專利名稱：一種黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種側(cè)翼序列分離的方法，尤其是涉及一種基于同尾酶設(shè)計的黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法
背景技術(shù)：
目前應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法主要有SON-PCR、TAIL-PCR及接頭-PCR。SON-PCR和TAIL-PCR是基于熱不對稱原理發(fā)明的PCR方法，這兩種方法由于第二鏈合成的隨機性，以及轉(zhuǎn)基因株系大多不是單拷貝的緣故，造成引物匹配混亂，導(dǎo)致獲得有用片段的效率不高。接頭-PCR方法可以大大提高有效片段的獲得，現(xiàn)已公布了三種接頭-PCR獲得側(cè)翼序列的方法，但都存在一些缺點，如有的方法采用平端連接接頭，使得連接效率低，不利于后期的PCR擴增；有的方法雖然使用黏性末端接頭，提高了連接效率，但可供選擇的酶的種類有限，適用范圍不廣，通用性不高；并且這幾種方法接頭合成費用都很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中連接效率和通用性不能兼容，成本高的不足，提供一種連接效率高，通用性高，成本低的黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法。本發(fā)明解決所述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法，包括如下步驟
1)提取待測基因組DNA;
2)分析已知序列的酶切位點分布情況，選擇一組在已知序列中沒有酶切位點的同尾酶；設(shè)計并合成該組同尾酶對應(yīng)的連接接頭；
3)在同一反應(yīng)體系中，用該組同尾酶酶切待測基因組；或在不同的反應(yīng)體系中，分別用同尾酶酶切基因組，形成具有相同的黏性末端的DNA片段；
4)電泳檢測酶切質(zhì)量，純化后定量DNA片段濃度；將所述接頭與基因組酶切產(chǎn)物(即同尾酶消化的DNA片段)連接，形成“接頭-酶切片段(即同尾酶消化的DNA片段)-接頭”的DNA片段；
5)純化“接頭-酶切片段(即同尾酶消化的DNA片段)-接頭”的DNA片段，用已知序列的特異引物SI和S2與接頭序列設(shè)計的引物Al和A2對步驟2)所得“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段進行PCR擴增；
6)回收步驟3)獲得的片段并測序；
7)分析測序結(jié)果，獲得已知序列的未知側(cè)翼序列；
8)未知側(cè)翼序列的驗證。步驟I)中的一組同尾酶指
a 同尾酶 BamHI，Bell, BglII, Bspl43I, MboI, PsuI ；b 同尾酶 NcoI, PscI, BtgI, Ecol30I, FatI, PagI ；C 同尾酶 PstI, Alw21I, BseSI, Mphll03I, SdaI, SduI ；d 同尾酶 NdeI, Csp6I, FspBI, Trull, VspI ；e 同尾酶 NotI, Bspl20I, CfrI, Eco52I ；f 同尾酶 XhoI, BauI, Eco88I, Sail, SmoI ；g 同尾酶 XbaI, BcuI, Ecol30I, NheI, XmaJI ；h 同尾酶 SphI，Xcel，HinlII ；i 同尾酶 EcoRI, Muni, TasI, XapI ；j 同尾酶 Tati, Acc65I, BshNI, Bspl407I, Pfl23II ；k 同尾酶 BshTI, Bsaffl, Cfr9I, CfrlOI, Kpn2I, NgoMIV, SgrAI ；I 同尾酶 Hinll，Bspll9I, Bsul5I, Hin6I, HpaII, MaeII, MspI, NarI, Pspl406I,SsiI, TaqI, XmiI ；
m 同尾酶 MauBI, MluI, Paul, SgsI ；n 同尾酶 Pacl, BstKTI, SfaNI (即 AsiSI), PvuI ；
o同尾酶 SacI，Alw21I, Eco24I, SduI ；p 同尾酶 SspDI，BshNI ；q 同尾酶 Tail, AatII ；
步驟2)中所述接頭由兩條單鏈互補配對形成，形成的雙鏈能與一組同尾酶消化的所有片段連接；兩條單鏈長度都為48-52bp，形成雙鏈后一端為平端，一端帶有同一組同尾酶的互補序列；黏性端的5’端堿基磷酸化。步驟3)中，特異引物SI和特異引物S2是根據(jù)已知序列設(shè)計的嵌套引物，特異引物SI在特異引物S2的外側(cè)；特異引物SI和特異引物S2的退火溫度為70°C ±2°C。步驟3)中，引物Al和引物A2是根據(jù)接頭序列設(shè)計的兩條同向嵌套引物，與待測基因組的同源性不超過40%，引物Al在引物A2的外側(cè)；引物Al的退火溫度為60°C ±2°C，引物A2的退火溫度為70°C ±2°C。步驟3)中，所述PCR擴增包括兩輪反應(yīng)，第一輪反應(yīng)的引物為特異引物SI與引物Al，第二輪反應(yīng)的引物為特異引物S2與引物A2 ;第一輪反應(yīng)模板為酶切連接產(chǎn)物(即“接頭-酶切片段-接頭”片段)，反應(yīng)程序為①98°C預(yù)變性3min ;②5循環(huán)(98°C 10s,70°C5-10min) ;25 循環(huán)(98°C 10s,60°C 30s, 72°C 5-lOmin)③最后延伸 72°C IOmin 4°C保存；第二輪反應(yīng)模板為第一輪反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)程序為①98°C預(yù)變性3min;②35循環(huán)(980C 10s，70°C 5-10min);③延伸72°C IOmin ； 4°C保存；所用PCR酶為擴增長片段的DNA聚合酶。步驟4)中，當回收片段濃度> 20ng/yl時，將回收片段直接送交測序，測序引物為特異引物S2和引物A2 ;當回收片段濃度<20ng/yl時，先連到T載體，然后再測序。步驟6)中所述側(cè)翼序列的驗證方法為PCR方法，模板為待測基因組DNA ;上游引物根據(jù)已知序列的一端設(shè)計，下游引物根據(jù)所測側(cè)翼序列的一端設(shè)計，PCR產(chǎn)物大小為300-800bp ;進行普通PCR后能擴增出預(yù)期大小片段，則證明分離得到的側(cè)翼序列正確。所述引物Al 的序列為5’ - GTACAACGTGTCACTCTGGAGCAC - 3’，引物 A2 的序列為5’ - CTGGAGCACCTCTGCACGACGACCTGCGC - 3'；
特異引物SI和特異引物S2，由實驗者根據(jù)其所得已知序列設(shè)計，不同的實驗所用的特異引物不同。本發(fā)明所釆用的限制性內(nèi)切酶全部為產(chǎn)生黏性末端的限制性內(nèi)切酶，共有17組同尾酶，84種限制性內(nèi)切酶(見表1)，幾乎可以應(yīng)用于所有物種的基因組側(cè)翼序列的分析。為了增加所獲得側(cè)翼序列的可信度，通過幾種同尾酶之間的組合，可以對同一位點的側(cè)翼序列進行驗證，也可以獲得不同位點的側(cè)翼序列。
表I 17組同尾酶及其匹配接頭
權(quán)利要求
1.一種黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法，其特征在于，包括以下步驟 .1)提取待測基因組DNA; .2)分析已知序列的酶切位點分布情況，選擇一組在已知序列中沒有酶切位點的同尾酶；設(shè)計并合成該組同尾酶對應(yīng)的連接接頭； .3)在同一反應(yīng)體系中，用該組同尾酶酶切待測基因組；或在不同的反應(yīng)體系中，分別用同尾酶酶切基因組，形成具有相同的黏性末端的DNA片段； .4)電泳檢測酶切質(zhì)量，并定量DNA片段濃度；將所述接頭與基因組酶切產(chǎn)物連接，形成“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段； .5)純化“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段，用已知序列的特異引物SI和S2與接頭序列設(shè)計的引物Al和A2對步驟2)所得“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段進行PCR擴增； .6)回收步驟3)獲得的片段并測序； .7)分析測序結(jié)果，獲得已知序列的未知側(cè)翼序列； .8)未知側(cè)翼序列的驗證。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法，其特征在于，步驟I)中的一組同尾酶指a 同尾酶 BamHI，Bell, BglII, Bspl43I, MboI, PsuI ；b 同尾酶 NcoI, PscI, BtgI, Ecol30I, FatI, PagI ；c 同尾酶 PstI, Alw21I, BseSI, Mphll03I, SdaI, SduI ；d 同尾酶 NdeI, Csp6I, FspBI, Trull, VspI ；e 同尾酶 NotI, Bspl20I, CfrI, Eco52I ；f 同尾酶 XhoI, BauI, Eco88I, Sail, SmoI ；g 同尾酶 XbaI, BcuI, Ecol30I, NheI, XmaJI ； h 同尾酶 SphI，Xcel，HinlII ；i 同尾酶 EcoRI, Muni, TasI, XapI ；j 同尾酶 Tati, Acc65I, BshNI, Bspl407I, Pfl23II ；k 同尾酶 BshTI, Bsaffl, Cfr9I, CfrlOI, Kpn2I, NgoMIV, SgrAI ；I同尾酶 Hinll，Bspll9I, Bsul5I, Hin6I, HpaII, MaeII, MspI, NarI, Pspl406I,SsiI, TaqI, XmiI ；m 同尾酶 MauBI, MluI, Paul, SgsI ；n 同尾酶 Pacl, BstKTI, SfaNI, PvuI ；o 同尾酶 SacI，Alw21I, Eco24I, SduI ；p 同尾酶 SspDI，BshNI ；q 同尾酶 Tail, AatII0
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法，其特征在于，步驟2)中所述接頭由兩條單鏈互補配對形成，形成的雙鏈能與一組同尾酶消化的所有片段連接；兩條單鏈長度為48-52bp，形成雙鏈后一端為平端，一端帶有同一組同尾酶的互補序列；黏性端的5’端堿基磷酸化。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法，其特征在于，步驟3)中，特異引物SI和特異引物S2是根據(jù)已知序列設(shè)計的嵌套引物，特異引物SI在特異引物S2的外側(cè)；特異引物SI和特異引物S2的退火溫度為70°C ±2°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法，其特征在干，步驟3)中，引物Al和引物A2是根據(jù)接頭序列設(shè)計的兩條同向嵌套引物，與待測基因組的同源性不超過40%，引物Al在引物A2的外側(cè)；引物Al的退火溫度為60°C ±2°C，引物A2的退火溫度為70°C ±2°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法，其特征在于，步驟3)中，所述PCR擴增包括兩輪反應(yīng)，第一輪反應(yīng)的引物為特異引物SI與引物 Al，第二輪反應(yīng)的引物為特異引物S2與引物A2 ;第一輪反應(yīng)模板為酶切連接產(chǎn)物，反應(yīng)程序為① 98°C預(yù)變性 3min ;② 5 循環(huán)(98°C 10s, 70°C 5-lOmin) ;25 循環(huán)(98°C 10s, 60°C30s, 72 °C 5-10min)③最后延伸72°C IOmin 4°C保存；第二輪反應(yīng)模板為第一輪反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)程序為①98°C預(yù)變性3min;②35循環(huán)(98°C 10s，70°C 5-10min);③延伸72 °C IOmin 4°C保存；所用PCR酶為擴增長片段的DNA聚合酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法，其特征在干，步驟4)中，當回收片段濃度> 20ng/yl時，將回收片段直接送交測序，測序引物為特異引物S2和引物A2 ;當回收片段濃度< 20ng/y I時，先連到T載體，然后再測序。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法，其特征在干，步驟6)中所述側(cè)翼序列的驗證方法為PCR方法，模板為待測基因組DNA ;上游引物根據(jù)已知序列的一端設(shè)計，下游引物根據(jù)所測側(cè)翼序列的一端設(shè)計，PCR產(chǎn)物大小為300-800bp ；進行普通PCR后能擴增出預(yù)期大小片段，則證明分離得到的側(cè)翼序列正確。
全文摘要
一種黏性末端接頭應(yīng)用于側(cè)翼序列分離的方法，包括以下步驟1)提取待測基因組DNA；2)選擇同尾酶；設(shè)計并合成對應(yīng)的連接接頭；3)用同尾酶酶切基因組，形成具有相同的黏性末端的DNA片段；4)電泳檢測酶切質(zhì)量，并定量DNA片段濃度；將所述接頭與基因組酶切產(chǎn)物連接，形成“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段；5)純化“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段，PCR擴增；6)回收步驟3)獲得的片段并測序；7)分析測序結(jié)果，獲得已知序列的未知側(cè)翼序列；8)未知側(cè)翼序列的驗證。本發(fā)明之側(cè)翼序列分離的方法，連接效率高，通用性高，成本低。
文檔編號C12N15/10GK102634506SQ20121009739
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者余東, 劉瑞芬, 孫學武, 孫志忠, 段美娟, 袁光杰, 袁定陽, 袁貴龍, 袁隆平, 譚炎寧, 趙炳然 申請人:湖南雜交水稻研究中心