37°C厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 ho
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸強度和濃度的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)步驟是將活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)10 12 h后作為種子液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸強度和濃度的方法，其特征在于所述的發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的步驟將種子液和滅好的葡萄糖接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為體積比 3 10%，溫度為37°C，始終通入CO2氣體來保持厭氧環(huán)境，整個發(fā)酵過程中pH控制在6. 5 7.O。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸強度和濃度的方法，其特征在于所述的菌種為產(chǎn)玻拍酸放線桿菌succinogenes ) NJ113。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸強度和濃度的方法，其特征在于所述的表面活性劑為PEG，且其加入量為O. 5 g/L。
全文摘要
本發(fā)明屬于工業(yè)發(fā)酵有機酸技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸強度和濃度的方法。本發(fā)明的技術(shù)要點在于，在發(fā)酵體系中添加表面活性劑，表面活性劑的加入量為0.25~5g/L。通過添加表面活性劑的作用，來破壞細胞膜，提高膜內(nèi)酶活性，加快細胞生長，縮短細胞生長周期。而且，表面活性劑對細胞滲透壓起到調(diào)節(jié)作用，維持菌體活力，從而可以實現(xiàn)丁二酸的濃度與生產(chǎn)強度的提高，提高了生產(chǎn)效率，對工業(yè)化具有應(yīng)用價值。
文檔編號C12P7/46GK102605009SQ20121007881
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者奚永蘭, 姜岷, 張九花, 徐蓉, 戴文宇, 歐陽平凱, 陳可泉 申請人:南京工業(yè)大學(xué)