專利名稱：快速純化及制備細菌pcr反應(yīng)模板的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，尤其涉及了一種快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法。
背景技術(shù)：
PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病原菌的診斷，具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。自然標本中因含有大量的雜菌及異物(包括PCR反應(yīng)抑制物)，對自然標本中特定病原菌的檢測，一般先使用針對該病原菌的特定培養(yǎng)液進行增菌培養(yǎng)，或使用平板(鑒別)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后取增菌液或挑取平板培養(yǎng)基中疑似的病原菌菌落，制備PCR反應(yīng)模板，進行PCR檢測。由于自然標本中存在PCR反應(yīng)抑制物，因此不宜省略增菌培養(yǎng)或鑒別培養(yǎng)的步驟。在整個檢測過程中，增菌培養(yǎng)及平板(鑒別)培養(yǎng)耗時費力。本研究以磁性細菌由來的磁珠(bacterial magnetic particles, BMPs)為載體 [K2]，合成免疫BMPs[2、3]，使用免疫BMPs，直接對糞便標本中的大腸桿菌0157進行捕獲、分離和洗凈，不進行增菌培養(yǎng)及平板(鑒別)培養(yǎng)，探討快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法。使用免疫BMPs快速純化細菌PCR反應(yīng)模板，旨在縮短檢測時間，去除自然標本中存在的PCR反應(yīng)抑制物等影響檢測的成分。同時，也可以考慮應(yīng)用于某些在人工培養(yǎng)基中培養(yǎng)困難的病原菌的PCR反應(yīng)模板的制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，縮短了檢測時間，利用免疫BMPs捕獲自然標本(糞便)中的目標病原菌，通過分離和洗凈，去除標本中存在的PCR反應(yīng)抑制物等影響因素，可省略增菌培養(yǎng)及鑒別培養(yǎng)，快速純化目標病原菌的PCR反應(yīng)模板的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決 快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法，包括以下步驟
步驟a 牛糞便標本中添加PBS溶液5 mL,混勻，1000 r/min離心30 s,去除大顆粒的雜質(zhì)；
步驟b 向含菌的牛糞稀釋液中添加免疫BMPs 0. 3 mg,混合均勻，反應(yīng)30 min后進行磁性誘導，從牛糞中分離出磁性凝集物；
步驟c 分離出來的磁性凝集物使用PBS溶液分散清洗3次，清洗后，添加滅菌雙蒸水 100 μ L，分散，重新振蕩懸浮后至95°C加熱5 min ；再經(jīng)12000 r/min離心5 min ； 步驟d 回收上清液，制得PCR反應(yīng)模板。作為優(yōu)選，所述的PBS溶液的ph值為6. 8。作為優(yōu)選，所述的磁性誘導采用普通磁石進行誘導。作為優(yōu)選，所述的牛糞便標本中的大腸桿菌0157濃度為1 IO4 cfu/g。BMI3S系穩(wěn)定的單磁疇晶體，不同于一般合成磁珠的多磁區(qū)構(gòu)造，在溶液中分散性能明顯優(yōu)于普通鐵氧體磁珠，反應(yīng)表面積相對穩(wěn)定，檢測的敏感性及穩(wěn)定性較好[1~2]。另外，通常在人工合成的無機磁珠表面進行生物包被或修飾后穩(wěn)定性欠佳，而BMPs能改善這一現(xiàn)象，大量實驗結(jié)果均表明修飾后免疫BMPs的穩(wěn)定性及可操作性良好[2、4、5]。本研究的結(jié)果表明，對于大腸桿菌0157濃度為1 IO4 cfu/g的牛糞便標本，使用免疫BMPs處理后制備PCR反應(yīng)模板，PCR檢測結(jié)果，與通過增菌及平板培養(yǎng)后制備PCR反應(yīng)模板，檢測結(jié)果一致。表明使用免疫BMPs，可以直接對糞便標本中的大腸桿菌0157進行有效捕獲、分離和洗凈，可省略常規(guī)的增菌培養(yǎng)及平板(鑒別)培養(yǎng)，快速純化細菌的PCR反應(yīng)模板。在大腸桿菌0157濃度低于IO3 cfu/g時，經(jīng)免疫BMPs處理后制備PCR反應(yīng)模板、 及通過增菌和平板培養(yǎng)后制備PCR反應(yīng)模板，比糞便標本直接制備PCR反應(yīng)模板，PCR檢測的敏感性明顯增高。美國農(nóng)業(yè)部動物排泄物病源菌研究實驗室的Shelton等[6]報告了一種快速定量及確定自然水體和人工水體中存在的大腸桿菌0157的方法，Shelton等的方法是將大腸桿菌0157的單克隆抗體吸附到人工合成的磁顆粒上，使其與病菌結(jié)合，磁性分離后進行培養(yǎng)檢測。這種方法可以檢出100 mL水中含有的數(shù)個大腸桿菌0157，這一方法有助于衛(wèi)生機構(gòu)對公共水上場所進行檢查。檢測糞便等非水溶液的樣品標本，在對病原菌的核酸提取過程中，糞便等自然標本中的鹽離子、尿素、血紅素等諸多混合物共同沉淀其中，成為下一步PCR反應(yīng)的抑制因素。因此，如何去除自然標本中PCR反應(yīng)的抑制物，是有效制備DNA模板的關(guān)鍵之一[7]。本研究采用免疫磁分離法，在分離牛糞標本中的大腸桿菌0157時，同時一并去除牛糞標本中可能存在的其他混合物。免疫磁分離法的主要特點是利用外磁場(普通磁石)對標的物進行誘導、分離，還可以對標的物進行清洗，去除自然標本中存在的，包括PCR反應(yīng)抑制物在內(nèi)的影響檢測結(jié)果的各種成分。Padhye等[8]用大腸桿菌0157單克隆抗體研究大腸桿菌0157以外的交叉反應(yīng)， 未發(fā)現(xiàn)與沙門氏菌、結(jié)腸炎耶氏森菌、志賀氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反應(yīng)，提示單克隆抗體對大腸桿菌0157有明顯的特異性，將大腸桿菌0157單克隆抗體包被于磁珠表面，可對標本中低濃度大腸桿菌0157進行磁捕獲及分離。使用不同的免疫BMPs，不僅可捕獲、分離多種病原菌，還可采用不同抗體、特定受體包被的BMI^s來捕獲、分離多種靶細胞[9]°]。此夕卜，也可將BMPs標記核酸探針，用于分離高質(zhì)量DNA或RNA，尤其適用于分離核酸含量較低的樣本[11]。修飾后的免疫Biffs作為特定載體，可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，進行特定抗原的捕獲、分離和洗凈，快速純化其PCR反應(yīng)模板。同樣，病原菌通過增菌及平板培養(yǎng)后， 挑取疑似的病原菌菌落，制備PCR反應(yīng)模板，也去除了原標本中的PCR反應(yīng)抑制物。免疫磁分離法分離的是標本中的原始病原菌，而培養(yǎng)法獲取的是由原始病原菌增殖的菌落。對于實驗室內(nèi)培養(yǎng)困難的某些病原菌，可考慮使用經(jīng)免疫磁分離處理后制備PCR反應(yīng)模板的方法。本發(fā)明由于采用了以上技術(shù)方案，具有顯著的技術(shù)效果
本發(fā)明利用免疫BMPs捕獲自然標本(糞便)中的目標病原菌，通過分離和洗凈，去除標本中存在的PCR反應(yīng)抑制物等影響因素，可省略增菌培養(yǎng)及鑒別培養(yǎng)，快速純化目標病原菌的PCR反應(yīng)模板。本方法操作簡單，大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進ー步詳細描述 實施例1
1材料和方法 1.1試劑
大腸桿菌0157 vt\,vt2 PCR檢測試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品(One Short PCR Typing Kit Ver. 2) ；PCR所需試劑已全部分裝在各離心管內(nèi)，只需加入反應(yīng)模板，就能進行PCR反應(yīng)。檢測的目的基因及產(chǎn)物長度為:κ 1:349 bp ;Ki2，Ki2vha，Ki2vhb，Ki2vpl，Ki2vp2:112 bp。從磁性細菌中獲取BMPs，將大腸桿菌0157抗體接種于BMPs表面，形成免疫BMPs。BMPs 提取及免疫BMPs的合成見文獻[2、3]。大腸桿菌0157抗體及大腸桿菌0157鑒別用平板培養(yǎng)基由TSMERI TECH公司提供。1. 2 標本
本研究使用大腸桿菌0157污染的牛糞標本47份，大腸桿菌0157濃度為1 IO4 cfu/ g ；使用無大腸桿菌0157污染的普通牛糞標本5份。1.3 PCR反應(yīng)模板
(1)經(jīng)免疫BMPs處理后制備PCR反應(yīng)模板取含有大腸桿菌0157的牛糞便標本1 g， 添加Ph值為6. 8的PBS溶液5 mL，混勻，1000 r/min，離心30 s，去除大顆粒的雜質(zhì)，含菌的牛糞稀釋液中添加免疫BMPs 0.3 mg，混合均勻，反應(yīng)30 min后，將結(jié)合了目標病原菌的免疫BMI^s用外磁場(普通磁石)進行磁性誘導，從牛糞中分離出來。分離出來的磁性凝集物使用PBS溶液分散清洗3回。清洗后，結(jié)合了目標病原菌的磁性凝集物，添加滅菌雙蒸水 100 μ L，分散，重新振蕩懸浮后至95°C加熱5 min。再經(jīng)12000 r/min離心5 min?；厥丈锨逡?，PCR檢測用。并且，取無大腸桿菌0157污染的普通牛糞便標本1 g，同樣方法進行處理，備測。(2)經(jīng)增菌及平板培養(yǎng)后制備PCR反應(yīng)模板增菌培養(yǎng)液組成為(g/L) Tryptone 20, bile salts 1. 12, lactose 5. 0, K2HPO4 4. 0, KHoPOa 1. 5g, NaCl 5. 0, soaium novobiocin:20 mg/L, pH7. 0。取含有大腸桿菌0157的牛糞便標本1 g，添加增菌培養(yǎng)液5 mL，混勻，1000 r/min，離心30 s，去除大顆粒的雜質(zhì)，含菌的牛糞稀釋液，37°C振蕩培養(yǎng)12 h。取12 h培養(yǎng)后的增菌液0.1 mL，涂布于大腸桿菌0157平板培養(yǎng)基，37°C恒溫培養(yǎng)M h，然后挑取菌落少許，添加滅菌雙蒸水100 μ L，分散，重新振蕩懸浮后至95°C加熱5 min。 再經(jīng)12000 r/min離心5 min?；厥丈锨逡?，PCR檢測用。(3)標本直接制備PCR反應(yīng)模板取含有大腸桿菌0157的牛糞便標本1 g，添加 PBS溶液5 mL，混勻，1000 r/min，離心30 s，去除大顆粒的雜質(zhì)，含菌的牛糞稀釋液經(jīng)5000 r/min離心5 min，棄上清液。沉淀物添加滅菌雙蒸水100 μ L，分散，重新振蕩懸浮后至 95°C加熱5 min。再經(jīng)12000 r/min離心5 min?；厥丈锨逡?，PCR檢測用。并且，取無大腸桿菌0157污染的普通牛糞便標本1 g，同樣方法進行處理，添加PBS溶液5 mL，混勻，1000 r/min，離心30 s，去除大顆粒的雜質(zhì)，牛糞稀釋液經(jīng)5000 r/min離心5 min，棄上清液。 沉淀物添加滅菌雙蒸水100 μ L，分散，重新振蕩懸浮后至95°C加熱5 min。再經(jīng)12000 r/ min離心5 min?；厥丈锨逡?，PCR檢測用。1.4 PCR 檢測取回收的熱變性上清液25 μ L，加入PCR管內(nèi)，滅菌雙蒸水25 yL為陰性對照。于 PCR儀中運行以下程序94°C 1 min，55°C 1 min，72°C 1 min，；35個循環(huán)，最后72°C延伸10 min。PCR結(jié)束后，取10 μ L PCR產(chǎn)物，添加配套的上樣緩沖液1. 5 μ L，于瓊脂凝膠中電泳， 紫外透射儀中觀察結(jié)果。1. 5大腸桿菌0157菌濃度調(diào)查
取含有大腸桿菌0157的牛糞便標本1 g，添加PBS溶液2. 5 mL，混勻，取含菌的牛糞稀釋液適量，涂布于大腸桿菌0157平板培養(yǎng)基，37°C恒溫培養(yǎng)，觀察菌落生長并統(tǒng)計菌落數(shù)。結(jié)果
1.無大腸桿菌0157污染的普通牛糞標本5份，經(jīng)(1)說明的方法，使用免疫BMPs處理后制備PCR反應(yīng)模板、以及(3)說明的方法，標本直接制備PCR反應(yīng)模板，PCR檢測結(jié)果均為陰性。2. 47份牛糞便標本中，經(jīng)檢測大腸桿菌0157濃度為1 10 cfu/g的12份，大腸桿菌0157濃度為11 IO2 cfu/g的19份，大腸桿菌0157濃度為101 IO3 cfu/g的13 份，大腸桿菌0157濃度為1001 IO4 cfu/g的3份。3.相同的牛糞便標本，分別以(1)使用免疫BMPs處理后制備PCR反應(yīng)模板、(2) 經(jīng)增菌及平板培養(yǎng)后制備PCR反應(yīng)模板、(3)標本直接制備PCR反應(yīng)模板三種方法制備PCR 反應(yīng)模板，PCR檢測顯示κ 及/或vtl基因陽性例的結(jié)果見表1。表1 PCR檢測顯示κ 及/或付2基因陽性例
Table 1 PCR analysis showed that vtl and / or vt2 gene-positive cases
權(quán)利要求
1.快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟a 牛糞便標本中添加PBS溶液5 mL,混勻，1000 r/min離心30 s,去除大顆粒的雜質(zhì)；步驟b 向含菌的牛糞稀釋液中添加免疫BMPs 0. 3 mg,混合均勻，反應(yīng)30 min后進行磁性誘導，從牛糞中分離出磁性凝集物；步驟c 分離出來的磁性凝集物使用PBS溶液分散清洗3次，清洗后，添加滅菌雙蒸水 100 μ L，分散，重新振蕩懸浮后至95°C加熱5 min ；再經(jīng)12000 r/min離心5 min ；步驟d 回收上清液，制得PCR反應(yīng)模板。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法，其特征在于所述的PBS溶液的ph值為6.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法，其特征在于所述的磁性誘導采用普通磁石進行誘導。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法，其特征在于所述的牛糞便標本中的大腸桿菌0157濃度為1 IO4 cfu/g。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，公開了一種快速純化及制備細菌PCR反應(yīng)模板的方法，將大腸桿菌O157抗體接種于BMPs表面，制成免疫BMPs。使用免疫BMPs，對含有不同濃度大腸桿菌O157的糞便標本，進行目標病原菌的捕獲、分離和洗凈，再使用洗凈的病原菌制備PCR反應(yīng)模板。本發(fā)明利用免疫BMPs捕獲自然標本(糞便)中的目標病原菌，通過分離和洗凈，去除標本中存在的PCR反應(yīng)抑制物等影響因素，可省略增菌培養(yǎng)及鑒別培養(yǎng)，快速純化目標病原菌的PCR反應(yīng)模板。
文檔編號C12N15/10GK102533739SQ20121009510
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者解宇 申請人:杭州師范大學