專利名稱：一步法半巢式篩選人乳頭瘤病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種一步法半巢式篩選人乳頭瘤病毒的方法，能對HPV病毒基因進行檢測，特異性好，靈敏度高。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(Human papillomavirlls, HPV)屬于乳多空病毒科的乳頭瘤病毒屬，HPV于1949年由Strauss在電鏡下發(fā)現(xiàn)，是一種小的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，其基因組長度約8000bp。目前已經(jīng)確定的HPV亞型有100余種，依其感染的上皮所在部位分為皮膚型HPV 和生殖道上皮型HPV，大約30多種型別可感染婦女生殖道,其中約20種與腫瘤相關(guān)。依據(jù)HPV不同亞型與腫瘤發(fā)生的危險性高低分為低危型和高危型HPV，由于不同亞型HPV的致病機制和致癌危險性各不相同，因此對HPV各亞型進行分型檢測有重要的臨床意義。由于HPV不能在體外細胞培養(yǎng)，故不能用簡單的血清學檢測進行HPV的診斷和分型。目前主要是通過應用分子生物學方法進行HPV DNA的檢測。在臨床實驗室中，目前檢測HPV的常用方法經(jīng)常是普通多聚酶鏈反應(PCR)，多色熒光實時PCR，由于HPV的類型很多，而且設(shè)計共同引物比較困難，所以經(jīng)常采用兩步巢式PCR的方法，即先做外側(cè)PCR，然后用外側(cè)PCR產(chǎn)物為模板來做第二次PCR，操作繁瑣，而且容易污染。所以不利于實驗室大批量的樣本檢測。實時熒光PCR (real-time PCR)技術(shù)實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍。其以特異性強、靈敏度高、自動化、重復性好、定量準確、全封閉反應等優(yōu)點，成為分子生物學和分子診斷的重要技術(shù)平臺，并廣泛應用于遺傳病、病原體和腫瘤等方面的檢測和診斷。在病原體檢測方面，實時熒光PCR技術(shù)已應用于肝病、性病以及人類免疫缺陷病毒(HIV)等的臨床診斷。而在腫瘤診斷方面，實時熒光PCR技術(shù)正成為檢測腫瘤微小殘留分子標志的一種必備工具。實時熒光PCR技術(shù)發(fā)展已相當成熟；其操作簡單，自動化程度高，耗時短，結(jié)果易于判斷；且能滿足臨床實驗室的高通量要求。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明將實時熒光PCR技術(shù)和一步法半巢式PCR技術(shù)結(jié)合起來應用于HPV病毒基因檢測，開發(fā)了一種新型的HPV基因篩選的檢測方法。一步法半巢式篩選人乳頭瘤病毒的方法，采用SYBR Green法實時熒光PCR進行HPV病毒基因檢測，其特征在于，采用以下簡并引物擴增HPV基因
HPV-out1-Forward TGTCCA/CAA/GA/GGGAA/TACTGAGG ；
HPV-out2-Reverse AAGCA/CCAGGGA/TCATAAC/T AATGC ；
HPV-in AAGAAAAATAAACTGTAAATCATATT。(其中“/”表示簡并)
進一步地，所述實時熒光PCR反應液包括1. 5mM MgCl2, 200mM dNTP混合物，IOpmolHPV-outl-Reverse 和 HPV-in 引物，2. 5pmol HPV-oul-Forward 引物，20ulPCR反應體系含有IU 的多聚酶和 Iul 10XSYBR Green。更進一步地，所述實時熒光PCR擴增條件為95 1為3分鐘；95°C 30秒、53 V30秒、72 V 30秒，共10循環(huán)；95 V 30秒、40 V 30秒、72 V 30秒，共30循環(huán)；最后延長72 V 10分鐘。本發(fā)明通過對30多種HPV的亞型的研究，發(fā)現(xiàn)在所有HPV的LI區(qū)能找到它們的共同上下游序列，所以引物設(shè)計為
權(quán)利要求
1.一步法半巢式篩選人乳頭瘤病毒的方法，采用SYBR Green法實時熒光PCR進行HPV病毒基因檢測，其特征在于，采用以下簡并引物擴增HPV基因HPV-out1-Forward TGTCCA/CAA/GA/GGGA A/TACTGAGG ；HPV-out2-Reverse AAGCA/CCAGGGA/TCATAAC/T AATGC ；HPV-in AAGAAAAATAAACTGTAAATCATATT。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述實時熒光PCR反應液包括1.5mMMgCl2, 200mM dNTP 混合物，IOpmol HPV-outI-Reverse 和 HPV-in 引物，2.5pmolHPV-ou I-Forward 引物，20ulPCR 反應體系含有 IU 的多聚酶和 Iul 10 X SYBR Green。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述實時熒光PCR擴增條件為95V為3分鐘；95°C 30 秒、53 °C 30 秒、72 V 30 秒，共 10 循環(huán)；95 °C 30 秒、40 V 30 秒、72 V 30秒，共30循環(huán)；最后延長72 V 10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一步法半巢式篩選人乳頭瘤病毒的方法，采用SYBRGreen法實時熒光PCR進行HPV病毒基因檢測，其特征在于，采用以下簡并引物擴增HPV基因HPV-out1-ForwardTGTCCA/CAA/GA/GGGAA/TACTGAGG；HPV-out2-ReverseAAGCA/CCAGGGA/TCATAAC/TAATGC；HPV-inAAGAAAAATAAACTGTAAATCATATT。本發(fā)明用一步法即可對HPV基因進行檢測，避免了傳統(tǒng)兩步巢式PCR方法需要進行兩次PCR、操作繁瑣易產(chǎn)生污染的弊端，且特異性好，靈敏度高。
文檔編號C12R1/93GK102634606SQ20121008715
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者周曉犢, 孫翠蓮, 方國偉, 王淑一, 薛群 申請人:上海艾迪康醫(yī)學檢驗所有限公司