專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用阿魏菇液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種利用阿魏菇液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
漆酶(benzenediol:oxygen oxidoreductase, EC I. 10. 3.2),是一種含銅的多酌· 氧化酶，廣泛分布于植物、細(xì)菌和真菌中，此外，在一些昆蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)了漆酶的存在。漆酶是單電子氧化還原酶，其催化底物包括酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物以及一些金屬離子等。由于作用底物廣泛，漆酶對(duì)于在食品工業(yè)、制漿造紙、人工合成染料脫色、 新型環(huán)保材料研制等領(lǐng)域具有巨大的價(jià)值。在食品工業(yè)中，漆酶被廣泛應(yīng)用于控制飲料的澄清與色澤。傳統(tǒng)方法是將飲料經(jīng)凝膠、斑脫土和二氧化硅等物質(zhì)進(jìn)行吸附處理，從而增加其穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)方法相比，利用漆酶穩(wěn)定果汁具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如澄清效果穩(wěn)定、不需采用澄清劑或助濾劑、且利于自動(dòng)化處理。有研究結(jié)果表明，利用漆酶處理果汁可以獲得穩(wěn)定和澄清的果汁，且不需要過(guò)多的投資。在造紙技術(shù)中，制漿過(guò)程主要需要木質(zhì)原料中的纖維類(lèi)物質(zhì)，而在木質(zhì)原料中，纖維物質(zhì)與木質(zhì)素緊密膠連在一起，因此需要采用化學(xué)或物理的方法，降解或者去除木質(zhì)素才能達(dá)到分離的目的。漆酶具有良好的降解木質(zhì)素的能力，且無(wú)化學(xué)法和物理法中能耗高、 污染大等缺點(diǎn)，因此在造紙制漿中有廣闊的應(yīng)用前景，而且漆酶優(yōu)良的降解木質(zhì)素的能力， 很好的解決了木質(zhì)素的存在對(duì)紙張的強(qiáng)度和顏色的影響。在紡織工業(yè)中，每年有10% - 20%的染料隨著廢水被排放到環(huán)境中。這些染料大多數(shù)為具有抗光照、抗氧化的難降解芳烴類(lèi)化合物，這類(lèi)物質(zhì)不但對(duì)環(huán)境造成了危害，還由于其自身具有有毒、致癌物質(zhì)，對(duì)人體健康也造成了威脅。由于漆酶對(duì)單酚、鄰苯二酚和對(duì)苯二酚等底物較好的氧化降解作用，使其被廣泛應(yīng)用于染料的脫色降解。漆酶不僅可以應(yīng)用于紡織工業(yè)廢水的處理，還可以直接參與到牛仔布染色的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，具有降低牛仔布的強(qiáng)度損失、減少處理時(shí)間、漆酶可重復(fù)利用、減少耗水量和避免刺激性化學(xué)物質(zhì)漂白等諸多優(yōu)點(diǎn)。阿魏燕(Pleurotus ferulae Lenzi),學(xué)名阿魏側(cè)耳,在我國(guó)是新疆特有的燕類(lèi)， 主要分布于新疆的伊犁、塔城、阿勒泰和木壘等地區(qū)，是寄生在藥用植物“阿魏”腐敗根莖上的一種重要的食藥用真菌。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種具有產(chǎn)漆酶能力的側(cè)耳類(lèi)真菌，如糙皮側(cè)耳(平菇)、刺芹側(cè)耳(杏鮑菇)、環(huán)柄側(cè)耳(鳳尾菇)等，但未曾有關(guān)于阿魏側(cè)耳(阿魏菇)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的相關(guān)研究和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用阿魏菇生產(chǎn)漆酶的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案具體的，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)。(I)斜面培養(yǎng)，把經(jīng)組織分離得到的阿魏菇菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，在25°C條件下培養(yǎng)，至菌絲體長(zhǎng)滿(mǎn)斜面；(2)種子培養(yǎng)，將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中，在25°C，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)7 天；(3)發(fā)酵培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量4% (體積百分比)，在22 -26°C，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)7天。本發(fā)明使用的阿魏菇菌種是通過(guò)采自新疆的野生阿魏菇經(jīng)組織分離得到。組織分離的方法在多種教科書(shū)和論文中均有表述，這里不再詳細(xì)列出(例如上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院編， 《食用菌栽培手冊(cè)》第12 - 13頁(yè)，1981年，食用菌雜志社編輯部出版社)。本發(fā)明所述的斜面培養(yǎng)基為土豆培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，組成(單位克/升)土豆 200，葡萄糖20，瓊脂20，用自來(lái)水配制，pH自然，121。。滅菌20分鐘。本發(fā)明所述的種子培養(yǎng)基組成(單位克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麩皮10， KH2PO4 3，MgSO4 · 7H20 2，用自來(lái)水配制，pH自然，121。。滅菌20分鐘。本發(fā)明所應(yīng)用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(單位克/升)葡萄糖15 - 20，玉米粉10 -20，麩皮 10 - 15，KH2PO4 3，MgS04*7H20 2，用自來(lái)水配制，起始 pH 為 7. O - 9.0，121。。滅菌20分鐘。漆酶酶活力的測(cè)定方法詳見(jiàn)實(shí)施例。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明成功的實(shí)現(xiàn)了利用阿魏菇生產(chǎn)漆酶的工藝，其發(fā)酵水平達(dá)到或超過(guò)其他側(cè)耳類(lèi)真菌的發(fā)酵水平。這為微生物發(fā)酵產(chǎn)漆酶提供了一種新的方法， 同時(shí)也為阿魏菇在發(fā)酵工業(yè)上的應(yīng)用開(kāi)發(fā)出一種新方向。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案所涉及的材料及工藝，給出了以下實(shí)施例。但這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I、阿魏菇菌種的組織分離
取采自新疆阿勒泰地區(qū)的野生阿魏菇新鮮未開(kāi)傘的子實(shí)體，削去菌柄基部和菌柄外表皮，用75%乙醇進(jìn)行子實(shí)體表面消毒后，移入超凈工作臺(tái)紫外燈照射20分鐘。用滅過(guò)菌冷卻后的解剖刀將子實(shí)體一分為二，在菌柄內(nèi)或菌柄中、菌柄與菌蓋交界處、菌蓋和菌褶處切割表皮內(nèi)組織，將組織切成黃豆大小的小塊，切割時(shí)不能切透子實(shí)體表皮組織。用無(wú)菌鑷子接入試管斜面培養(yǎng)基(即PDA培養(yǎng)基)，每個(gè)組織部分各接種10支試管斜面，25°C培養(yǎng)，每天定時(shí)觀測(cè)菌絲生長(zhǎng)污染情況，當(dāng)長(zhǎng)至7天時(shí)，用PDA培養(yǎng)基試管斜面轉(zhuǎn)接。實(shí)施例2、阿魏菇液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶
(1)斜面培養(yǎng)將實(shí)施例I得到的阿魏菇菌種接種到斜面培養(yǎng)基(即PDA培養(yǎng)基)上，在 25°C環(huán)境下培養(yǎng)大約7天時(shí)間，至菌絲體長(zhǎng)滿(mǎn)斜面；
(2)種子培養(yǎng)將斜面菌種接種到裝有60毫升種子培養(yǎng)基的250毫升的三角瓶中，種子培養(yǎng)基組成(單位克/升):葡萄糖20，玉米粉20，麩皮10,KH2PO4 3，MgSO4 ·7Η20 2, pH 自然，121°C滅菌20分鐘；在搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，25°C條件下培養(yǎng)7天；
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)取培養(yǎng)好的種子6暈升接種到裝有150暈升發(fā)酵培養(yǎng)基的500暈升的三角瓶中。發(fā)酵培養(yǎng)基組成(單位克/升)葡萄糖15，玉米粉10，麩皮10，KH2PO4 3， MgSO4 · 7H20 2，起始pH為7. 0，121。。滅菌20分鐘；在搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，22°C條件下培養(yǎng)7天，最終得到含有漆酶的阿魏菇發(fā)酵液，測(cè)得發(fā)酵液中漆酶酶活力7156. 3 U/L。
漆酶酶活的具體測(cè)定按以下方法進(jìn)行
取發(fā)酵液I毫升，在8000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘；取上清液，測(cè)定漆酶酶活。 測(cè)定漆酶酶活力時(shí)以2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為底物， 每分鐘氧化I微摩爾ABTS底物所需要的酶量定義為I個(gè)酶活單位(U)。在I毫升反應(yīng)體系中，底物ABTS終濃度為I毫摩爾/升，其中含有100毫摩爾/升pH值為4. 5的乙酸鈉緩沖液880微升，100微升ABTS和20微升發(fā)酵上清液，整個(gè)反應(yīng)體系在30°C下反應(yīng)5分鐘，在 420 nm下測(cè)定其吸光度的變化。酶活力按以下公式計(jì)算
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)阿魏菇液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于以阿魏菇為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)利用阿魏菇液體發(fā)酵高產(chǎn)漆酶的目的；(1)斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為土豆培養(yǎng)基，即PDA培養(yǎng)基，組成以克/升計(jì)土豆200，葡萄糖20，瓊脂 20，用自來(lái)水配制，pH自然，121°C滅菌20分鐘；把經(jīng)組織分離得到的阿魏菇菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，在25°C條件下培養(yǎng)，至菌絲體長(zhǎng)滿(mǎn)斜面；(2)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成以克/升計(jì)葡萄糖20，玉米粉20，麩皮IO7KH2PO4 3,MgS04*7H20 2， 用自來(lái)水配制，pH值自然，121°C滅菌20分鐘；將斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基中，在25°C，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)7天；(3)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成以克/升計(jì)葡萄糖15 - 20，玉米粉10 - 20，麩皮10 - 15,KH2PO4·3,MgSO4 · 7H20 2，用自來(lái)水配制，起始pH為7. O - 9. 0，121°C滅菌20分鐘;將培養(yǎng)好的種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量4%，在22 - 26°C,搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘的條件下培養(yǎng)7天。
全文摘要
一種通過(guò)阿魏菇液體發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法以阿魏菇為生產(chǎn)菌株，經(jīng)液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶，主要通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)斜面培養(yǎng)，(2)種子培養(yǎng)，(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的種子按4%的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基中組成(單位克/升)葡萄糖15-20，玉米粉10-20，麩皮10-15，KH2PO43，MgSO4·7H2O2，起始pH為7.0-9.0，在搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，22-26℃條件下培養(yǎng)7天。本發(fā)明成功的實(shí)現(xiàn)了利用阿魏菇生產(chǎn)漆酶這一目標(biāo)，其發(fā)酵水平達(dá)到或超過(guò)其他側(cè)耳類(lèi)真菌的發(fā)酵水平。這為微生物發(fā)酵產(chǎn)漆酶提供了一種新的方法，同時(shí)也為阿魏菇在發(fā)酵工業(yè)上的應(yīng)用開(kāi)發(fā)出一種新方向。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102604902SQ20121009474
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者丁重陽(yáng), 張梁, 彭林, 石貴陽(yáng), 章克昌, 陳友枝, 顧正華 申請(qǐng)人:江南大學(xué)