專利名稱：膀胱癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種膀胱癌易感基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結(jié)果從基因?qū)用嬖u估膀胱癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級別，并作為預(yù)防和治療膀胱癌的方向指導(dǎo)。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)，膀胱癌位列男性最常見實(shí)體瘤的第四位，在女性位列第七位，每年新診斷的膀胱癌患者超過350000名。在我國，膀胱癌目前仍是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤， 并且近幾年來，我國部分城市膀胱癌的發(fā)病率呈現(xiàn)穩(wěn)中有升的趨勢。國內(nèi)大城市中如北京， 上海，天津，膀胱癌的發(fā)病率已位列男性常見惡性腫瘤的第六位，而死亡率位列第七位。膀胱癌好發(fā)年齡51-70歲，發(fā)病高峰為65歲?？梢哉f，膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的綜合結(jié)果，與環(huán)境因素、遺傳因素以及它們的相互作用等密切相關(guān)。有研究證實(shí)多種外源性化合物只是前致癌物，需經(jīng)過體內(nèi)代謝酶的代謝激活轉(zhuǎn)變?yōu)榻K致癌物才能發(fā)揮致癌作用。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是參與多種親電子致癌物的解毒代謝過程的II相代謝酶，已發(fā)現(xiàn)GST多態(tài)性可影響個(gè)體患膀胱癌的易感性。有關(guān)GST基因多態(tài)性的分析表明，GSTTl空白基因型(GSTTl-null)攜帶群體膀胱癌患病風(fēng)險(xiǎn)比正常 GSTTl基因型(GSTTl-present)攜帶群體增高54%。研究結(jié)果還表明，GSTTl-null基因型與膀胱癌的病理分級和臨床分期存在正相關(guān)，膀胱癌腫瘤分級越低、浸潤性越強(qiáng)的膀胱癌患者攜帶GSTTl空白基因型(GSTTl-null)的頻率越高。這可能是由于GSTTl空白基因型 (GSTTl-null)攜帶者體內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性降低，使體內(nèi)II相解毒代謝反應(yīng)效率降低， 外源性致癌物或中間代謝產(chǎn)物在體內(nèi)積累，從而使機(jī)體腫瘤發(fā)生率增高，并且攜帶上述基因型的膀胱癌患者，基因型頻率越高，腫瘤惡性程度和浸潤深度越高，預(yù)后往往愈差。TNF是體內(nèi)具有多種生物活性的重要致炎細(xì)胞因子，主要由脂多糖激活的單核、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等分泌。TNF有抗病毒、廣泛的誘導(dǎo)炎癥和免疫調(diào)節(jié)功能，最突出的是其強(qiáng)大的抗腫瘤特性。從而在自身免疫性疾病、感染性疾病，特別是在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。研究表明TNF-0G252A單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性與膀胱癌易感性密切相關(guān)， 因此可以作為膀胱癌易感性的危險(xiǎn)因素之一。綜上所述，鑒于GSTMl和TNF-β在膀胱癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者在膀胱癌發(fā)生相關(guān)的基因單核苷酸位點(diǎn)基因型，及時(shí)篩查出易患膀胱癌的高危人群，從而有針對性的預(yù)防和治療膀胱癌，這對于降低膀胱癌的發(fā)病率有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于檢測GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，TNF-β基因的G252A的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可作為評估膀胱癌發(fā)病的危險(xiǎn)因子的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種膀胱癌易感基因檢測試劑盒。
該試劑盒包括檢測GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，TNF-β基因的G252A的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)；PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應(yīng)體系10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產(chǎn)物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應(yīng)體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I.檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(I)GSTMl (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3;(2)TNF-@ (G252A)正向引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'TNF-β (G252A)反向引物5' TTCGTGCTTTGGACTACCG3'PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反應(yīng)條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I 分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物20ul, lU/ul SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應(yīng)使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測序引物(I) GSTMl (Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3' (2)TNF-β (G252A)測序引物5, CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA 測序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.對人們進(jìn)行預(yù)防膀胱癌發(fā)病的基因無創(chuàng)檢測的服務(wù)I.采樣及抽提DNA由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的GSTMl基因是否缺失(Null/ Present)，TNF- β基因G252A的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA測序，確定這2個(gè) SNPs位點(diǎn)的基因型。3.膀胱癌發(fā)病高危人群風(fēng)險(xiǎn)評估通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具膀胱癌易感基因風(fēng)險(xiǎn)評估分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說明了受檢者GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，TNF-β基因G252A的2個(gè)基因上SNP位點(diǎn)基因檢測信息以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級別，并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明和解讀膀胱癌易感基因無創(chuàng)檢測報(bào)告單。
權(quán)利要求
1.一種檢測膀胱癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于檢測GSTMl基因是否缺失 (Nul 1/Present), TNF-β基因的G252A位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，TNF-β基因的G252A的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這2個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，TNF-β基因的G252A的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出上述2個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的2對特異性引物序列如下(1)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(2)TNF- β (G252A)正向引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'TNF-β (G252A)反向引物5' TTCGTGCTTTGGACTACCG3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的2條DNA測序引物序列如下(1)GSTMl(Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(2)TNF-P(G252A)測序引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1) 0 反應(yīng)體系10父？0 反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶O. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產(chǎn)物純化體系川/111SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，ddH20 3. 875ul。(3)測序反應(yīng)體系25%BigDye mixlul，3.2uM DNA 測序引物 lul，125mMEDTA 溶液 Iul，100% 乙醇溶液 15111，70%乙醇溶液30111，！1101 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測膀胱癌易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測GSTM1基因是否缺失(Null/Present)，TNF-β基因的G252A位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測與膀胱癌發(fā)生密切相關(guān)的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來評估受檢者膀胱癌患病的風(fēng)險(xiǎn)級別，并最終根據(jù)每一位受檢者的基因檢測結(jié)果從基因?qū)用嬷笇?dǎo)受檢者有針對性的預(yù)防膀胱癌的發(fā)生，降低膀胱癌的發(fā)病幾率。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細(xì)胞采樣，無痛、無創(chuàng)、避免了交叉感染。測序檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，不必購置價(jià)格昂貴的進(jìn)口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102586468SQ201210086669
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司