專利名稱：：一種重組豬偽狂犬病毒及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種重組病毒，尤其涉及一種重組豬偽狂犬病毒及其構建方法和應用
背景技術：
：細菌人工染色體(bacteriaartificialchromosome,Bac)是高通量低拷貝的質粒載體，最大可以容納300kb的DNA,并能穩(wěn)定傳代。Bac技術為皰疫病毒反向和正向遺傳研究提供了新方法(ShizuyaH,BirrenB,KimUJ,etal.Cloningandstablemaintenanceof300-Kilobase-pairfragmentsofhumanDNAinEscherichiacoliusinganF-factor-basedvector[J].ProcNatlAcadSciUSA,1992,89(18):8794-8797.)。目前該技術在多種皰疫病毒相繼成功應用，如I型單純皰疫病毒(StavropouLosTA,StrathdeeCA.Anenhancedpackagingsystemforhelper-dependentherpessimplexvirusvectors[J],JVirol,1998，72:7137-7143.)、EBV(DelecluseHJ,HilsendegenT,PichD,etal.Propagationandrecoveryofintact,infectiousEpstein-Barrvirusfromprokaryotictohumancells[J].ProcNatlAcadSciUSA,1995:8245-8250.)、人巨細胞病毒(HCMV)(WagnerM,RuzsicsZ,KoszinowskiUH.Herpesvirusgeneticshascomeofage[J]·TrendsMicrobiol,2002,10(7):318-324.)、BHV-1ZJ株(張存，葉偉成，王一成，等.牛I型皰疹病毒感染性細菌人工染色體的構建和gN基因缺失病毒的細胞繁殖特性[J].科學通報，2009，54(24)3823-3829.)等。TK基因缺失的豬偽狂犬病毒(PRV)ZJ株Bac也于2010年成功克隆(尹文玲，葉偉成，張存，等.豬偽狂犬病毒浙江株感染性細菌人工染色體克隆的構建[J].病毒學報，2010，26(4):331-335.)。PRV屬于皰疫病毒科α皰疫病毒亞科成員，大小約143kb,含有多個可缺失的非必需基因。PRV基因缺失疫苗的成功應用，使該病在世界范圍內得到了有效控制。目前以PRV-Bac系統(tǒng)為載體表達其它病原主要保護性抗原基因已成為基因工程活載體疫苗研究的熱點(OsterriederN,SchumacherD,TrappS.Establishmentanduseofinfectiousbacterialartificialchromosome(BAC)DNAclonesofanimalherpesviruses[J].BerlMunchTierarztlffochenschr,2003,116(9-10):373-380.)。迄今為止，以偽狂犬病毒為載體已成功表達了CSFVE2(潘茲書，張楚瑜，陳玉棟，等.表達豬瘟病毒E2基因和gfp報道基因的偽狂犬病病毒雙基因轉移載體的構建[J].武漢大學學報(理學版)，2002，48(4)466-470.),PPVVP2(呂建強，陳煥春，趙俊龍，等.表達豬細小病毒VP2基因的重組偽狂犬病毒的構建及其生物學特征研究[J].病毒學報，2004，20(2)134-137.)、PCV2Cap(琚春梅，陳煥春，郗鑫，等.表達豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因的重組偽狂犬病病毒的構建及鑒定[J].中國農業(yè)科學，2006，39(8):1716-1722.)和PRRSVGP5蛋白(方六榮，肖少波，江云波，等.表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP5的重組偽狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的構建及其生物學特性初步探討[J].病毒學報，2004，20(20):250-254.)。豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細小病毒(PPV)和PRV是豬的三種重要的傳染病，經(jīng)常存在混合感染，因此研制出這三種病毒的重組疫苗對生產(chǎn)實踐具有重要的意義。
發(fā)明內容本發(fā)明提供了一種重組豬偽狂犬病毒，該病毒可以共表達豬細小病毒VP2基因和豬圓環(huán)病毒Cap基因，可以對豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細小病毒(PPV)和PRV三種病毒產(chǎn)生免疫。一種重組豬偽狂犬病毒，該病毒含有由豬細小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和豬圓環(huán)病毒Cap基因依次連接構成的外源基因。Cap基因是PCV2的主要結構蛋白基因，編碼病毒的衣殼蛋白，可自裝配成病毒樣粒子，是目前PCV2疫苗研究的主要候選基因。VP2蛋白是構成PPV病毒粒子的主要結構蛋白，在體外表達后，不僅具有良好的免疫原性，還可以自我裝配成病毒樣顆粒，形態(tài)大小、血凝性與全病毒的相似，將其接種動物后可以誘導產(chǎn)生強烈的免疫應答反應，可以抵抗PPV強毒的攻擊，三個基因共表達蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。優(yōu)選的，該病毒包含Pcmv-V2C_BGH-pA表達框；其中V2C表示由豬細小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和豬圓環(huán)病毒Cap基因依次連接構成的外源基因；Pcmv表示啟動子CMV;BGH-pA表示人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾。所述的外源基因替換了該病毒的gE基因。優(yōu)選的，該病毒的TK基因部分缺失，，缺失位置為第387694個堿基，可以降低病毒毒性。所述的豬細小病毒VP2基因堿基序列如SEQIDNO.I所示。所述的口蹄疫病毒2A基因堿基序列如SEQIDNO.2所示。所述的豬圓環(huán)病毒Cap基因堿基序列如SEQIDNO.3所示。本發(fā)明還提供了一種重組豬偽狂犬病毒的構建方法，包括(I)將PHA2質粒插入到原始豬偽狂犬病毒的TK基因內，獲得rPRV；(2)將rPRV基因組轉化大腸桿菌DHlOB菌株，獲得pPRV；其中pPRV為感染性細菌人工染色體，包含PRV的全基因組，記為質粒pPRV，一般情況下，r起始表示重組病毒，P起始表示質粒。(3)將pPRV的標記基因GFP的CMV啟動子更換為EFl啟動子，獲得pPRV_EFl；(4)將Pcmv-V2C-BGH-pA表達框替換pPRV-EFl的gE基因，獲得pPRV_V2C_ΔgE；其中V2C表示由豬細小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和豬圓環(huán)病毒Cap基因依次連接構成的外源基因；Pcmv表示啟動子CMV;BGH-pA人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾；(5)pPRV-V2C-ΛgE與pCAGGS_NLS/Cre兩種質粒共轉染Vero細胞系，篩選獲得刪除pHA2質粒的rPRV-V2C-ΔgE。本發(fā)明還提供了所述的重組豬偽狂犬病毒在制備動物疫苗中的應用。本發(fā)明通過缺失gE基因及TK基因部分序列對偽狂犬病病毒起到了減毒的作用，能通過檢測gE或者TK蛋白抗體區(qū)分免疫動物和自然感染動物(鑒別診斷)，能同時免疫保護豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒等引起的三種疾病。圖I為pPRV-V2C-ΔgE、pPRV-V2C_Kan-ΔgE、pPRV-ΔgE、pPRV-EFl，pPRV質粒限制性核酸酶切電泳圖MarkerDL15000；IKbladder；AIpPRV-V2C-Kan-AgE；2pPRV-ΔgE；3pPRV-EFl；4,5pPRV-V2C-ΛgE為BamHI單酶切結果；BIpPRV-V2C-AgE；2pPRV-AgE；3:pPRV_EFl；4pPRV為BamHI單酶切結果；C重組PRV-BacPCR鑒定Marker250bp;I:以pPRV_V2C_ΔgE為模板PCR擴增獲得4135bp的片段；2:以pPRV-AgE為模板PCR擴增獲得617bp的片段；3:以pPRV-EFl為模板PCR擴增獲得2351bp的片段(以上所用引物均為PRV-dgE-seq-s和PRV-dgE-seq-as)；圖2為PRV重組病毒噬斑圖譜；a.rPRV-Bac-EFl病毒嗤斑；b.rPRV-Bac-EFl病毒突光嗤斑；c.rPRV-Bac病毒噬斑；d.rPRV-Bac病毒熒光噬斑；e.rPRV-ΛgE病毒噬斑；f.rPRV-ΛgE病毒熒光噬斑；g.rPRV-V2C-ΔgE病毒噬斑；h.rPRV_V2C_ΔgE病毒熒光噬斑；圖3為四種不同重組PRV病毒在BHK-21細胞上的噬斑面積柱狀圖；圖4為圖4rPRV-V2C-ΔgE、rPRV-ΔgE、rPRV-Bac、rPRV-Bac-EFl在BHK-21細胞上的生長曲線,其中(a)細胞外；(b)細胞內；圖5為PRV-Bac-EFl浙江株表達PPVVP2蛋白(a)和PCV2Cap蛋白(b)westernblotting分析圖；M.Proteinmarker；a1,2.rPRV_V2C_ΔgE病毒感染的BHK-21細胞裂解液；3.rPRV-ΔgE病毒感染的BHK-21細胞裂解液；bLrPRV-AgE病毒感染的BHK-21細胞裂解液；2.rPRV-V2C_AgE病毒感染的BHK-21細胞裂解液。具體實施例方式I、引物設計與合成PPV、PCV2和PRV引物分別參考序列GeneBank(NC_014665.I)、GenBank(HQ591381.I)和GenBank(NC_006151)設計，由生工公司合成，序列見上表。引物a、b用于構建pPRV-V2C-AgE突變體，斜體序列與PRVgE上下游序列同源，下劃線序列與pEP-CMV-in的Pcmv啟動子上游和BGH-pA下游同源；引物c、d用于缺失PRVgE基因(US8)，上游引物下劃線部分與pEPKanS質粒模板結合的序列；粗體序列與PRVUS8CDS起始密碼子上游同源，斜體序列與US8下游同源，下游引物粗體序列與PRVUS8CDS下游同源，斜體序列和US8起始密碼子上游同源，下劃線部分為與PEPKanS質粒模板結合的序列；引物e、f用于pPRV-BacZJ株的Pcmv啟動子更換,下劃線部分與pEP_EFl質粒序列同源，斜體序列和PRVUL27序列上下游同源；引物g、h用于Bac突變體測序驗證，弓丨物分別與PRVUS8上游-159bp和下游458bp序列同源，其PCR擴增產(chǎn)物可以根據(jù)大小、測序來驗證US8的缺失、插入，產(chǎn)物大小如下2351bp(pPRV-Bac-EFl)，617bp(pPRV-AgE)，4135bp(pPRV-V2C-ΔgE)。表I權利要求1.一種重組豬偽狂犬病毒，其特征在于，該病毒含有由豬細小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和豬圓環(huán)病毒Cap基因依次連接構成的外源基因。2.根據(jù)權利要求I所述的重組豬偽狂犬病毒，其特征在于，該病毒包含Pcmv-V2C-BGH-pA表達框；其中V2C表示由豬細小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和豬圓環(huán)病毒Cap基因依次連接構成的外源基因；Pcmv表示啟動子CMV;BGH-pA表示人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾。3.根據(jù)權利要求I或2所述的重組豬偽狂犬病毒，其特征在于，該病毒的gE基因被所述外源基因替換。4.根據(jù)權利要求I或2所述的重組豬偽狂犬病毒，其特征在于，該病毒的TK基因部分缺失。5.根據(jù)權利要求I所述的重組豬偽狂犬病毒，其特征在于，所述的豬細小病毒VP2基因堿基序列如SEQIDNO.I所示。6.根據(jù)權利要求I所述的重組豬偽狂犬病毒，其特征在于，所述的口蹄疫病毒2A基因堿基序列如SEQIDNO.2所示。7.根據(jù)權利要求I所述的重組豬偽狂犬病毒，其特征在于，所述的豬圓環(huán)病毒Cap基因堿基序列如SEQIDNO.3所示。8.—種重組豬偽狂犬病毒的構建方法，包括(1)將pHA2質粒插入到原始豬偽狂犬病毒的TK基因內，獲得rPRV；(2)將rPRV基因組轉化大腸桿菌(E.coli)DHlOB菌株，獲得pPRV；(3)將pPRV的標記基因GFP的CMV啟動子更換為EFl啟動子，獲得pPRV_EFl；(4)將Pcmv-V2C-BGH-pA表達框替換pPRV-EFl的gE基因，獲得pPRV_V2C_ΔgE；其中V2C表示由豬細小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和豬圓環(huán)病毒Cap基因依次連接構成的外源基因；Pcmv表示啟動子CMV;BGH-pA人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾；(5)pPRV-V2C-AgE與pCAGGS_NLS/Cre兩種質粒共轉染Vero細胞系，篩選獲得刪除pHA2質粒的rPRV-V2C-ΔgE。9.根據(jù)權利要求I7任一所述的重組豬偽狂犬病毒在制備動物疫苗中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組豬偽狂犬病毒及其構建方法和應用，該病毒含有由豬細小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和豬圓環(huán)病毒Cap基因依次連接構成的外源基因。該方法包括(1)構建包含PRV全基因組的細菌人工染色體pPRV；(2)將pPRV中的CMV啟動子替換為EF1啟動子；(3)將Pcmv-V2C-BGH-pA表達框替換pPRV-EF1的gE基因，獲得pPRV-V2C-ΔgE；(4)pPRV-V2C-ΔgE與pCAGGS-NLS/Cre兩種質粒共轉染Vero細胞系，篩選獲得刪除pHA2質粒的rPRV-V2C-ΔgE。本發(fā)明重組病毒同時能免疫豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒等引起的三種疾病。文檔編號C12N15/63GK102618508SQ20121010078公開日2012年8月1日申請日期2012年4月9日優(yōu)先權日2012年4月9日發(fā)明者云濤,余斌,倪征,華炯鋼,葉偉成,崔尚金,張存,張燕,陳柳申請人:浙江省農業(yè)科學院