專利名稱：消除克雷伯氏肺炎桿菌合成2,3-丁二醇和乙偶姻能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種克雷伯氏肺炎桿菌的消除代謝副產(chǎn)物的方法，特別是涉及一種消除克雷伯氏肺炎桿菌合成2，3-丁二醇和乙偶姻能力的方法。
背景技術(shù)：
克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)是一種革蘭氏陰性細菌,在分類學上與大腸桿菌屬于同一個屬。克雷伯氏肺炎桿菌代謝甘油可以生成1，3_丙二醇，并具有較高的生產(chǎn)強度和轉(zhuǎn)化率，相關(guān)研究受到很大的關(guān)注。克雷伯氏肺炎桿菌在利用甘油合成1，3-丙二醇的同時還合成2，3- 丁二醇、乙偶姻(3-羥基-2- 丁酮)、乙醇、琥珀酸、乙酸和乳酸等副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物的合成消耗大量的底物，同時給 1，3_丙二醇的分離提取帶來沉重的負擔[Xiu, Z. L. and A. P. Zeng, Present state and perspective of downstreamprocessing of biologically produced I，3-propanediol and 2,3-butanediol. Appliedmicrobiology and biotechnology,2008. 78(6) :p.917-926]。目前，已經(jīng)有一些工作通過敲除副產(chǎn)物的合成途徑來消除或降低這些副產(chǎn)物的產(chǎn)生。Xu等在克雷伯氏肺炎桿菌HR526中敲除了乳酸脫氫酶基因，從而降低了菌株合成乳酸的能力，同時該菌株利用甘油生產(chǎn)1，3_丙二醇的底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物終濃度都得到了提高[Xu, Y. Z. , et al. , Metabolism in I, 3-propanediol fed-batch fermentationby a D-Iactate deficient mutant of Klebsiella pneumoniae. Biotechnology andbioengineering, 2009. 104(5) :p. 965-972]。Zhang 等在克雷伯氏肺炎桿菌 YMU2 中敲除了乙醛脫氫酶，阻斷了乙醇的合成途徑，從而降低了菌株合成乙醇的能力，同樣利用該菌株轉(zhuǎn)化甘油生成 I，3_ 丙二醇的能力提高[Zhang, Y.，et al.，Inactivation of aldehydedehydrogenase a key factor for engineering 1,3-propanediol production byKlebsiella pneumoniae. Metabolic engineering,2006. 8 (6) :p.578-586]。在所有這些副產(chǎn)物中，2，3-丁二醇的合成量較大，并且化學性質(zhì)與I，3-丙二醇接近，與1，3_丙二醇的分離成本較高。在克雷伯氏肺炎桿菌中2，3_ 丁二醇由中心代謝產(chǎn)物丙酮酸開始，兩分子丙酮酸經(jīng)過乙酰乳酸合成酶催化合成乙酰乳酸，乙酰乳酸脫羧酶催化乙酰乳酸脫羧形成乙偶姻，乙偶姻在乙偶姻氧化還原酶的催化下還原形成2，3-丁二醇。菌株在合成2，3_ 丁二醇的同時其前體物質(zhì)乙偶姻也有一定的積累。但是目前并未見消除雷伯氏肺炎桿菌這兩種物質(zhì)合成能力的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種消除克雷伯氏肺炎桿菌合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法。通過本發(fā)明的方法，在克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油合成1，3_丙二醇過程中，可以消除2，3_ 丁二醇和乙偶姻這些副產(chǎn)物，減少1，3-丙二醇分離提取步驟，同時提高底物轉(zhuǎn)化率。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的消除克雷伯氏肺炎桿菌合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法，是通過對克雷伯氏肺炎桿菌2，3- 丁二醇合成途徑中乙酰乳酸脫羧酶基因進行失活，從而阻斷乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻的催化反應(yīng)，實現(xiàn)克雷伯氏肺炎桿菌合成2，3- 丁二醇和乙偶姻能力的消除。上述方法的具體步驟，包括I)利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌乙酰乳酸脫羧酶基因，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行序列測定；2)利用步驟I)克隆到的基因序列，制備兩側(cè)連有乙酰乳酸脫羧酶基因的同源臂、中間連接抗性核的DNA片段；3)利用轉(zhuǎn)化或接合方法，將步驟2)制備的DNA片段轉(zhuǎn) 入到克雷伯氏肺炎桿菌中，利用同源重組與克雷伯氏肺炎桿菌染色體上的乙酰乳酸脫羧酶基因進行重組，篩選獲得乙酰乳酸脫羧酶基因失活的菌株。所述步驟I)中，PCR擴增中的上游引物為SEQ ID NO. I所示，下游引物為SEQ IDNO. 2所示；克隆載體,包括質(zhì)粒。所述步驟2)中，乙酰乳酸脫羧酶基因的同源臂制備中的同源序列PCR擴增上游引物為SEQ ID NO. 6所示，下游引物為SEQ ID NO. 7所示；抗性核包括鏈霉素、安譜霉素、氯霉素、壯觀霉素和四環(huán)素等抗性基因。所述步驟1)-3)中，乙酰乳酸脫羧酶是菌體中催化乙酰乳酸脫羧形成乙偶姻的酶，酶國際系統(tǒng)分類編號EC 4. I. I. 5,在克雷伯氏肺炎桿菌中一般由259個氨基酸殘基構(gòu)成。篩選獲得乙酰乳酸脫羧酶基因失活的菌株中，先篩選得到具有抗性核的菌株，并以SEQ IDN0. I和SEQ ID NO. 8所示的引物進行PCR擴增驗證。本發(fā)明通過對乙酰乳酸脫羧酶基因進行失活，在克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油合成1，3_丙二醇時，能消除2，3_丁二醇和乙偶姻這些副產(chǎn)物的產(chǎn)生，減少了 1，3_丙二醇分離提取步驟，同時，提高甘油(底物)向I，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率。
具體實施例方式以下實施例中使用的質(zhì)粒、PCR試劑等采用商業(yè)產(chǎn)品，具體操作按照說明書進行。其他未注明的實驗操作按照常規(guī)分子操作方法進行。實施例I消除克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法本實施例中的CGMCC1. 6366菌株為中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，具有
氨芐青霉素抗性。本實施例的消除克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法，其具體步驟如下I、利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌乙酰乳酸脫羧酶基因(budA)，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行DNA序列測定。根據(jù)克雷伯氏肺炎桿菌MGH78578 (Genbank CP000647)基因組信息，設(shè)計乙酰乳酸脫羧酶 PCR 引物，上游引物 budA-s GAAGATCAGAACATCGCCAGA (SEQ ID NO. I 所示)，下游引物 budA-a CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT (SEQ I D NO. 2 所示)。通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1. 6366基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，獲得乙酰乳酸脫羧酶基因片段，通過TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)連接到pMD-18T simple質(zhì)粒上,命名為pMD18T-budA質(zhì)粒,序列測定結(jié)果如下
budA基因相鄰上游部分序列為GAAGATCAGAACATCGCCAGAAAGCGTTTCACCGTGCGCGAGCGCTCGAAGCGCCGCCAGGCGATGGCGATATCGGTCTTCAGCGGTGCCCCGCTGAGCGGGTGATAGCTGACGTTCGGCTGTTGAATGCAGGTCATCGACTGCGGGACCAGCGCGAAGCCGAACCCGGCATTGACCATGCTCAGCGATGACGAAATCTGCGACGACTGCCAGGCGCGCTCCATATCGATGCCGGCGCGCAGGCAGCTGTTGTACACCAGCTCATACAGCCCCGGGGCCACCTCCCGCGGGA(SEQ IDNO. 3所示)οbudA基因閱讀框為AGAGAGTCTGTGCGAAACCCTGCGGGCGTTTTCCGCGCAGCATCCCGAGAGCGTGCTCTATCAGACATCGCTCATGAGCGCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCGCGGACCTGCTGAAGCACGGCGATTTCGGTCTCGGCACCTTTAATGAGCTGGACGGGGAGCTGATCGCCTTCAGCAGTCAGGTCTATCAGCTGCGGGCCGACGGCAGCGCGCGCAAAGCCCAGCCGGATCAGAAAACGCCGTTCGCGGTGATGACCTGGTTCCAGCCGCAGTACCGGAAAACCTTCGACCATCCGGTGAGCCGCCAGCAGCTGCACGAGGTGATCGACCAGCAAATCCCCTCTGACAACCTGTTCTGCGCCCTGCGCATCGACGGCCATTTCCGCCATGCCCATACCCGCACCGTGCCGCGCCAGACGCCGCCGTACCGGGCGATGACCGACGTCCTCGACGATCAGCCGGTGTTCCGCTTTAACCAGCGCGAAGGGGTGCTGGTCGGCTTCCGTACCCCACAGCATATGCAGGGGATCAACGTCGCCGGGTATCACGAGCACTTTATAACCGATGACCGCAAAGGCGGCGGTCACCTGCTGGATTACCAGCTCGACCACGGGGTATTGACCTTCGGCGAAATTCACAAGCTGATGATCGACCTGCCCGCCGACAGCGCGTTCCTGCAGGCCAATCTGCATCCCGATAATCTCGATGCCGCCATCCGTTCCGTAGAAAGTTAAGGGGGTCACATGGACAAACAGTATCCGGT (SEQ ID NO. 4 所示)。budA基因相鄰下游部分序列為ACGCCAGTGGGCGCACGGCGCCGATCTCGTCGTCAGCCAGCTGGAAGCCCAGGGGGTACGTCAGGTGTTCGGCATCCCTGGCGCCAAAATCGACAAGGTATTCGACTCACTGCTGGATTCCTCCATTCGCATTATTCCGGTACGCCACGAAGCTAACGCCGCCTTTATGGCCGCCGCCGTCGGGCGCATTACCGGTAAAGCGGGCGTGGCGCTGGTCACCTCCGGTCCGGGCTGTTCCAACCTGATCACCGGTATGGCCACCGCCAACAGCGAAGGCGACCCGGTGGTGGCCCTGGGCGGCGCGGTGAAACGCGCCGATAAGGCCAAACAGGTCCACCAGAG (SEQ ID NO. 5 所示)。2、利用步驟I克隆到的基因序列，制備兩側(cè)連有同源臂中間連接抗性核的DNA片段。本步驟中的操作，采用在大腸桿中利用Red重組酶催化，具有同源臂連接抗性核的DNA片段與pMD18T-budA質(zhì)粒進行同源重組，獲得pMD18T_budA質(zhì)粒上失活的budA基因，利用該質(zhì)粒作為模板通過PCR擴增具有長的同源臂的DNA片段，該片段兩側(cè)連有與budA基因上下游序列同源的序列，中間連接抗性核。本步驟操作原理可參見(Weiet. al. Red recombinase assistedgene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal of IndustrialMicrobiology&Biotechnology 2012),具體步驟如下a. pMD18T-budA質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化到含有pIJ790質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a_pIJ790中，命名為 DH5a-pMD18T-budA。
制備DH5a-pMD18_budA感受態(tài)細胞，在菌體培養(yǎng)I個小時后，添加10mmol/L的阿拉伯糖，誘導(dǎo)PIJ790質(zhì)粒中Red重組酶的表達。b.設(shè)計引物budA_s2和budA_a2，序列分別為GCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ IDNO. 6所示)和TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ I DNO. 7所示)。弓丨物budA-s2 的 “GCCCTGCTGAGCGGGGITTACGAAGGCAGCACCACCATC” 序列與 budA 基因序列同源，引物 budA-a2 的“TTGCGGTCATCGGTTATAAAGTGCTCGTGATACCCGGCGA”序列與 budA基因相應(yīng)序列同源。
利用引物budA_s2和budA_a2，以質(zhì)粒pIJ778為模板擴增出長約1491bp的DNA片段A。該片段兩段分別具有與budA序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ778質(zhì)粒的鏈霉素抗性基因aadA。c.利用DNA片段A轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a-pMD18T_budA感受態(tài)細胞。利用電擊轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化電壓為2000V，選擇鏈霉素抗性的菌株，鏈霉素用量為50mg/L。DNA片段A兩側(cè)的同源序列與質(zhì)粒pMD18T-budA上的budA同源部分發(fā)生重組，獲得了 pMD18T-A 質(zhì)粒。d.利用引物 budA-s (SEQ ID NO. I 所示)和 budA-a (SEQ ID NO. 2 所示)，以PMD18T-A質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲得3114bp的DNA片段B。DNA片段B兩端分別具有1131bp和571bp的budA基因和相鄰序列，該序列作為同源臂。DNA片段B中間具有鏈霉素抗性基因aadA，DNA片段B用于進行CGMCC1. 6366染色體上budA基因重組的線性DNA片段。3、利用轉(zhuǎn)化或結(jié)合方法將制備的DNA片段B轉(zhuǎn)入到克雷伯氏肺炎桿菌中，利用同源重組與染色體上的乙酰乳酸脫羧酶基因進行重組，篩選獲得乙酰乳酸脫羧酶基因失活的菌株，具體步驟如下a.將 pDK6-red 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 CGMCC1. 6366 中，獲得 CGMCC1. 6366-pDK6_red 菌株，線性DNA片段B電擊轉(zhuǎn)化CGMCC1. 6366-pDK6-red感受態(tài)細胞。利用鏈霉素篩選抗性菌株。b.重組菌的驗證，設(shè)計驗證引物Yanzheng778z AGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAG (SEQ ID NO. 8所示)，其序列對應(yīng)鏈霉素抗性基因aadA中間的一段序列。利用引物budA-s (SEQ ID NO. I所示)和Yanzheng778z，以長出的菌株總DNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物DNA片段為1889bp，而以出發(fā)菌株CGMCC1. 6366總DNA為模板進行PCR無特異性條帶，表明獲得的重組菌正確，命名為CGMCC1. 6366-budA-。該菌株的乙酰乳酸脫羧酶基因通過同源重組而失活。4、乙酰脫羧酶失活菌株乙偶姻和2，3- 丁二醇合成能力檢驗。配制培養(yǎng)基硫酸銨4g/L ;磷酸氫二鉀O. 69g/L ;磷酸二氫鉀O. 25g/L ;硫酸鎂
O.2g/L ;酵母粉I. 5g/L ;甘油30g/L ;微量元素I. 0ml/L ;鐵溶液I. Oml/L。其中，微量元素為硫酸錳100mg/L ;氯化鋅70mg/L ;鑰酸鈉35mg/L ;硼酸60mg/L ；氯化鈷 200mg/L ;硫酸銅 29. 28mg/L ;氯化鎳 25mg/L ;濃鹽酸(37% )0. 9ml/L。
鐵溶液為每升水中加入硫酸亞鐵5. 0g，37%的濃鹽酸4ml。利用CGMCC1. 6366出發(fā)菌株和乙酰乳酸脫羧酶失活菌株CGMCC1. 6366-budA-在500mL錐形瓶進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為裝液量50ml，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)每分，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液利用氣相色譜和液相色譜對發(fā)酵液各組分進行定量分析，結(jié)果如下CGMCCI. 6366 出發(fā)菌株琥珀酸 O. 46g/L ;乳酸 O. 54g/L ;甘油 O. 00g/L ；乙酸
2.97g/L ; I，3-丙二醇 10. 56g/L ;乙偶姻 O. 05g/L ; 2，3- 丁二醇 3. 06g/L ;其中，甘油向 I，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率為35. 2% ;CGMCCI. 6366-budA-菌株琥珀酸 I. 23g/L ;乳酸 O. 12g/L ;甘油 11. 94g/L ；乙酸
O.87g/L ;1，3-丙二醇 6. 9lg/L ;乙偶姻 O. 00g/L ;2，3_ 丁二醇 O. 00g/L ;其中，甘油向 1 ，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率為38.2%。以上培養(yǎng)結(jié)果表明，乙酰乳酸脫羧酶失活菌株中的2，3_ 丁二醇和乙偶姻合成已經(jīng)消除，在發(fā)酵液中的含量處在檢測限度以下，同時，增加了甘油向1，3_丙二醇的轉(zhuǎn)化率。
權(quán)利要求
1.一種消除克雷伯氏肺炎桿菌合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法，其特征在于通過對克雷伯氏肺炎桿菌2，3- 丁二醇合成途徑中乙酰乳酸脫羧酶基因進行失活，阻斷乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻的催化反應(yīng)，消除克雷伯氏肺炎桿菌合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述方法的步驟，包括 1)利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌乙酰乳酸脫羧酶基因，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行序列測定； 2)利用步驟I)克隆到的基因序列，制備兩側(cè)連有乙酰乳酸脫羧酶基因的同源臂、中間連接抗性核的DNA片段； 3)利用轉(zhuǎn)化或接合方法，將步驟2)制備的DNA片段轉(zhuǎn)入到克雷伯氏肺炎桿菌中，利用同源重組與克雷伯氏肺炎桿菌染色體上的乙酰乳酸脫羧酶基因進行重組，篩選獲得乙酰乳酸脫羧酶基因失活的菌株。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，PCR擴增中的上游引物為SEQ ID NO. I所示，下游引物為SEQ ID NO. 2所示。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，克隆載體，包括質(zhì)粒。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，乙酰乳酸脫羧酶基因的同源臂制備中的同源序列PCR擴增上游引物為SEQ ID NO. 6所示，下游引物為SEQ ID NO. 7所示。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，抗性核包括鏈霉素抗性基因、安譜霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、壯觀霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟I)-3)中，乙酰乳酸脫羧酶是催化乙酰乳酸脫羧形成乙偶姻的酶，酶國際系統(tǒng)分類編號EC 4. I. 1.5。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟3)的篩選獲得乙酰乳酸脫羧酶基因失活的菌株中，先篩選得到具有抗性核的菌株，并以SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 8所示的引物進行PCR擴增驗證。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種消除克雷伯氏肺炎桿菌合成2，3-丁二醇和乙偶姻能力的方法，該方法通過對克雷伯氏肺炎桿菌2，3-丁二醇合成途徑中乙酰乳酸脫羧酶基因進行失活，從而阻斷乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻的催化反應(yīng)。利用本發(fā)明，在克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油合成1，3-丙二醇時，消除了副產(chǎn)物2，3-丁二醇和乙偶姻的合成，提高了甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率。
文檔編號C12R1/22GK102952826SQ20121009399
公開日2013年3月6日 申請日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月1日
發(fā)明者郝健, 魏東, 史吉平, 姜標 申請人:上海中科高等研究院