專利名稱：運(yùn)用比較基因組學(xué)快速鑒定百脈根抗白粉病基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是借助于百脈根測序全基因組序列，利用植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信息學(xué)和候選基因策略等方法快速鑒定百脈根白粉病基因，主要涉及到百脈根全基因組序列的下載，候選基因的鑒定，基因的比對，聚類等手段，進(jìn)而鑒定出白粉病基因，屬于植物生物技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
百脈根{Lotus corniculatus)又名五葉草(四葉草)、鳥足豆、牛角花，是多年生豆科百脈根屬草本植物，原產(chǎn)歐亞大陸溫帶地區(qū)，在我國河北、云南、貴州、四川、甘肅等地均有分布，百脈根是一種被廣泛用于果園生草、綠肥、草場改良的牧草植物，也是一種可以 清熱解毒的中藥植物。白粉病是百脈根上常見的病害，在我國百脈根種植區(qū)多有發(fā)生，影響牧草產(chǎn)量和品質(zhì)。引起這類病害的病原菌為豌豆白粉菌(五rpiMe pisi DC.)，異名寥白粉病菌、普生白粉菌苜蓿?；?，屬于子囊菌亞門的一種真菌。除了在百脈根上寄生外，此類病菌還在三葉草屬、草木樨屬、苜蓿屬、扁蓿豆屬和豌豆等豆科植物上寄生。在病原菌生長季節(jié)內(nèi)豌豆白粉菌以分生孢子進(jìn)行侵染，分生孢子借風(fēng)力傳播相當(dāng)遠(yuǎn)的距離。分生孢子數(shù)量大，在適宜條件下，很快造成病害流行。日照充足多風(fēng)，土壤和空氣濕度中等，海拔較高等環(huán)境有利于此病發(fā)生。白粉病菌侵害百脈根可以使植株葉片的兩面、莖、葉柄、莢果等部位受害，其中侵染對象以葉片為主。病部表面出現(xiàn)白色霉?fàn)畎撸跗诓“咝《蕡A形，后擴(kuò)大并互相匯合，以致覆蓋葉片大部至整片小葉。嚴(yán)重影響了百脈根植株的正常的生長發(fā)育過程，會給牧草業(yè)帶來的極大的經(jīng)濟(jì)損失?？共∵z傳資源的利用及抗病育種是公認(rèn)的植物病害防治最有效的方法，抗白粉病基因的克隆及獲得將有助于百脈根育種研究的進(jìn)一步發(fā)展。MLO型抗病基因是植物特異的一類抗病基因。研究者最早發(fā)現(xiàn)MLOresistance locus 2)基因?qū)Π追鄄】剐允鞘加?937-1938年，由德國人在埃塞俄比亞采集了很多品種的大麥，其中的兩個株系對白粉病菌QUunwriei gremiriis f. sp. hordei)所有己知的生理小種都具有高效抗性。進(jìn)一步研究表明，大麥中MLO基因的隱性突變mlo可以使大麥對幾乎所有己知大麥白粉病菌的生理小種產(chǎn)生持久、廣譜的抗性。最近，研究者發(fā)現(xiàn)很多植物的抗白粉病基因都是MLO型基因控制，如番茄，豌豆、擬南芥、辣椒、薔薇、百脈根等等。因此挖掘植物中的MLO型抗病基因?qū)χ参锟拱追鄄∮N具有重要的作用。目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有圖位克隆，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等方法。但是由于百脈根的基礎(chǔ)研究不夠深入，因此利用這些方法不僅時間長而且很難準(zhǔn)確地克隆這些基因。因此，如何快速鑒定百脈根中的MLO型抗病基因?qū)⒊蔀榘倜}根抗白粉病育種的重要前提。植物比較基因組學(xué)(Comparative Genomics)是基于基因組圖譜和測序基礎(chǔ)上,對已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化的學(xué)科。利用模式植物基因組與其它植物基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆其他植物基因，揭示基因功能和分子機(jī)制，闡明物種進(jìn)化關(guān)系及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。本專利所采用的方法及思路模式植物擬南芥基因組研究已經(jīng)揭示了 MLO型基因的功能，利用基因其順序上的同源性克隆百脈根MLO型抗病基因，根據(jù)模式植物擬南芥實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上的優(yōu)越性和已知MLO型抗病基因的特點(diǎn)，快速“捕捉”百脈根抗白粉病基因。近年來，百脈根基因組測序的完成為我們快速挖掘百脈根白粉病基因提供了條件。本專利介紹了以百脈根全基因組序列為前提，結(jié)合比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)和候選基因策略等知識，快速挖掘白粉病基因。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種通過結(jié)合植物比較基因組學(xué)、植物遺傳學(xué)、基因組學(xué)和生物信息學(xué)等知識，快速挖掘百脈根抗白粉病基因。其結(jié)果一方面可用于百脈根白粉病基因緊密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，另一方面也為其他作物白粉病基因鑒定提供參考依據(jù)。
技術(shù)方案
主要原理第一個植物抗白粉病基因(MLO)是從大麥中克隆的，研究發(fā)現(xiàn)此基因是一類特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多數(shù)NBS (nucleotide-binding site)類型抗病基因；隨后，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因，研究發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的都是MLO型抗病基因。隨后，眾多研究者通過多次試驗(yàn)證實(shí)MLO型抗病基因已經(jīng)成為植物特有的一類抗白粉病基因。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，植物MLO類型基因是一個基因家族；而且對來源于不同物種的MLO基因家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，不同物種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類MLO基因都具有抗白粉病基因序列的典型特征。百脈根基因組測序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以借助于已經(jīng)測序的百脈根全基因組中MLO基因家族和已經(jīng)克隆的MLO白粉病基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及對于維持白粉病基因MLO重要功能的氨基酸保守性來鑒定百脈根白粉病基因。主要步驟如下
O百脈根全基因組序列的下載及其MLO型基因的采集
首先從百脈根測序基因組數(shù)據(jù)庫(http://www. kazusa. or. jp/lotus/index, html)下載百脈根全基因組序列；使用“DNAT00LS”軟件對獲得的百脈根全基因組氨基酸序列數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫，然后用pfam數(shù)據(jù)庫(蛋白家族數(shù)據(jù)庫，http://pfam.janelia.org/search/sequence)中的隱馬爾可夫模型(HMM)對MLO結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與已建立的百脈根全基因組氨基酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp (E-Value=O. 001)序列比對，初步篩選出候選基因序列。其次，利用已經(jīng)公布的MLO型基因序列，對百脈根基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，獲得候選基因序列。2)百脈根MLO型基因家族的鑒定
將上述結(jié)果中得到的同源核苷酸序列的候選基因，通過Pfam(E-Value=LO)進(jìn)行分析，去除無‘ML0’結(jié)構(gòu)域的基因序列(圖I)。再將候選抗病基因序列通過MEGA3. I軟件提供的ClustalW工具(多序列比對程序)進(jìn)行多序列比對，去除重復(fù)序列。3)通過植物MLO型基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系鑒定候選的百脈根MLO型白粉病基因 由于先前的研究已經(jīng)證明，雙子葉植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系統(tǒng)發(fā)育樹同一區(qū)組，因此在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中，我們把擬南芥的MLO型基因家族和一些其他作物的MLO型抗白粉病基因和百脈根MLO型基因一起聚類分析，以獲得候選的百脈根抗白粉病基因(圖2)。4)百脈根白粉病基因與已知的植物MLO白粉病基因的比對
利用BioXM 2.6軟件將百脈根候選的MLO型白粉病基因和擬南芥、番茄、豌豆、大麥的MLO白粉病基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成Fasta格式的文件，將這些文件導(dǎo)入BioEdit 7. O軟件，運(yùn)用此軟件中Clustal軟件進(jìn)行多序列比對，揭示白粉病基因重要氨基酸殘基及區(qū)域的保守性。從而進(jìn)一步鑒定百脈根候選的白粉病基因(圖3)。本發(fā)明的積極效果
O縮短了百脈根白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定。采用常規(guī)方法(圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等)挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。本發(fā)明基于植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信息學(xué)方法快速挖掘百脈根白粉病基因，不僅可以縮 短時間，還可以提高白粉病基因鑒定效率。2)百脈根(Zoiw1S cornioulatus L.)屬于豆科百脈根屬，是研究豆科作物模式物種。由于百脈根遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源多樣性低，因此通過常規(guī)的分子標(biāo)記(RAPD、ISSR、SSR、AFLP等)鑒定百脈根白粉病基因比較困難。通過鑒定的候選白粉病基因開發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標(biāo)記(SNP、SCAR等)，可以快速的用于抗病基因的分子標(biāo)記輔助選擇，準(zhǔn)確性高。3)多抗性育種材料的創(chuàng)制?；谛妈b定的白粉病基因開發(fā)的功能性分子標(biāo)記，結(jié)合已經(jīng)定位的其他抗病基因的分子標(biāo)記，進(jìn)行多抗性育種材料的創(chuàng)制，可以縮短育種年限，提聞育種效率。4)為闡述百脈根抗白粉病分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。百脈根抗白粉病基因的鑒定，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)、RNAi、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技術(shù)等研究抗白粉病的分子機(jī)制提供了基因資源，有利于快速闡述百脈根抗白粉病的作用機(jī)理。


圖I百脈根MLO基因的鑒定；
本圖顯示的是10個MLO型基因鑒定結(jié)果，每一個基因都含有一個‘ML0’保守結(jié)構(gòu)域。圖2植物MLO基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析及其百脈根MLO型白粉病基因的鑒定;
擬南芥是植物科學(xué)研究的模式植物，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中，擬南芥的15個MLO型基因(其中3個基因是白粉病基因AtML002，AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因(SlMLO)、大麥白粉病基因(HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因(PsMLO)被選擇用來和百脈根MLO型基因聚類分析。共鑒定出I個百脈根候選的MLO型白粉病基因。圖中斜體標(biāo)記的基因就是候選百脈根白粉病基因。圖3百脈根MLO型白粉病基因的比對分析；
I個百脈根白粉病基因與大麥(HvMLO)、番茄(SlMLO)、豌豆(PsMLO)、擬南芥白粉病基因(AtML002，AtML006和AtML012)進(jìn)行比對，鑒定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸殘基和區(qū)域的保守型。圖中TM1-TM7表示百脈根MLO型白粉病基因的7個轉(zhuǎn)模區(qū)域；黑色圓點(diǎn)表示白粉菌侵染重要的氨基酸殘基；CaMBD表示鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)；1和II表示對白粉菌侵染重要的氨基酸區(qū)域。
具體實(shí)施例方式抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本方法可以快速鑒定出百脈根白粉病基因。具體實(shí)施過程如下
O百脈根MLO型基因的采集及鑒定
為了獲得百脈根全部的MLO型基因家族成員，我們首先以擬南芥的MLO型基因，番茄、豌豆、辣椒、薔薇、百脈根的抗白粉病MLO基因序列構(gòu)建HMM模型，從百脈根基因組序列中收索MLO型基因；其次以不同作物中已經(jīng)發(fā)表的MLO基因序列作為靶序列(來自DFCI數(shù)據(jù)庫TC171015, TC267529, DFCI: TC327983, TC289653, TC312087, TC132500,TC133436, TC317623, TC317025, TC315947, TC325903, TC315944, TC315912, TC322759,TC322059, TC330654, TC282713, TC293173, TC281861, TC283253, TC283383,TC285032, TC290021, TC302716, TC283487, TC282866, TC283441, TC281428, TC285118,TC285090;來自 GenBank 數(shù)據(jù)庫AY967408, AF384145, AF384144, AY029312-AY029315,AY029317-AY029319, Z95352, AF369563-AF369565, AF369567, AF369569-AF369576，Z83834, Z95496, AY581255),對百脈根數(shù)據(jù)庫(http://www. kazusa. or. jp/lotus/index,html)進(jìn)行BLAST比對，選擇相似度最高的序列進(jìn)行下載，共獲得了 10條候選的MLO型基 @(LjT43M12. 190. r2. a; chrl. CM0017. 1150. r2. a; chr6. CM0066. 530. r2. a; chr6.CM0114. 350. r2. m; chrl. CM. 0113. 1360. r2. d; LiT40B16. 20. r2. m; chr6. CM0508. 460.r2. m; chr2. CM0272. 1030. r2. d; chrl. CMOl 13. 1440. r2. d; LjSGA_047574. I)。2)百脈根MLO型基因家族的鑒定
為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些MLO基因準(zhǔn)確性，我們對這10個候選的MLO基因進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域“ML0”的鑒定。以每一個候選的MLO型基因的氨基酸序列為基準(zhǔn)，在PFAM(http://pfam.sanger. ac.uk/)網(wǎng)站上進(jìn)行‘ML0’保守結(jié)構(gòu)域的鑒定,具體結(jié)果見圖I。3)百脈根MLO型基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析
在先前的研究中，發(fā)現(xiàn)雙子葉植物白粉病基因聚合成一個區(qū)組；因此，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中，我們選擇了模式植物擬南芥的15個MLO型基因(其中3個基因是白粉病基因AtMLOO2，AtML006和AtMLO 12)、番茄抗白粉病基因、大麥白粉病基因和豌豆的白粉病基因和百脈根MLO型基因聚類分析一起聚類分析。將百脈根MLO型基因和其他作物白粉病基因蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列聯(lián)配(采用Clustal X I. 83軟件進(jìn)行)，并利用Genedoc軟件(http://www. nrbsc. org/gfx/genedoc/index, html)顯不多序列聯(lián)配的結(jié)果。將Clustal多序列聯(lián)配的結(jié)果輸出到MEGA 4.0軟件中，并利用此軟件分別構(gòu)建了鄰接樹(neighbor-joining, NJ),利用Bootstrapping方法對這些進(jìn)化樹進(jìn)行了評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在雙子葉植物抗白粉病基因區(qū)組內(nèi)，存在I個百脈根候選的MLO型白粉病基因(見圖2)。4)百脈根MLO型抗病基因的比對
在大麥MLO型白粉病基因研究中，研究中相繼發(fā)現(xiàn)了一些重要區(qū)域和單個氨基酸，它們對大麥白粉菌侵染有著不可替代的作用。為了鑒定I個候選的百脈根白粉病基因中，這些重要區(qū)域和氨基酸是否高度保守，我們對來自擬南芥的3個抗白粉病基因(AtML002、AtML06和AtML012)、番茄白粉病基因(S1ML0)、豌豆白粉病基因(PsMLO)進(jìn)行了比對分析。、發(fā)現(xiàn)百脈根I個候選的白粉病基因與已知的MLO型白粉病基因7個跨膜區(qū)，30個重要的氨 基酸，I個鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)(CaMBD)和兩個重要的區(qū)域(I和II)高度保守(圖3)。
權(quán)利要求
1.百脈根抗白粉病基因，其特征在于選自下列I個基因 LjT40B16. 20. r2. m 氨基酸序列MAKEDRVYERTLEETPTWAVAVVCFVLLAISIIIEHIIHAIGKWFKKKRKNALFEALEMVKGELMLMGFISLLLTVLQDPISKICISKSVASTWHPCANPKTKTKHDADSDSDDSNHRKLLEYFDLIPRRVLATKGYDKCHDKGKVALVSAYGIHQLHIFIFVLAIFHILQCIITLGLGRIKMRRWTRWEDETKTFEYQFYNDPERFRFARDTTFGRRHLSTWARSPVSLWIVSFLRQFYGSVTKVDYMALRHGFVMAHLAPGNDANFNFQKYINRSLEEDFKVVVGISPIIWFCAVLFLLTNAHGffYSYYffLPFIPLIIILLVGTKLQMIITMMGLRIQDRGEVIKGAPMVEP⑶HLFWFNRPSLLLFLIHLVLFQNAFQLAFFSWSTYEFSLRSCFHEKNVDIIIRLTLGVVIQFLCSYVTLPLYALVTQMGSTLKPTIFNERVADALKKWHHTAKRQVKHSKHSEANSITPFSSRPATPTHGMSPVHLLHRHLAGRSDSVETSPRTSNYENEQWDVEGSNSPSNHPTGVDEIQLEVLEQRSEATELPITSTRHEISIAVSDFSFQKRHTGSD 核苷酸序列ATGGCTAAGGAAGACAGAGTTTATGAAAGAACTCTGGAAGAAACACCAACCTGGGCTGTTGCAGTTGTGTGCTTTGTGCTGCTTGCTATTTCAATCATAATTGAACATATTATTCATGCTATTGGAAAGTGGTTCAAAAAGAAGCGCAAAAATGCTCTTTTTGAAGCATTGGAAATGGTCAAAGGAGAGCTTATGCTGATGGGATTCATATCCTTGCTACTAACTGTGCTCCAAGATCCAATTTCTAAGATCTGTATATCAAAAAGTGTTGCATCCACTTGGCATCCTTGTGCCAATCCAAAGACAAAGACTAAACATGATGCAGATTCTGACAGTGATGATTCCAATCATAGGAAACTTCTCGAATATTTTGACCTCATTCCGCGGCGTGTTCTAGCTACAAAAGGATATGACAAGTGCCATGATAAGGGAAAAGTTGCCCTTGTTTCTGCATATGGGATCCACCAGCTCCACATATTTATTTTTGTGTTAGCTATTTTTCATATCCTACAATGCATTATAACACTTGGTTTGGGAAGGATTAAGATGAGACGCTGGACGAGATGGGAAGATGAAACAAAGACTTTTGAATATCAATTCTATAATGATCCTGAGAGGTTCAGATTTGCAAGGGACACAACATTTGGACGAAGGCACTTGAGCACGTGGGCTCGCTCACCAGTTTCCTTATGGATAGTTAGCTTCCTCAGACAATTCTATGGATCTGTTACTAAAGTTGATTACATGGCATTACGGCATGGATTTGTCATGGCACATCTAGCACCAGGAAACGATGCAAATTTCAATTTCCAGAAGTATATCAATAGATCACTAGAGGAGGATTTTAAAGTTGTGGTGGGAATAAGCCCTATTATATGGTTCTGTGCGGTGCTATTTCTGCTGACTAATGCTCATGGGTGGTATTCTTATTATTGGCTTCCATTTATCCCCTTAATTATAATCTTGCTAGTGGGTACTAAGCTACAAATGATCATAACAATGATGGGTTTGAGGATTCAAGACAGAGGTGAAGTAATCAAGGGTGCACCTATGGTTGAGCCAGGTGATCATCTGTTCTGGTTCAATCGTCCCAGCCTCCTTCTCTTTTTGATTCATCTTGTTCTCTTTCAGAATGCCTTTCAACTAGCTTTCTTTTCTTGGAGTACATATGAGTTCTCTCTAAGGTCATGCTTCCACGAAAAAAATGTGGATATTATCATTAGACTTACATTGGGGGTTGTAATACAATTCCTATGCAGCTATGTCACTTTGCCTCTTTATGCTCTAGTTACACAGATGGGTTCAACCTTGAAACCAACAATTTTCAATGAAAGAGTAGCAGATGCACTGAAGAAATGGCACCACACAGCCAAAAGGCAAG TCAAACACAGCAAGCATTCTGAGGCTAACAGCATCACACCATTCTCGAGCAGGCCAGCGACGCCAACGCACGGCATGTCTCCGGTTCACCTGCTGCACAGACACCTTGCCGGCCGCAGCGACAGTGTGGAAACTTCTCCGAGGACATCGAACTACGAGAATGAGCAGTGGGATGTTGAAGGCTCAAATTCTCCAAGTAACCACCCAACAGGAGTTGATGAGATACAGTTGGAAGTTTTGGAGCAACGTTCAGAAGCAACAGAATTGCCTATTACCAGCACTAGACATGAAATCAGCATTGCTGTATCCGATTTTTCTTTCCAGAAGCGACACACCGGTAGTGATTAGo
2.權(quán)利要求I所述快速鑒定百脈根白粉病基因的應(yīng)用，包括 [I)育種材料的創(chuàng)制。
[3.2)抗白粉病的育種實(shí)踐。
[4.3)抗白粉病基礎(chǔ)理論研究。
全文摘要
本發(fā)明是快速鑒定百脈根抗白粉病基因；涉及到植物比較基因組學(xué)，遺傳學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科知識，屬于植物生物技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域。該發(fā)明主要步驟為1)百脈根全基因組序列的下載及MLO型基因的采集；2)MLO型基因的鑒定；3)MLO型基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；4)MLO型白粉病基因的比對。該發(fā)明有效的縮短了百脈根白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定；通過鑒定的候選白粉病基因開發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標(biāo)記(SNP、SCAR等)，還可以快速的用于抗白粉病基因的分子標(biāo)記輔助選擇，準(zhǔn)確性高；結(jié)合其它抗病基因分子標(biāo)記可進(jìn)行多抗性育種材料的創(chuàng)制，縮短育種年限，提高育種效率；為闡述百脈根抗白粉病分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK102703463SQ20121009504
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者俞錁, 劉云飛, 錢孝英 申請人:常熟市支塘鎮(zhèn)新盛技術(shù)咨詢服務(wù)有限公司