專利名稱：基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)芯片領(lǐng)域，特別是涉及一種基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前在體外研究細(xì)胞時(shí)，大多用貼壁的方式進(jìn)行二維平面培養(yǎng)，與體內(nèi)狀態(tài)(三維立體狀態(tài))有較大的區(qū)別。這種二維細(xì)胞培養(yǎng)并不是細(xì)胞生長的天然狀態(tài)，因而細(xì)胞的基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和形態(tài)學(xué)都可能與天然有異。而且二維細(xì)胞培養(yǎng)還有很多明顯的缺陷。 首先是，細(xì)胞的分化不均一，不利于細(xì)胞分化研究及其相關(guān)的研究。其次是，二維培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞數(shù)量較多，而其中有用細(xì)胞數(shù)目很難分選，且浪費(fèi)試劑。將微電子機(jī)械蝕刻技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合所制備的細(xì)胞培養(yǎng)芯片具有明顯的優(yōu)勢(shì)。該芯片能為細(xì)胞培養(yǎng)提供理想的環(huán)境，從而允許細(xì)胞按照預(yù)先設(shè)計(jì)的圖案聚集、三維生長和分化。這個(gè)優(yōu)勢(shì)使得上述芯片的三維培養(yǎng)環(huán)境非常接近于體內(nèi)?；贛EMs技術(shù)的3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的新穎性、先進(jìn)性、獨(dú)特性和產(chǎn)品的競爭優(yōu)勢(shì)在于
①三維培養(yǎng)系統(tǒng)能使細(xì)胞共同生長、互相交流和形成三維的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞功能狀態(tài)和細(xì)胞形狀更加接近體內(nèi)狀態(tài)；
②相比于其他的三維培養(yǎng)系統(tǒng)(如多孔生物材料支架)而言，能夠通過預(yù)先設(shè)置的表面圖案精確控制三維細(xì)胞球體的形狀和細(xì)胞數(shù)目并且能長久保持細(xì)胞的同質(zhì)性；
③能增加細(xì)胞功能產(chǎn)物的分泌；
④能降低細(xì)胞死亡率；
⑤能大幅提聞干細(xì)胞分化效率；
⑥方法相當(dāng)簡單，任何對(duì)腫瘤基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)、干細(xì)胞或再生醫(yī)學(xué)感興趣的實(shí)驗(yàn)室都可以將此系統(tǒng)作為三維細(xì)胞培養(yǎng)的起點(diǎn)。與此同時(shí)，由于細(xì)胞培養(yǎng)的特殊性，芯片制備過程中材料的選擇和制備過程的優(yōu)化也顯得尤為重要，生物相容性差的材料可能抑制細(xì)胞的生長或者分化，影響對(duì)于細(xì)胞正常生理生化狀態(tài)和分化過程的研究以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于MEMs (微電子機(jī)械蝕刻)技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片、制備方法及其應(yīng)用，其能為細(xì)胞培養(yǎng)提供更接近于體內(nèi)的理想環(huán)境，從而允許細(xì)胞按照預(yù)先設(shè)計(jì)的圖案聚集、三維生長或分化。
發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，使用su8-50光刻膠作為三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片材料時(shí)，具有生物相容性好，細(xì)胞生長狀態(tài)好，分化效率高的特點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種基于MEMs (微電子機(jī)械蝕刻)技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，包括步驟
首先將膠原溶液旋涂(spin coating)在玻璃基片上，在室溫?zé)o菌條件下晾干。然后再使用旋涂(spin coating)的方法在上述膠原包被的基片上包被su8_50光刻膠，85°C烘干，然后覆蓋上預(yù)先刻錄好圖案的石英模板，經(jīng)過紫外線(UV)照射曝光，90°C烘干，顯影，用乙酸丁酯漂洗lmin，再用清水漂洗10分鐘，95°C烘干，即獲得所述三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片。所述的膠原可以是鼠尾膠原，特別的可以是鼠尾膠原蛋白I型，所述膠原包被濃度可以為5-15 μ g/cm2,優(yōu)選為5 μ g/cm2
所述的室溫?zé)o菌條件下晾干為在超凈臺(tái)上放置晾干或是在無菌間內(nèi)室溫晾干。所述晾干時(shí)間可以是1-24小時(shí)，優(yōu)選是過夜或12小時(shí)。
所述的玻璃基片優(yōu)選是直徑22mm的圓形玻璃基片。所述Su8-50光刻膠的旋涂可以分兩次進(jìn)行，第一次轉(zhuǎn)速650rpm，時(shí)間10s，第二次轉(zhuǎn)速3500rpm，時(shí)間20s。所述85°C烘干優(yōu)選是在85°C熱板上烘干10分鐘；所述90°C烘干優(yōu)選是在90°C熱板上烘干90s ;所述95°C烘干優(yōu)選是在95°C熱板上烘干I分鐘。所述的預(yù)先刻錄好圖案的石英模板是按照實(shí)際需求在石英板上設(shè)計(jì)的圖案，經(jīng)過無菌處理后晾干。所述刻錄好圖案可以是任意圖案，優(yōu)選可以是直徑100 μ m的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。優(yōu)選地，利用本方法所述制備方法制備的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片上將包含若干個(gè)圓形微區(qū)(microdomain),直徑100 μ m,圓形微區(qū)間的距離同樣是100 μ m。所述的漂洗和烘干過程均為無菌環(huán)境。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種所述芯片的制備方法，包括步驟首先用無菌乙酸(O. 006mol/L)將鼠尾膠原蛋白I型稀釋成濃度為O. 025mg/ml的膠原溶液，并將其旋涂(spin coating)在直徑22mm的圓形玻璃基片上,包被濃度為5 μ g/cm2,在超凈臺(tái)上放置過夜晾干。然后再使用旋涂(spin coating)的方法在上述膠原包被的基片上包被su8-50光刻膠，su8-50光刻膠的旋涂分兩次進(jìn)行，第一次轉(zhuǎn)速650rpm，時(shí)間10s，第二次轉(zhuǎn)速3500rpm，時(shí)間20s，在85°C熱板上烘干10分鐘，然后覆蓋上預(yù)先刻錄好圖案的石英模板，用波長300nm強(qiáng)度為2. 6mff/cm2的紫外線(UV)曝光500s，在90°C熱板上烘干90s，顯影20min，用乙酸丁酯漂洗lmin，再用清水漂洗10分鐘，后在95°C熱板上烘干I分鐘，即獲得所述三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片。特別的，所述刻錄好圖案可以是任意圖案，優(yōu)選可以是直徑ΙΟΟμπι的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。優(yōu)選地，利用本方法所述制備方法制備的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片上將包含若干個(gè)圓形微區(qū)，直徑100 μ m,圓形微區(qū)間的距離同樣是100 μ m。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法所制備出的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片。特別的，本發(fā)明提供了由本發(fā)明中任意制備方法所制備的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片。
在另外一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法在細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化或細(xì)胞之間相互作用的研究中的應(yīng)用。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。特別的，上述應(yīng)用中所述細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。特別的，上述應(yīng)用中所述細(xì)胞可以是正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。特別的，上述應(yīng)用中所述細(xì)胞可以是HH細(xì)胞(牛主動(dòng)脈上皮細(xì)胞)、ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)或MSC細(xì)胞(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)。特別的，所述ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)可以是hESC BGOlV細(xì)胞。特別的，所述培養(yǎng)可以是三維培養(yǎng)。
特別的，所述培養(yǎng)可以是分化培養(yǎng)。優(yōu)選的，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法在ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)或MSC細(xì)胞(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)三維培養(yǎng)中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述應(yīng)用為細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究、干細(xì)胞分化與誘導(dǎo)機(jī)制基礎(chǔ)研究、三維培養(yǎng)機(jī)制研究、藥物篩選、細(xì)胞(包括干細(xì)胞)培養(yǎng)條件優(yōu)化和/或臨床醫(yī)學(xué)中的細(xì)胞治療。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法所制備出的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片在細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化或細(xì)胞之間相互作用的研究中的應(yīng)用。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法所制備出的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。特別的，所述細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。特別的，所述細(xì)胞可以是正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。特別的，上述應(yīng)用中所述細(xì)胞可以是HH細(xì)胞、ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)或MSC細(xì)胞(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)。特別的，所述ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)可以是hESC BGOlV細(xì)胞。特別的，所述培養(yǎng)可以是三維培養(yǎng)。特別的，所述培養(yǎng)可以是分化培養(yǎng)。優(yōu)選的，本發(fā)明提供了一種基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法所制備出的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片在ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)或MSC細(xì)胞(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)三維培養(yǎng)中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述應(yīng)用為細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究、干細(xì)胞分化與誘導(dǎo)機(jī)制基礎(chǔ)研究、三維培養(yǎng)機(jī)制研究、藥物篩選、細(xì)胞(包括干細(xì)胞)培養(yǎng)條件優(yōu)化和/或臨床醫(yī)學(xué)中的細(xì)胞治療。
本發(fā)明的有益效果
(1)利用光刻膠將培養(yǎng)區(qū)間格成小室，能使細(xì)胞共同生長、互相交流并形成三維的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞功能狀態(tài)和細(xì)胞形狀更加接近體內(nèi)狀態(tài)；
(2)利用MEMs技術(shù)，能夠通過預(yù)先設(shè)置的表面圖案精確控制三維細(xì)胞球體的形狀和細(xì)胞數(shù)目并且能長久保持細(xì)胞的同質(zhì)性；
(3)利用玻璃平板作為基片有利于觀察細(xì)胞的生長狀況；(4)100 μ m圓形微區(qū)圖案的選擇有利于細(xì)胞的三維生長及分化；
(5)su8-50光刻膠應(yīng)用于生物芯片的報(bào)道很少，也均沒有應(yīng)用于三維細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道，同時(shí)三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片制備過程中，各個(gè)步驟參數(shù)的選擇例如膠原的濃度、光刻膠包被厚度、烘干溫度和時(shí)間、圖案的選擇等對(duì)于所制備芯片的培養(yǎng)性能均影響很大。發(fā)明人經(jīng)過不斷地試驗(yàn)和探索，獲得了利用suS-50制備基于MEMs (微電子機(jī)械蝕刻技術(shù))技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的方法，所獲得的芯片具有生物相容性好，細(xì)胞生長狀態(tài)好，分化效率高的特點(diǎn)。



圖I是低放大倍數(shù)下HH細(xì)胞形態(tài)。圖2是高放大倍數(shù)下HH細(xì)胞形態(tài)。圖3是高放大倍數(shù)下ES細(xì)胞形態(tài)。圖4是低放大倍數(shù)下MSC細(xì)胞形態(tài)。圖5是MSC細(xì)胞存活染色結(jié)果。其中，左上圖為鈣黃綠素(Calcein AM)染色結(jié)果，右上圖為碘化丙啶(PI)染色結(jié)果，左下圖為白光結(jié)果，右下圖為三圖融合結(jié)果(Merge)。圖6是MSC細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞過程中脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá)。圖7是MSC細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞過程中成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明內(nèi)容講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)和修改，這些等效形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)驗(yàn)材料
下述實(shí)施例中，膠原采用鼠尾膠原蛋白I型(5mg/ml),購自杭州生友生物技術(shù)有限公司；su8_50光刻膠及su8顯影液均購自MicroChem公司，P-PEG購自Toyo gosei公司，HH細(xì)胞系購自JCRB cell bank(JCRB0099);所用ES細(xì)胞為hESC BG01V，該細(xì)胞系及培養(yǎng)所用DMEM F12培養(yǎng)基均購自ATCC，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs及培養(yǎng)所用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基均購自Cambrex公司。
實(shí)施例I、三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備
A、基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備(su8-50芯片)
首先用無菌乙酸(O. 006mol/L)將鼠尾膠原蛋白I型稀釋成濃度為O. 025mg/ml的膠原溶液，并將其旋涂(spin coating)在直徑22mm的圓形玻璃基片上，包被濃度為5 μ g/cm2，在超凈臺(tái)上放置過夜晾干。然后再使用旋涂(spin coating)的方法在上述膠原包被的基片上包被su8-50光刻膠，su8-50光刻膠的旋涂分兩次進(jìn)行，第一次轉(zhuǎn)速650rpm，時(shí)間10s，第二次轉(zhuǎn)速3500rpm，時(shí)間20s，在85°C熱板上烘干10分鐘，然后覆蓋上預(yù)先刻錄好圖案的石英模板，用波長300nm強(qiáng)度為2. 6mff/cm2的紫外線(UV)曝光500s，在90°C熱板上烘干90s，顯影20min，用乙酸丁酯漂洗lmin，再用清水漂洗10分鐘，后在95°C熱板上烘干I分鐘，即獲得所述三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片。所述刻錄好圖案可以是任意圖案，本實(shí)施例中所米用的是圖案是直徑100 μ m的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。利用本方法所制備的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片上將包含若干個(gè)圓形微區(qū)，直徑100 μ m，圓形微區(qū)間的距離同樣是100 μ m。為簡單起見，將上述芯片命名為su8-50芯片。
B、基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備(P-PEG芯片)
首先制備濃度為O. 3%的膠原溶液，并將其包被在直徑22mm的圓形玻璃基片上，在細(xì)胞培養(yǎng)條件下凝膠2小時(shí)，并在37°C晾干2天。然后將P-PEG包被在上述膠原包被的基片上(第I次轉(zhuǎn)速為500rpm，5s，第2次轉(zhuǎn)速為3000rpm，30s)，在60°C熱板上烘干，然后覆蓋上預(yù)先刻錄好圖案的石英模板，經(jīng)過紫外線(UV)照射曝光，顯影，在水中樹脂化，再在60°C熱板上烘干，即獲得所述三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片。所述刻錄好圖案可以是任意圖案，本實(shí)施例中所米用的是圖案是直徑100 μ m的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。利用本方法所制備的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片上將包含若干個(gè)圓形微區(qū)，直徑100 μ m，圓形微區(qū)間的距離同樣是100 μ m。為簡單起見，將上述芯片命名為P-PEG芯片。
實(shí)施例2、HH細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果
按常規(guī)方法培養(yǎng)HH細(xì)胞，將HH細(xì)胞系(牛主動(dòng)脈上皮細(xì)胞)接種于實(shí)施例I所制備的SU8-50芯片微區(qū)上進(jìn)行培養(yǎng)，接種密度為5X IO5個(gè)/芯片，培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為添加10%胎牛血清的常規(guī)MEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)2天后，如圖I和圖2所示，細(xì)胞呈三維生長，生長形態(tài)良好。
實(shí)施例3、ES細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果
按常規(guī)方法培養(yǎng)ES細(xì)胞(hESC BG01V)，將ES細(xì)胞接種于實(shí)施例I所制備的su8_50芯片微區(qū)上進(jìn)行培養(yǎng)，接種密度為3X IO5個(gè)/芯片，培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為DMEM F12培養(yǎng)基；培養(yǎng)3天后，如圖3所示，細(xì)胞呈三維立體生長，生長形態(tài)良好。
實(shí)施例4、MSC細(xì)胞的培養(yǎng)及分化結(jié)果
A、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的培養(yǎng)
將傳代第5次的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以6X IO5個(gè)/芯片的密度接種在實(shí)施例I所制備的兩種芯片(su8-50芯片和P-PEG芯片)的微區(qū)上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為間充質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基；在細(xì)胞球形成以后，每3天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)3天后，如圖4所示，細(xì)胞呈三維立體生長，生長形態(tài)良好。B、三維骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞球存活/死亡染色
按常規(guī)方法對(duì)于三維骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞球進(jìn)行細(xì)胞存活/死亡染色，首先用PBS溶液漂洗細(xì)胞三次，然后加入混合后的LIVE/DEAD檢測(cè)試劑(Sigma)，37°C孵育40分鐘，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。如圖5所示，細(xì)胞全部為存活狀態(tài)，生長狀態(tài)良好。
C、三維骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞球的分化 (O向脂肪細(xì)胞分化
按常規(guī)方法誘導(dǎo)三維骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞球分化為脂肪細(xì)胞，每3天更換一次培養(yǎng)基，直到細(xì)胞100%長滿，將培養(yǎng)基替換為脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基(含有L-谷氨酰胺和地塞米松)以誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞發(fā)生。誘導(dǎo)5-7天后，在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞中形成脂滴，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。 (2)向成骨細(xì)胞分化
按常規(guī)方法誘導(dǎo)三維骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞球分化為成骨細(xì)胞，每3天更換一次培養(yǎng)基，直到細(xì)胞50%-70%長滿，將培養(yǎng)基替換為成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(含有L-谷氨酰胺、地塞米松和抗壞血酸鹽)以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞發(fā)生。誘導(dǎo)7天后，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞體積增大，變得狹長，似魚群樣排列，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
D、使用RT-PCR法定量測(cè)定三維骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞球分化的RNA水平 (O實(shí)驗(yàn)方法
首先從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取出總RNA，用常規(guī)的RT-PCR獲得cDNA，對(duì)cDNA樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)。我們選取本領(lǐng)域常規(guī)使用的PPAR-Y基因作為脂肪細(xì)胞分化的一個(gè)標(biāo)志物，選擇ALP基因作為成骨細(xì)胞分化的一個(gè)標(biāo)志物，選擇GAPDH基因作為內(nèi)參。所用PCR弓丨物序列分別為
3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)
上游5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’，
下游5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，
過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR-Y)
上游5’ -TCAGGTTTGGGCGGATGC-3’，
下游5’ -TCAGCGGGAAGGACTTTATGTATG-3’
堿性磷酸酶(ALP)
上游5’ -GACCCTTGACCCCCACAAT-3’，
下游5，-GCTCGTACTGCATGTCCCCT-3，.
擴(kuò)增條件如下初始變性94°C，5min，隨后變性94°C，30s，退火59_70°C，45s，延伸72°C，45s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后延伸72°C，10分鐘。在擴(kuò)增實(shí)施例I中兩種三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片(su8-50芯片和P-PEG芯片)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞球樣本以外，還使用單層細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，作為對(duì)照，所述單層培養(yǎng)按本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行，其他條件均與三維細(xì)胞芯片培養(yǎng)相同。RT-PCR法均進(jìn)行三組平行測(cè)定，數(shù)據(jù)顯著性分析使用單尾t檢驗(yàn)，顯著性使用95%概率值確定。
(2)PPAR-Y基因表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
通過實(shí)時(shí)定量PCR獲得PPAR-Y基因與內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)水平，確定不同分化時(shí)間點(diǎn)(第8天、第16天、第26天)標(biāo)志基因的表達(dá)變化。以單層細(xì)胞培養(yǎng)組分化第8天時(shí)為基數(shù)。
從圖6可以清楚看出，與單層細(xì)胞培養(yǎng)組和P-PEG芯片組相比，使用su8_50芯片培養(yǎng)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)志物PPAR-Y的表達(dá)顯著均提高(P〈0. 05)，誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞的效率大大提高。
(3)ALP基因表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
通過實(shí)時(shí)定量PCR獲得ALP基因與內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)水平，確定不同分化時(shí)間點(diǎn)(第3天、第6天、第10天)標(biāo)志基因的表達(dá)變化。以單層細(xì)胞培養(yǎng)組分化第3天時(shí)為基數(shù)。從圖7可以清楚看出，與單層細(xì)胞培養(yǎng)組和P-PEG芯片組相比，使用su8-50芯片培養(yǎng)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物ALP的表達(dá)均顯著提高(P〈0. 05)，誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的效率大大提高。
權(quán)利要求
1.一種基于MEMs (微電子機(jī)械蝕刻)技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，包括步驟 首先將膠原溶液旋涂(spin coating)在玻璃基片上，在室溫?zé)o菌條件下晾干；然后再使用旋涂(spin coating)的方法在上述膠原包被的基片上包被su8_50光刻膠，85°C烘干，然后覆蓋上預(yù)先刻錄好圖案的石英模板，經(jīng)過紫外線(UV)照射曝光，90°C烘干，顯影，用乙酸丁酯漂洗lmin，再用清水漂洗10分鐘，95°C烘干，即獲得所述三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述膠原可以是鼠尾膠原，特別的可以是鼠尾膠原蛋白I型。
3.如權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，所述膠原的包被濃度可以為5-15 μ g/cm2,優(yōu)選為 5 μ g/cm2。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，所述的室溫?zé)o菌條件下晾干為在超凈臺(tái)上放置晾干或是在無菌間內(nèi)室溫晾干；所述晾干時(shí)間可以是1-24小時(shí)，優(yōu)選是過夜或12小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的制備方法，其特征在于，所述的玻璃基片優(yōu)選是直徑22mm的圓形玻璃基片。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的制備方法，其特征在于，所述suS-50光刻膠的旋涂分兩次進(jìn)行，第一次轉(zhuǎn)速650rpm，時(shí)間10s，第二次轉(zhuǎn)速3500rpm，時(shí)間20s。
7.如權(quán)利要求1-6任一所述的制備方法，其特征在于，所述85°C烘干優(yōu)選是在85°C熱板上烘干10分鐘；所述90°C烘干優(yōu)選是在90°C熱板上烘干90s ;所述95°C烘干優(yōu)選是在95 °C熱板上烘干I分鐘。
8.如權(quán)利要求1-7任一所述的制備方法，其特征在于，所述的預(yù)先刻錄好圖案的石英模板是按照實(shí)際需求在石英板上設(shè)計(jì)的圖案，經(jīng)過無菌處理后晾干。
9.如權(quán)利要求1-8任一所述的制備方法，其特征在于，所述刻錄好圖案可以是任意圖案。
10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述刻錄好圖案優(yōu)選是直徑100μ m的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。
11.如權(quán)利要求ι- ο任一所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法制備的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片上包含若干個(gè)圓形微區(qū)(microdomain),直徑100 μ m,圓形微區(qū)間的距離同樣是 100 u rtio
12.如權(quán)利要求1-11任一所述的制備方法，其特征在于，所述的漂洗和烘干過程均為無菌環(huán)境。
13.如權(quán)利要求1-12任一所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括步驟首先用無菌乙酸(0. 006mol/L)將鼠尾膠原蛋白I型稀釋成濃度為0. 025mg/ml的膠原溶液，并將其旋涂(spin coating)在直徑22mm的圓形玻璃基片上,包被濃度為5 μ g/cm2,在超凈臺(tái)上放置過夜晾干；然后再使用旋涂(spin coating)的方法在上述膠原包被的基片上包被su8-50光刻膠，su8-50光刻膠的旋涂分兩次進(jìn)行，第一次轉(zhuǎn)速650rpm，時(shí)間10s，第二次轉(zhuǎn)速3500rpm，時(shí)間20s，在85°C熱板上烘干10分鐘，然后覆蓋上預(yù)先刻錄好圖案的石英模板，用波長300nm強(qiáng)度為2. 6mff/cm2的紫外線(UV)曝光500s，在90°C熱板上烘干90s，顯影20min，用乙酸丁酯漂洗lmin，再用清水漂洗10分鐘，后在95°C熱板上烘干I分鐘，即獲得所述三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片。
14.如權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于，所述刻錄好圖案可以是任意圖案。
15.如權(quán)利要求14所述的制備方法，其特征在于，所述刻錄好圖案優(yōu)選是直徑100μ m的圓形，圓形間的距離同樣是100 μ m。
16.如權(quán)利要求1-15所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法制備的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片上將包含若干個(gè)圓形微區(qū)，直徑100 μ m,圓形微區(qū)間的距離同樣是100 μ m。
17.如權(quán)利要求1-16任一所述的制備方法所制備出的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片。
18.如權(quán)利要求1-16任一所述的制備方法或如權(quán)利要求17所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片在細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化或細(xì)胞之間相互作用的研究中的應(yīng)用。
19.如權(quán)利要求1-16任一所述的制備方法或如權(quán)利要求17所述的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
20.如權(quán)利要求18或19的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞可以是動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求18或19的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞可以是正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求18-21任一的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞可以是HH細(xì)胞(牛主動(dòng)脈上皮細(xì)胞)、ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)或MSC細(xì)胞(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)。
23.如權(quán)利要求22的應(yīng)用，其特征在于，所述ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)可以是hESCBGOlV細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求18-23任一的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)可以是三維培養(yǎng)。
25.如權(quán)利要求18-24任一的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)可以是分化培養(yǎng)。
26.如權(quán)利要求18-25任一的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為在ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)或MSC細(xì)胞(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)三維培養(yǎng)中的應(yīng)用。
27.如權(quán)利要求18-26任一的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究、干細(xì)胞分化與誘導(dǎo)機(jī)制基礎(chǔ)研究、三維培養(yǎng)機(jī)制研究、藥物篩選、細(xì)胞(包括干細(xì)胞)培養(yǎng)條件優(yōu)化和/或臨床醫(yī)學(xué)中的細(xì)胞治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于MEMs技術(shù)的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片、制備方法及其應(yīng)用，所述芯片的制備方法包括步驟首先將膠原溶液旋涂在玻璃基片上，在室溫?zé)o菌條件下晾干。然后再使用旋涂的方法在上述膠原包被的基片上包被su8-50光刻膠，85℃烘干，然后覆蓋上預(yù)先刻錄好圖案的石英模板，經(jīng)過紫外線照射曝光，90℃烘干，顯影，用乙酸丁酯漂洗1min，再用清水漂洗10分鐘，95℃烘干，即獲得所述三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片。本發(fā)明的三維細(xì)胞培養(yǎng)芯片具有方便、精確、集約的特性，可以精確控制多細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)模擬細(xì)胞體內(nèi)的行為特征和生長環(huán)境，為研究細(xì)胞間的相互作用提供了方便，可用于研究細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的作用，使體外細(xì)胞研究環(huán)境更接近體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境。
文檔編號(hào)C12N5/07GK102816694SQ201210085698
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者王文杰 申請(qǐng)人:王文杰, 上官俊龍, 閆翊斐, 趙青