專利名稱：一種動物病毒的純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物病毒的純化工藝。
背景技術(shù)：
近年來，動物病毒性傳染病(如禽流感、口蹄疫和PRRS等)相繼爆發(fā)并流行，引起動物大規(guī)模的死亡，造成了巨大的經(jīng)濟損失。疫苗接種是現(xiàn)階段我國防控動物疫病的最有效技術(shù)手段，在畜牧業(yè)的發(fā)展中發(fā)揮著越來越重要的作用，極大地促進了動物養(yǎng)殖業(yè)的繁榮發(fā)展。
目前，動物用疫苗可分為常規(guī)疫苗和基因工程疫苗兩大類。根據(jù)制備工藝和組成成分的不同，常規(guī)疫苗可分為滅活疫苗、弱毒活疫苗、單苗、多價(聯(lián))疫苗等。隨著分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)、分子遺傳學(xué)的研究取得進展與基因工程技術(shù)的應(yīng)用，又出現(xiàn)了基因工程疫苗，主要包括亞單位疫苗、合成肽苗、抗獨特型抗體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗以及核酸疫苗等。但目前生產(chǎn)實踐中大量應(yīng)用的疫苗仍以常規(guī)疫苗為主。動物疫苗同人類的疫苗一樣,是保證動物健康的必不可少的措施。但是由于動物疫苗的成本偏低，所以其疫苗生產(chǎn)技術(shù)和工藝的發(fā)展相對滯后?，F(xiàn)有動物疫苗的問題之一就是病毒抗原純度不高，導(dǎo)致疫苗的副反應(yīng)大、免疫效果不夠確實。原因在于疫苗的生產(chǎn)工藝相對落后，缺乏足夠的純化步驟，不能提供高效、高純的病毒抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種動物病毒的純化工藝。本發(fā)明提供了一種動物病毒的純化方法，是將動物病毒液依次進行離心、超濾、和分子篩層析，得到純化的病毒液。所述方法可包括如下步驟(I)將動物病毒液離心收集上清液；(2)將步驟(I)得到的上清液進行超濾濃縮，得到病毒濃縮液；(3)將步驟(2)得到的病毒濃縮液進行分子篩層析，得到純化的病毒液。所述動物病毒液的制備方法具體如下將動物病毒接種動物細胞并培養(yǎng)，得到病毒液。所述動物病毒可為水貂腸炎病毒，具體可為MEVB毒株。所述動物細胞可為F81細胞。所述接種的劑量可為MOI = 0.05-0. 15，所述培養(yǎng)的條件可為37°C、96-120小時。所述接種的劑量具體可為MOI = O. 1，所述培養(yǎng)的時間具體可為96小時。所述步驟(I)中，所述離心的條件可為4°C、8000-12000g、15_20分鐘。所述步驟(I)中，所述離心的條件具體可為4°C、10000g、18分鐘。所述步驟(2)中，所述超濾濃縮的方法可為將30-50體積份所述上清液用截留分子量為30kD的超濾膜包濃縮至I體積份。所述步驟(2)中，所述超濾的方法具體可為將50體積份所述上清液用截留分子量為30kD的超濾膜包濃縮至I體積份。所述步驟(3)中，所述分子篩層析的參數(shù)可如下層析柱型號為IndexColumn 100/950 ；填充介質(zhì)為Sepharose4 Fast Flow ；
洗脫液為ρΗ7·4-7. 8、0· 04mol/L 的 PBS 緩沖液；收集第一個洗脫峰，即為純化的病毒液。所述步驟(3)中，所述洗脫液具體可為pH7. 6,0. 04mol/L的PBS緩沖液。所述分子篩層析中，可采用8%柱體積的上樣量。所述分子篩層析中，所述洗脫液的流速可為200ml/min。以上任一所述方法制備得到的純化的病毒液均屬于本發(fā)明的保護范圍。所述純化的病毒液可用于制備動物疫苗。本發(fā)明以水貂腸炎病毒(MEV)為研究對象，針對我國動物疫苗產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)薄弱環(huán)節(jié)，結(jié)合重大動物疫病及人畜共患病防疫的迫切需求，將離心技術(shù)、超濾濃縮分離技術(shù)和分子篩技術(shù)有機地結(jié)合在一起，建立了病毒抗原規(guī)?；瘽饪s純化工藝和適合規(guī)?；乖瓭饪s純化的生產(chǎn)線，最終為研制安全高效的疫苗產(chǎn)品打下良好基礎(chǔ)。本發(fā)明很好地解決了疫苗生產(chǎn)過程中的共性關(guān)鍵技術(shù)和生產(chǎn)工藝技術(shù)的難點問題，突破了影響動物疫苗生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)的瓶頸，建立了疫苗工業(yè)化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)及相關(guān)技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化平臺。本發(fā)明將帶動動物疫苗產(chǎn)業(yè)技術(shù)進步和產(chǎn)品更新?lián)Q代，提高動物疫苗生產(chǎn)技術(shù)水平和產(chǎn)品質(zhì)量，提升我國動物疫苗的核心競爭力，切實提高動物福利，并最終為人類的健康提供保障。


圖I為病毒濃縮液進行分子篩層析的圖譜。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。MOI (感染復(fù)數(shù))病毒的pfu與細胞數(shù)量的比值。水貂腸炎病毒(MEV)MEVB毒株公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；參考文獻聞喜軍，柴秀麗，吳威等.水貂腸炎細小病毒滅活疫苗抗體消長規(guī)律的研究.經(jīng)濟動物學(xué)報.2007，11(4) :199-201.。F81細胞(貓腎細胞)公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；參考文獻水貂病毒性腸炎診斷方法研究進展。王建科，程世鵬，聞喜軍。特產(chǎn)研究。2009(1) :63-65。水貂購自大連名威貂業(yè)有限公司。實施例I、制備水貂腸炎病毒MEVB毒株的病毒濃縮液I、將水貂腸炎病毒MEVB毒株接種F81細胞(Μ0Ι = O. I)，37°C培養(yǎng)96h。2、將步驟I得到的培養(yǎng)液(初始病毒液)4°C、IOOOOg離心18min，收集上清液。3、將50體積份步驟2得到的上清液用截留分子量為30kD的超濾膜包濃縮至I體積份，得到病毒濃縮液。4、將步驟4得到的病毒濃縮液進行分子篩層析。層析柱型號為IndexColumn 100/950 ;填充介質(zhì)為Sepharose 4 Fast Flow。每次上樣量為8%柱體積；洗脫液為PBS緩沖液(O. 04mol/L, ρΗ7· 6)。洗脫液流速為200ml/min。
用紫外分光光度計在280nm波長下監(jiān)測，層析圖譜見圖I。收集第一個洗脫峰(保留時間為30_42min)對應(yīng)的過柱后溶液，即為純化后的病毒液。實施例2、純化效果驗證一、HA 效價采用血凝法測定實施例I制備的初始病毒液(或?qū)嵤├齀制備的純化后的病毒液)中的MEV效價,血球凝集試驗(HA)步驟如下I、在96孔微量反應(yīng)板(共12列)上進行，從左至右每孔加50 μ L生理鹽水。2、第I列每孔加50 μ L待測病毒液,混合均勻后，吸50 μ L至第2列孔,依次倍比稀釋至第11列孔，吸棄50 μ L03、第I至12列孔每孔加入O. 5%豬紅細胞懸液50 μ L，于微量振蕩器上振蕩混勻，4°C作用30min，待對照孔(第12列)紅細胞全部沉淀即可進行結(jié)果觀察。4、結(jié)果判定如紅細胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100%凝集(++++)，不凝集者(-)即紅細胞沉于孔底呈點狀。以100%凝集的病毒最大稀釋度為病毒濃縮液中MEV的HA效價(又稱HA滴度)，初始病毒液的效價為I : 128，純化后的病毒液的效價為I 1024。二、雜蛋白去除率實施例I的步驟2中，得到了 500ml初始病毒液(總蛋白含量為31. 69mg/ml)，步驟4中得到了 1120ml純化后的病毒液(總蛋白含量為O. 35mg/ml)，雜蛋白去除率為97. 52%。步驟一和步驟二的結(jié)果表明，將初始病毒液依次進行離心、濃縮和分子篩層析后，雜蛋白去除率可達97. 52%，HA滴度顯著提高。因此本方法可用于病毒抗原的規(guī)?；兓?。
權(quán)利要求
1.一種動物病毒的純化方法，是將動物病毒液依次進行離心、超濾和分子篩層析，得到純化的病毒液。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟 (1)將動物病毒液離心收集上清液； (2)將步驟(I)得到的上清液進行超濾濃縮，得到病毒濃縮液； (3)將步驟(2)得到的病毒濃縮液進行分子篩層析，得到純化的病毒液。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述動物病毒液的制備方法如下將動物病毒接種動物細胞并培養(yǎng)，得到病毒液。
4.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述動物病毒為水貂腸炎病毒，具體為MEVB毒株。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述動物病毒為水貂腸炎病毒，具體為MEVB毒株。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述動物細胞為F81細胞，所述接種的劑量為MOI = 0. 05-0. 15，所述培養(yǎng)的條件為37°C、96-120小時。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述接種的劑量為MOI= 0. 1，所述培養(yǎng)的時間為37°C、96小時。
8.如權(quán)利要求I至7中任一所述的方法，其特征在于 所述步驟(I)中，所述離心的條件為4°C、8000-12000g、15-20分鐘； 所述步驟(2)中，所述超濾濃縮的方法為將30-50體積份所述上清液用截留分子量為30kD的超濾膜包濃縮至I體積份； 所述步驟(3)中，所述分子篩層析的參數(shù)如下 層析柱型號為Index Column 100/950 ； 填充介質(zhì)為Sepharose 4 Fast Flow ； 洗脫液為pH7. 4-7. 8,0. 04mol/L的PBS緩沖液； 收集第一個洗脫峰，即為純化的病毒液。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于 所述步驟⑴中，所述離心的條件為4°C、10000g、18分鐘； 所述步驟(2)中，所述超濾的方法為將50體積份所述上清液用截留分子量為30kD的超濾膜包濃縮至I體積份； 所述步驟(3)中，所述洗脫液為pH7. 6,0. 04mol/L的PBS緩沖液。
10.權(quán)利要求I至9中任一所述方法制備得到的純化的病毒液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動物病毒的純化工藝。本發(fā)明提供了一種動物病毒的純化方法，是將動物病毒液依次進行離心、超濾和分子篩層析，得到純化的病毒液。本發(fā)明針對我國動物疫苗產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)薄弱環(huán)節(jié)，結(jié)合重大動物疫病及人畜共患病防疫的迫切需求，將離心技術(shù)、超濾濃縮分離技術(shù)和分子篩技術(shù)有機地結(jié)合在一起，建立了病毒抗原規(guī)?；瘽饪s純化工藝和適合規(guī)?；乖瓭饪s純化的生產(chǎn)線，最終研制出了安全高效的疫苗產(chǎn)品。本發(fā)明將帶動動物疫苗產(chǎn)業(yè)技術(shù)進步和產(chǎn)品更新?lián)Q代，提高動物疫苗生產(chǎn)技術(shù)水平和產(chǎn)品質(zhì)量，提升我國動物疫苗的核心競爭力，切實提高動物福利，并最終為人類的健康提供保障。
文檔編號C12R1/93GK102628032SQ20121009069
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者劉維全, 王吉貴 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)