專利名稱：辣椒疫霉的pcr檢測引物、含有該引物的試劑盒及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及辣椒疫霉的檢測，具體地說，涉及辣椒疫霉的PCR檢測引物、含有該引物的試劑盒及應用。
背景技術(shù)：
植物病原卵菌是一類重要的植物病原菌，可侵染危害多種植物，導致多種植物的毀滅性病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici)、大豆疫霉 (P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分別引起馬鈴薯、辣椒、大豆、煙草、樟樹及柑橘的重要疫病，嚴重年份乃至絕產(chǎn)。該類病菌主要以菌絲體或卵孢子在病殘體或土壤中渡過不良環(huán)境而作為初侵染源，在適宜條件下，菌絲體或卵孢子均可萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊-釋放游動孢子，再借助雨水或氣流進行傳播、侵染而導致植物病害。因此，對該類病菌的初侵源或侵染寄主早期進行適時監(jiān)控，利于控制病害的發(fā)生，傳統(tǒng)的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態(tài)調(diào)控等防治措施，這些防控措施主要在病害爆發(fā)乃至產(chǎn)生明顯危害時才實施，忽視了對初侵染源或侵染寄主早期適時采取綜合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最終很難控制病害的發(fā)生與流行。辣椒疫霉(P. capsici)是我國常見辣椒病害種類，多在高溫高濕的環(huán)境下侵染辣椒，如朝天椒(Capsicum annnuum)、小米辣(C. frutescens),造成疫病,而使作物大幅度減產(chǎn)甚至絕收。辣椒疫霉在國內(nèi)也有侵染香蕉樹(Hevea brasiliensis)、木瓜(Chaenomelessinensis)、胡椒(Piper nigrum)、扁葉香果蘭(Vanilla planifolia)等作物的報道，因此開發(fā)辣椒疫霉的早期快速檢測技術(shù)，對相關(guān)作物生產(chǎn)中的病害防控和無公害化具有重要的意義。近年來，PCR技術(shù)及其相關(guān)分子檢測技術(shù)已廣泛用于植物病原菌消長動態(tài)的分子檢測與預警，主要利用核糖體rDNA/ITS序列設(shè)計特異性引物來對植物致病菌進行快速檢測。然而針對大豆疫霉、致病疫霉、辣椒疫霉、寄生疫霉、冬生疫霉的分子檢測技術(shù)研究結(jié)果表明，部分疫霉種間ITS序列差異很小，分辨度不高。Enl基因是烯醇化酶(enolase)編碼基因，它廣泛存在于真核生物中，目前尚無針對該靶基因設(shè)計的特異性辣椒疫霉檢測引物的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可快速、準確地檢測辣椒疫霉的特異性引物及含有該引物的試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供上述引物及試劑盒在檢測辣椒疫霉中的應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的PCR檢測引物，其包括正向引物Enl4s :5’ -TGAAGTTCACGGCCAAGGTG-3’ 和反向引物Enlla :5’ -TGAACGTGTCCTCCGTCTCA-3’。
本發(fā)明還提供含有上述PCR引物的用于檢測辣椒疫霉的試劑盒，其中所述試劑盒包括引物ENL4s和ENLlS。前述試劑盒中還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。更優(yōu)選地，前述試劑盒還包括標準陽性模板。本發(fā)明進一步提供上述PCR引物或試劑盒在檢測辣椒疫霉中的應用，包括步驟I)提取樣品中的DNA ；2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行PCR擴增反應；3)分析PCR產(chǎn)物，即對上述擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳檢測結(jié)果判定樣品中是否含有辣椒疫霉。其中，PCR反應體系以50 ill計為
模板 DNA2^ilIOmMdNTPs4^il10|iiM 引物 ENL4s1.5^il
10|iiM$*ENLla1.5^il
5U/|iil Taq DNA聚合酶0.5pl 10 x PCR反應緩沖液50
0. IM Mg2+I^il
ddH20補足至500。PCR反應條件為95°C 3分鐘；94°C 40秒，54°C 50秒，72°C I分鐘，共35個循環(huán)；72 0C 10 分鐘。擴增反應結(jié)束后，若電泳檢測結(jié)果出現(xiàn)約200bp的DNA條帶，則該樣品含有辣椒疫
霉病菌。本發(fā)明分析了辣椒疫霉和其他疫霉菌在Enl和Ypt基因序列上的差異，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個高度特異且只存在于辣椒疫霉中的位點，共設(shè)計出四對辣椒疫霉特異性引物Enl2s/Enl3a、Enl4s/Enlla、Ypt2s/Ypt3a和 Ypt2s/Ypt5a,從中選定靈敏性最強的 Enl4s/Enlla 引物對，并在此基礎(chǔ)上建立了檢測辣椒疫霉的PCR體系。四對辣椒疫霉特異性引物的堿基序列如表I所示表I本發(fā)明涉及的辣椒疫霉特異性引物序列
權(quán)利要求
1.辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)的PCR檢測引物,其特征在于,其包括 正向引物 Enl4s :5’ -TGAAGTTCACGGCCAAGGTG-3’ 和反向引物 En I I a : 5 ’ -TGAACGTGTCCTCCGTCTCA-3，。
2.含有權(quán)利要求I所述引物的用于檢測辣椒疫霉的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括引物ENL4s和ENLlS。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
5.權(quán)利要求I所述引物或權(quán)利要求2-4任一項所述試劑盒在檢測辣椒疫霉中的應用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，包括以下步驟 1)提取樣品中的DNA； 2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行PCR擴增反應； 3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應用，其特征在于，PCR反應體系以50計為模板 DNA2^il IOmMdNTPs4^il10|iiM 引物 ENL4s1.5^il 10|iiM$*ENLla1.5^il 5U/|iil Taq DNA聚合酶0.5pl 10 x PCR反應緩沖液50 0. IM Mg2+I^ilddH20補足至500。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應用，其特征在于，PCR反應條件為95°C3分鐘；94°C40秒，54°C 50秒，72°C I分鐘，共35個循環(huán)；72°C 10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供辣椒疫霉的PCR檢測引物，所述引物包括ENL4s和ENL1a(如Seq ID No.1和2所示)。本發(fā)明基于辣椒疫霉和其他疫霉菌的Enl和Ypt基因的序列差異，共獲得四對可快速檢測辣椒疫霉病菌的特異性引物Enl2s/Enl3a、Enl4s/Enl1a、Ypt2s/Ypt3a和Ypt2s/Ypt5a，其中Enl4s/Enl1a靈敏度最高。在此基礎(chǔ)上建立PCR檢測體系，可從發(fā)病植物組織及土壤中復雜的病原菌環(huán)境快速、準確地檢測出辣椒疫霉。根據(jù)該方法構(gòu)建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，可對辣椒疫霉的各種形態(tài)的繁殖體如菌絲、卵孢子和游動孢子等進行檢測，對辣椒疫霉疫情的早期預警、疫區(qū)的病原監(jiān)測等方面具有重要意義。
文檔編號C12Q1/04GK102643903SQ20121009349
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者孫翔, 郭良棟 申請人:中國科學院微生物研究所