專利名稱：改變PCR產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重?zé)晒釶CR的方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)、病毒檢測和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及病毒分子檢測技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種準(zhǔn)確、快速改變PCR產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重?zé)晒釶CR的方法，本發(fā)明還涉及到多重?zé)晒釶CR反應(yīng)中引物設(shè)計(jì)的方法，以及同時(shí)檢測多種病毒的反應(yīng)體系參數(shù)和程序參數(shù)。本發(fā)明為多重?zé)晒釶CR的研究提供了便利，同時(shí)具有廣泛的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的ー種新的實(shí)時(shí)定量檢測特定核酸技術(shù)，與普通PCR相比，具有定量準(zhǔn)確、快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，它已被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如單細(xì)胞或活細(xì)胞中RNA的定量、細(xì)胞因子的研究、單核苷酸多態(tài)性的檢測、病毒篩選、細(xì)菌病原體檢測等。從原理上講有兩大類熒光模式第一種為熒光雜交 探針，如Taqman、分子信標(biāo)等，基于能量共振轉(zhuǎn)移的原理(FRET);第二種為DNA結(jié)合染料，主要為Sybr Green I。前面ー種方法特異性好，除需要合成序列特異引物外，還需要合成高成本的熒光探針，成本較高；后ー種方法經(jīng)濟(jì)，只需合成序列特異引物，但特異性相對較差，受引物ニ聚體的影響。實(shí)時(shí)熒光染料法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的代表是Sybr Green I熒光染料，新型熒光染料EvaGreen也能用于熒光PCR技術(shù)。EvaGreen只與DNA雙鏈結(jié)合，插入DNA雙鏈時(shí)發(fā)出熒光；DNA雙鏈解鏈時(shí)釋放出來，熒光信號急劇減弱。在加入了熒光染料的體系內(nèi)，其信號強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。相對于Sybr Green I來說消除了“染料重分布”的缺陷，且對PCR擴(kuò)增的抑制作用很小。目前發(fā)展起來的多重實(shí)時(shí)熒光染料PCR技術(shù)可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)中，通過Tm值分析來區(qū)分不同的核酸片段。多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)因具有高效快捷、高產(chǎn)率、高度特異敏感、能降低實(shí)驗(yàn)成本以及加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。研究證明升溫速率在O. I0C /s-0. 2V /s時(shí)熔解曲線可以區(qū)分Tm值差距2°C左右的不同擴(kuò)增產(chǎn)物，這給引物設(shè)計(jì)增加一定困難的同時(shí)，也限制了部分達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)升溫速率的實(shí)驗(yàn)儀器的應(yīng)用。因此，在現(xiàn)有較為普遍的實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件下，建立一種準(zhǔn)確、快速改變產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重實(shí)時(shí)熒光PCR的方法，具有廣泛的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種準(zhǔn)確、快速改變PCR產(chǎn)物TM值達(dá)到多重?zé)晒釶CR的方法，使不同PCR產(chǎn)物的Tm值差距至少大于2°C，采用該方法能夠在不同型號的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器上有效的區(qū)分不同的產(chǎn)物。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種準(zhǔn)確、快速改變PCR產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重?zé)晒釶CR的方法；在原有不同擴(kuò)增片段Tm值的基礎(chǔ)上，選擇性地挑選至少I種目的片段小的產(chǎn)物，并在所述產(chǎn)物原有上下游引物5’端基于引物設(shè)計(jì)原則有針對性地添加堿基，當(dāng)期望產(chǎn)物TM值變大則相應(yīng)地多增加堿基GC，當(dāng)期望產(chǎn)物Tm值變小則相應(yīng)地多增加堿基AT，從而改變整個(gè)擴(kuò)增片段GC%的比值，以致達(dá)到期望的擴(kuò)增片段Tm值，從而通過熔解曲線能夠有效的區(qū)分不同擴(kuò)增片段。作為本發(fā)明的準(zhǔn)確、快速改變PCR產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重?zé)晒釶CR的方法的改進(jìn)I)、PCR 引物設(shè)計(jì)；2)、樣品總RNA的(少量)抽提；3)、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；4)、多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增；5)、根據(jù)多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增結(jié)果調(diào)整步驟I)中的PCR引物，調(diào)整規(guī)則如下當(dāng)任意2種擴(kuò)增片段的Tm值的差<2時(shí)，選取其中ー個(gè)進(jìn)行改變；改變規(guī)則為在該擴(kuò)增片段所對應(yīng)的原有上下游引物5’端基于引物設(shè)計(jì)原則有針對性地添加堿基當(dāng)期 望產(chǎn)物Tm值變大則相應(yīng)地多增加堿基GC，當(dāng)期望產(chǎn)物Tm值變小則相應(yīng)地多增加堿基AT。作為本發(fā)明的準(zhǔn)確、快速改變PCR產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重?zé)晒釶CR的方法的進(jìn)ー步改進(jìn)多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)體系為5μ I 的 10XPCR buffer, 5 μ I 的 25mM MgCl2,4 μ I 的dNTP(10mM，每種 2. 5mM), 2. 5 μ I 的 EvaGreen, O. 5 μ I 的 DNA 聚合酶，2 μ I 步驟 3)合成的cDNA以及步驟I)所設(shè)計(jì)的引物(為引物對，包括上、下游引物)中的至少2種(即任意兩種組合、任意三種的組合、或任意四種的組合等等)，每種引物各O. 1-1 μ Μ，反應(yīng)體系總體積 50 μ I (dd H2O 補(bǔ)足)；所用儀器為ABI 7000熒光定量PCR儀，熒光PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 V 3min ；95°C 15s ；58°C 30s ；72°C 30s，熔解曲線程序?yàn)?95°C 15s, 60°C 30s, 95°C 15s ;從60で開始
收集突光信號。本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述方法所得的改變PCR產(chǎn)物Tm值的用途準(zhǔn)確、快速的達(dá)到多重實(shí)時(shí)熒光PCR。本發(fā)明的目的在于解決以下問題(I)、多重實(shí)時(shí)熒光PCR引物設(shè)計(jì)要求條件較高，每ー對引物都要在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段在200bp以下，且無非特異性擴(kuò)增和引物ニ聚體的生成，另外多種引物對在ー個(gè)體系內(nèi)也必須無相互干擾，無引物ニ聚體生成。往往滿足這些嚴(yán)格的要求之后，每種擴(kuò)增產(chǎn)物相互之間Tm差值難以有效區(qū)分開。(2)、多重實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線的制作對實(shí)時(shí)熒光定量儀器要求的條件較高，有研究證明升溫速率在O. l°C/s-0.2°C/s時(shí)，熔解曲線可以區(qū)分Tm值差距2°C左右的不同擴(kuò)增產(chǎn)物，反之較大的升降溫速率則容易使相鄰的兩種擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線峰發(fā)生融合，但是目前普遍使用的熒光定量儀都達(dá)不到O. I0C /s-0. 2V /s的升溫速率，例如ABI 7300熒光定量儀的升溫速率就高達(dá)I. I0C /S。因此建立一種準(zhǔn)確、快速改變產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重實(shí)時(shí)熒光PCR的方法可使多重實(shí)時(shí)熒光PCR發(fā)揮更大的應(yīng)用價(jià)值。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是對多重?zé)晒釶CR產(chǎn)物中某種或者某幾種產(chǎn)物進(jìn)行簡便有效地調(diào)節(jié)產(chǎn)物Tm值。在反應(yīng)體系離子濃度一定的條件下，Tm值主要由產(chǎn)物長度，GC含量及GC分布結(jié)構(gòu)決定的。在不改變原有產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，結(jié)合引物設(shè)計(jì)原則在上游引物和下游引物的5’端添加若干堿基，改變整個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的GC%，期望產(chǎn)物TM值變大則相應(yīng)地增加GC堿基，期望產(chǎn)物Tm值變小則相應(yīng)地増加AT堿基，改變整個(gè)擴(kuò)增片段GC%的比值，以致達(dá)到期望的擴(kuò)增片段Tm值，從而通過熔解曲線能夠有效地區(qū)分不同擴(kuò)增片段。且若擴(kuò)增片段越短那么在引物上人為增加一些堿基對整個(gè)擴(kuò)增片段的Tm值影響越顯著，從而達(dá)到改變整個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值的目的。本發(fā)明具體可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)第一歩PCR引物設(shè)計(jì)本發(fā)明以4種馬鈴薯病毒馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)，馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY),馬鈴薯卷葉病毒(Potato virus, PLRV)及馬鈴薯 A 病毒(Potatovirus, PVA)為試驗(yàn)對象。從NCBI中下載目前已登記的馬鈴薯病毒PVX、PVY、PLRV和PVA所有的序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)引物，選擇各病毒擴(kuò)增產(chǎn)物理論Tm值相差2°C左右的引物對組合，根據(jù)下述實(shí)驗(yàn)測得的4種病毒擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值，利用上述設(shè)計(jì)原則，即有針對性地添加堿基，進(jìn)行調(diào)整，最終設(shè)計(jì)出可以有效區(qū)分4種病毒擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值(形成不同熔解曲線峰)的引物對組合，設(shè)計(jì)引物的時(shí)候注意擴(kuò)增片段長短以及引物自身和引物間ニ聚體的問題。
注表I中的PVX、PLRV-1、PVY、PVA-1所選用的引物，根據(jù)形成的引物對所對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物理論Tm值，選擇各病毒擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值差距2 °C左右的引物對。表I本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的PCR弓丨物
權(quán)利要求
1.準(zhǔn)確、快速改變PCR產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重?zé)晒釶CR的方法；其特征是在原有不同擴(kuò)增片段Tm值的基礎(chǔ)上，選擇性地挑選至少I種目的片段小的產(chǎn)物，并在所述產(chǎn)物原有上下游引物5’端基于引物設(shè)計(jì)原則有針對性地添加堿基，當(dāng)期望產(chǎn)物TM值變大則相應(yīng)地多增加堿基GC，當(dāng)期望產(chǎn)物Tm值變小則相應(yīng)地多增加堿基AT，從而改變整個(gè)擴(kuò)增片段GC%的比值，以致達(dá)到期望的擴(kuò)增片段Tm值，從而通過熔解曲線能夠有效的區(qū)分不同擴(kuò)增片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的準(zhǔn)確、快速改變PCR產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重?zé)晒釶CR的方法，其特征是包括以下步驟 1)、PCR引物設(shè)計(jì)； 2)、樣品總RNA的抽提； 3)、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA； 4)、多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增； 5)、根據(jù)多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增結(jié)果調(diào)整步驟I)中的PCR引物，調(diào)整規(guī)則如下 當(dāng)任意2種擴(kuò)增片段的Tm值的差<2時(shí)，選取其中一個(gè)進(jìn)行改變；改變規(guī)則為在該擴(kuò)增片段所對應(yīng)的原有上下游引物5’端基于引物設(shè)計(jì)原則有針對性地添加堿基當(dāng)期望產(chǎn)物Tm值變大則相應(yīng)地多增加堿基GC，當(dāng)期望產(chǎn)物Tm值變小則相應(yīng)地多增加堿基AT。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的準(zhǔn)確、快速改變PCR產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重?zé)晒釶CR的方法，其特征是所述多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系為5μ I的IOXPCR buffer,5y I的25mM MgCl2,4y I的 dNTP (IOmM)，2. 5 μ I 的 EvaGreen，O. 5 μ I 的 DNA 聚合酶，2 μ I 步驟 3)合成的 cDNA 以及步驟I)所設(shè)計(jì)的引物中的至少2種，每種引物各O. 1-1 μ M，反應(yīng)體系總體積50μ I ; 所用儀器為ABI 7000熒光定量PCR儀，熒光PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C 3min ;95°C 15s ；58°C 30s ；72°C 30s，熔解曲線程序?yàn)?5°C 15s，60°C 30s, 95°C 15s ;從60°C開始收集熒光信號。
4.如權(quán)利要求I 3任一方法所得的改變PCR產(chǎn)物Tm值的用途是準(zhǔn)確、快速的達(dá)到多重實(shí)時(shí)熒光PCR。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種準(zhǔn)確、快速改變PCR產(chǎn)物Tm值達(dá)到多重?zé)晒釶CR的方法；在原有不同擴(kuò)增片段Tm值的基礎(chǔ)上，選擇性地挑選至少1種目的片段小的產(chǎn)物，并在所述產(chǎn)物原有上下游引物5’端基于引物設(shè)計(jì)原則有針對性地添加堿基，當(dāng)期望產(chǎn)物TM值變大則相應(yīng)地多增加堿基GC，當(dāng)期望產(chǎn)物Tm值變小則相應(yīng)地多增加堿基AT，從而改變整個(gè)擴(kuò)增片段GC％的比值，以致達(dá)到期望的擴(kuò)增片段Tm值，從而通過熔解曲線能夠有效的區(qū)分不同擴(kuò)增片段。利用上述方法所得的改變PCR產(chǎn)物Tm值的用途是準(zhǔn)確、快速的達(dá)到多重實(shí)時(shí)熒光PCR。
文檔編號C12Q1/68GK102827924SQ20121008235
公開日2012年12月19日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月26日
發(fā)明者姜永厚, 程菊會(huì), 董沁芳, 郭江峰, 丁先鋒 申請人:浙江理工大學(xué)