專利名稱：一種檢測甲型副傷寒沙門菌的rt-lamp試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體的說涉及一種檢測甲型副傷寒沙門菌的逆轉錄-環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP)試劑盒。
背景技術：
甲型副傷寒沙門菌(S. Paratyphi A)是引起甲型副傷寒的病原菌，甲型副傷寒與傷寒在臨床癥狀上非常相似，難以區(qū)分，均以急起高熱為主要癥狀，是一種急性全身系統(tǒng)性傳染病。該病傳染性強，病程長，可反復發(fā)作，患者需住院隔離治療，是我國《傳染病防治法》中規(guī)定報告的乙類傳染病之一，也是全球特別是發(fā)展中國家共同面臨的公共衛(wèi)生問題。目前，甲型副傷寒沙門菌的傳統(tǒng)檢測方法為血分離培養(yǎng)及血清學診斷。血分離培 養(yǎng)需時較長，約3-5天，且檢出率易受病程，采血量及患者是否服用抗生素等因素的影響，難以達到快速的要求；血清學診斷存在特異性、準確性差的問題，臨床上，單憑癥狀難以區(qū)分傷寒和副傷寒。因此有必要開發(fā)靈敏的早期檢測方法。目前，隨著抗生素的廣泛應用和病原體本身耐藥、變異等諸多因素的影響，近年甲型副傷寒的復發(fā)率增高，臨床表現很不典型，給早期臨床診斷和治療帶來很大的困難。隨著分子生物學的發(fā)展，目前已有多種PCR方法用于甲型副傷寒沙門菌的檢測，雖在靈敏度方面有所改進，但由于需要精密儀器的配套使用，同樣也無法滿足基層和現場檢測的需求。環(huán)介導等溫核酸擴增技術(loop-mediatedisotherm amplification,LAMP)是由Notomi于2000年開發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和兩對特殊的引物,特異地識別祀序列上的6個獨立區(qū)域,在等溫條件下(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。近年來，國外已將該技術廣泛應用于病原體檢測。Hong TC等人(2004)根據LAMP的原理設計了實時定量RT-LAMP方法，以快速檢測SARS-CoV，結果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(2007)建立了快速診斷H5N1禽流感病毒的RT-LAMP檢測體系。LAMP還可以檢測細菌、真菌等病原微生物，其靈敏度和特異性都有很好的體驗。但目前尚未見該方法在甲型副傷寒沙門菌檢測中的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供用于檢測甲型副傷寒沙門菌(S. Paratyphi A)的特異性RT-LAMP引物組。本發(fā)明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、操作簡單的LAMP檢測試劑盒。為實現上述目的，通過對分離到的48株甲型副傷寒沙門菌hsdM基因和NCBI已報道的hsdM基因序列比對，通過BLAST軟件進行序列同源性分析，找到特異性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 7所示。此外，本領域技術人員應當理解，該序列的特異性片段也可以作為檢測甲型副傷寒沙門菌的靶序列。進一步，本發(fā)明還提供用于特異性擴增上述靶序列的引物組合。本發(fā)明提供用于檢測甲型副傷寒沙門菌的特異性RT-LAMP引物組合，包括以下6條引物F3 :5’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’ ；
B3 :5， -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3，；FIP :5’ -CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’ ；RIP :5’ -A ACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3，；LF :5，-TGAGGTTGGATTCCAT-3，LB :5，-ATTGAGTGGGTTAACAAA-3’本發(fā)明提供了上述引物組在制備甲型副傷寒沙門菌的檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。本發(fā)明提供了一種含有上述6條引物的檢測試劑。本發(fā)明提供了一種含有上述6條引物的甲型副傷寒沙門菌的RT-LAMP檢測試劑盒。本發(fā)明的試劑盒還包含RT-LAMP反應液，與RT-LAMP弓丨物共同構成LAMP檢測體系；25 ii L RT-LAMP檢測體系的具體配置為10 y M的F3、B3各0. 25 y L ; 10 y M的FIP、BIP各 L ;10iiM 的 LF、LB 各 I ii L ;2X 反應混合 buffer 12. L，其含 40mM Tris-HCl, pH
8.8,20mM KCl, 16mM MgS04，20mM(NH4)2S04，0. 2% Tween20，I. 6M甜菜堿和 2. 8mM dNTPs, I u I的Bst DNA聚合酶和AMV逆轉錄酶混合物，5uL的模板RNA。所述試劑盒的檢測反應條件為65°C恒溫lh，然后終止反應。本發(fā)明還提供了一種檢測甲型副傷寒沙門菌(S. Paratyphi A)的方法，用上述6條引物進行RT-LAMP反應，將比濁度> 0. I的擴增結果判定為RT-LAMP反應陽性其中，RT-LAMP反應條件為65°C恒溫Ih。結果判定方法為對于比濁度彡0. I的擴增結果判定為RT-LAMP反應陽性。本發(fā)明的甲型副傷寒沙門菌的RT-LAMP檢測試劑盒利用35個血清型的純培養(yǎng)甲型副傷寒和非傷寒沙門菌菌株、常見非沙門致腹瀉病原菌以及發(fā)熱為主要癥狀常見病原菌RNA評價該方法的特異性及敏感性，同時對甲型副傷寒沙門菌全血模擬標本及糞便模擬標本進行檢測下限確定。結果顯示，利用該方法檢測48株甲型副傷寒沙門菌均陽性，其余34種非傷寒沙門菌血清型、致腹瀉的其他5種腸道致病菌以及發(fā)熱為主要癥狀的8種常見非沙門菌均擴增陰性，說明該方法的特異性良好，達100%。在對純菌總RNA檢測中，RT-LAMP的最低檢測限為50pg/反應，約為19000個拷貝/反應。在以全血模擬樣品提取核酸為模板的檢測中，最低檢測限達80cfu/mL。對糞便模擬標本的檢測中，對增菌前樣品即原始樣品檢測下限為500cfu/g ;增菌后樣品檢測下限為0. 8cfu/g，說明本發(fā)明的檢測試劑盒具有很高的靈敏度。本發(fā)明RT-LAMP檢測試劑盒檢測甲型副傷寒沙門菌整個試驗只需要Ih左右即可，相對于常規(guī)PCR反應要4 5h才能完成檢測，大大縮短了檢測時間；在特異性和重復性檢驗中，該方法有很高的可靠性，并且操作簡單。 利用發(fā)明的甲型副傷寒沙門菌RT-LAMP快速檢測試劑盒對甲型副傷寒沙門菌進行了檢測，檢測陽性率達到100%，在設計引物時候特別選取了甲型副傷寒沙門菌hsdM基因的保守區(qū)，所以該試劑盒可快速、靈敏地檢測出甲型副傷寒沙門菌，其操作簡單，反應結果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及臨床標本的檢測，易于大范圍推廣應用。


圖I為不同引物濃度下RT-LAMP擴增曲線圖；其中a F3和B3各5pmol, FIP和BIP 各 40pmol ；b F3 和 B3 各 5pmol，FIP 和 BIP 各 20pmol ；c F3 和 B3 各 IOpmol，FIP 和 BIP各 40pmol ；d F3 和 B3 各 10pmol，FIP 和 BIP 各 20pmol ；e :F3 和 B3 各 5pmol，FIP 和 BIP 各IOpmol ；NC :陰性對照。圖2為RT-LAMP檢測純菌RNA擴增曲線圖；模板濃度分別為a 5000pg/反應；b 500pg/反應；c 50pg/反應；d 5pg/反應；e :0. 5pg反應；NC :陰性對照。圖3為RT_LAMP檢測模擬血標本擴增曲線圖；模板濃度分別為a I. 6X 104cfu/ml ；b I. 6 X 103cfu/ml ；c I. 6 X 102cfu/ml ；d 8 X IO1CfuZml ；e 4 X IO1CfuZml ；f 2 X IO1CfuAil ；NC :陰性對照。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明所用的菌種沙門菌屬菌株、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌均為本實驗室保存，其中甲型副傷寒沙門菌48株，傷寒沙門菌、乙型和丙型副傷寒沙門菌以及其他31種非傷寒沙門菌血清型共57株(表I)，所有血清型均使用丹麥SSI (Statens SerumInstitut)沙門菌抗血清(購自北京蘭伯瑞生物技術有限公司)進行血清型鑒定。另外，其他腸道常見病原菌及引起發(fā)熱并可在血液標本中分離到的肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、嗜肺軍團菌、腦膜炎奈瑟菌、立克次體、布魯氏菌等菌株作為檢測甲型副傷寒沙門菌的特異性及敏感性評價對比菌株，來自中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所。實施例I引物的設計I、特異性DNA序列查找從GenBank檢索獲得多株甲型副傷寒沙門菌基因組序列，通過BLAST軟件進行序列同源性分析找到hsdM因的特異性的保守靶序列進行RT-LAMP引物設計，該特異性保守靶序列如SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列。2、引物的設計
針對靶序列設計六條引物，包括兩條內引物(FIP和BIP)和兩條外引物(F3和B3)和兩條環(huán)引物(LF和LB)，其核苷酸序列如下
F3 :5’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’ ；B3 :5， -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3，；FIP :5’ -CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’ ；BIP :5，-AACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3，；LF :5，-TGAGGTTGGATTCCAT-3，LB :5，-ATTGAGTGGGTTAACAAA-3’實施例2甲型副傷寒沙門菌RT-LAMP檢測方法的建立I、血模擬標本的制備及RNA提取取新鮮培養(yǎng)4-6小時細菌(最終菌落計數為8. OX 108cfu/ml)，10倍梯度系列稀釋為IO6 IO1CfuAil,取各稀釋度菌液3. 3毫升分別與同體積新鮮人抗凝血混勻，室溫放置30分鐘后，作為全血模擬標本。利用QIAamp UCP PurePathogen Blood fieldtestKit(QIAGEN公司)對上述模擬標本進行甲型副傷寒沙門菌RNA的提取，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。同時以不加菌的血液作為陰性對照平行進行RNA提取。最終提取的RNA溶解到50 ill不含RNase的無菌純水中，取其中5 作模板，進行RT-LAMP。同時，取系列稀釋菌液進行菌落計數，測定模擬標本中準確細菌含量。2、糞便模擬標本制備及RNA提取2. I取新鮮培養(yǎng)4-6小時細菌(最終菌落計數為8. OX 108cfu/ml)，梯度系列稀釋為IO4 10^5,1,0. 5,0. 25,0. 125cfu/ml。然后取以上菌液各500ul與3g健康人糞便混勻。2. 2 取 2. I 項中的混合樣品 0. 2g，加入 200ul TE(10mmol/LTris-HCl (pH 8.0)，lmmol/L EDTA’pH 8. 0)，蝸旋震蕩，IOOOrpm離心I分鐘,去掉沉淀,上清8000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用Iml TE重懸，震蕩，8000rpm 5分鐘，棄上清，保留沉淀，用IOOuITE懸菌，水煮10分鐘，8000rpm 5分鐘，保留上清，去沉淀。此上清為增菌前樣品粗提核酸。2. 3在2. I項中的樣品中各加入SC增菌液(亞硒酸鹽增菌液)5ml，混勻，37°C培養(yǎng)過夜。第2天取增菌后樣品1ml，如步驟2. 2中，制備增菌后樣品核酸粗提品。3、純培養(yǎng)細菌RNA提取純菌RNA提取使用RNeasy Minikit (QIAGEN公司)，操作步驟均嚴格按照說明書進行。4、RT-LAMP 反應分別在不同的溫度(61°C至65°C)反應lh，終止反應，最終通過擴增陽性結果出現的時間，獲得最佳反應參數。由于在65°C反應Ih的條件下擴增最快，優(yōu)選在此條件下進行反應。在65°C反應Ih對不同濃度的內外引物的反應體系進行優(yōu)化反應，通過擴增陽性結果出現的時間作為反應的最終濃度，結果兩條外引物F3、B3濃度各為5pmoI，兩條內引物FIP、BIP濃度各為40pmol的條件下，擴增最快。可參見圖I。因此，得到優(yōu)化的檢測體系(25 U L)如下 IOuM 的 F3、B3 各 0. 25 y L ; 10 y M 的 FIP、BIP 各 L ;10iiM 的 LF、LB 各I U L ；2X 反應混合 buffer 12. 5 y L，其含 40mM Tris-HCl, pH8. 8,20mM KCl, 16mM MgSO4,20mM(NH4)2SO4jO. 2% Tween20,1. 6M 甜菜堿和 2. 8mM dNTPs, I ii I 的 Bst DNA 聚合酶和 AMV逆轉錄酶混合物，5 u L的模板RNA I ii L酶，5 ii L模板檢測反應條件65°C恒溫Ih,終止反應。使用Loopamp RNA Amplification Kit (日本榮研公司)試劑進行 RT-LAMP反應體系的設立，總反應體系為25 u I,其中2Xreaction mix buffer 12. 5 u I (含40mMTris-HCl [pH 8. 8], 20mM KCl, 16mMMgS04, 20mM (NH4) 2S04,0.2% Tween20，I. 6M 甜菜堿和
2.8mMdNTPs)，兩條外引物F3、B3各5pmol，兩條內引物FIP、BIP各40pmol，兩條環(huán)引物各20pmol, I Ul的Bst DNA聚合酶和AMV逆轉錄酶混合物，5 U I的模板RNA。在日本榮研公司的Realtime Turbidimeter LA-320C儀器上進行等溫擴增反應并記錄結果，本研究甲型副傷寒沙門菌RT-LAMP反應條件為65°C，60分鐘，對于比濁度彡0. I的擴增結果判定為RT-LAMP反應陽性。實施例3 RT-LAMP檢測試劑盒特性評價I、RT-LAMP擴增特異性和敏感性利用本發(fā)明的試劑盒共進行了 48種136株細菌的RT-LAMP檢測(見表I)，其中48株甲型副傷寒沙門菌均陽性。沙門菌屬其他34種血清型均擴增陰性。對其他常見腹瀉病原(霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀菌、致瀉性大腸埃希菌)亦擴增陰性。而且，臨床其他常見發(fā)熱病原菌包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、嗜肺軍團菌、腦膜炎奈瑟氏菌、立克次體、布魯氏菌均擴增陰性，說明本研究篩選到的RT-LAMP引物以及由這些引物組裝的檢測試劑盒具有較高的菌種和血清型特異性及敏感性，均達100%。表I甲型副傷寒沙門菌RT-LAMP特異性及敏感性檢
權利要求
1.一種用于檢測甲型副傷寒沙門菌(s. Paratyphi A)的靶序列，其具有SEQ ID NO. 7所示的序列或其特異性片段。
2.用于擴增權利要求2所述靶序列的特異性引物組合。
3.如權利要求2所述的引物組合，其為特異性RT-LAMP引物組，包括以下6條引物 F3 :5’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’ ；B3 :5’ -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’ ；FIP :5， -CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’ ；BIP :5’ -AACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3’ ；LF :5’ -TGAGGTTGGATTCCAT-3’ ；LB :5， -ATTGAGTGGGTTAACAAA-3，。
4.權利要求3所述的引物組合在制備甲型副傷寒沙門菌的檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。
5.一種含有權利要求3所述引物組合的檢測試劑。
6.一種含有權利要求3所述引物組合的甲型副傷寒沙門菌的RT-LAMP檢測試劑盒。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包含RT-LAMP反應液，與RT-LAMP引物共同構成LAMP檢測體系；25iiL RT-LAMP檢測體系的具體配置為10 y M的F3、B3各0. 25u L ;10iiM 的 FIP、BIP 各 L ; 10 y M 的 LF、LB 各 I y L ；2X 反應混合 bufferl2. 5 y L，其含 40mM Tris-HCl，pH 8. 8,20mM KCl, 16mM MgSO4, 20mM(NH4) 2S04,0. 2% Tween20,1. 6M 菜堿和2. 8mM dNTPs, I yl的BstDNA聚合酶和AMV逆轉錄酶混合物，5u L的模板RNA。
8.—種檢測甲型副傷寒沙門菌(S. Paratyphi A)的方法,其特征在于,用權利要求3所述的引物組進行RT-LAMP反應，將比濁度彡0. I的擴增結果判定為RT-LAMP反應陽性。
9.如權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，RT-LAMP反應條件為65°C恒溫lh。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是涉及一種檢測甲型副傷寒沙門菌(S.Paratyphi A)的RT-LAMP試劑盒，所述試劑盒包含有六條RT-LAMP引物，與RT-LAMP反應液一起構成檢測體系，本發(fā)明的六條RT-LAMP引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-6所示。本發(fā)明的試劑盒可快速、靈敏地檢測目前流行的甲型副傷寒沙門菌，在對純菌總RNA檢測中，本發(fā)明試劑盒的最低檢測限為50pg/反應。其操作簡單，反應結果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及臨床標本的檢測，易于大范圍推廣應用。
文檔編號C12N15/11GK102643901SQ20121009334
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權日2012年3月31日
發(fā)明者樊粉霞, 閆梅英, 闞飆 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所