專利名稱：一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒及其制作方法。
背景技術(shù)：
微小核糖核酸,英文名為microRNA,簡(jiǎn)寫作miRNA,是一類長(zhǎng)約19至23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子，它們?cè)谶M(jìn)化上高度保守，廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中，近五年來在人類、小鼠、大鼠等多種生物物種中鑒別出數(shù)百種微小核糖核酸分子。微小核糖核酸通過識(shí)別靶mRNA的3 ’端非翻譯序列，與之不完全互補(bǔ)，從而抑制靶mRNA的翻譯。其序列、結(jié)構(gòu)、豐度和表達(dá)方式的多樣性使微小核糖核酸成為信使RNA強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)因子并在基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域中起著超乎想象的重要作用。微小核糖核酸與動(dòng)物的許多正常生理活動(dòng)密切相關(guān)，涉及生物個(gè)體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞調(diào)亡以及能量代謝等生命活動(dòng)的方方面面。同時(shí)，微小核糖核酸也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在千絲萬縷的聯(lián)系，在發(fā)生某種疾病時(shí)總有一些微小核糖核酸表達(dá)量是上調(diào)的，一些是下調(diào)的。微小核糖核酸與疾病的關(guān)聯(lián)有兩個(gè)層面首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因?yàn)榧膊〉囊种埔蜃右约按龠M(jìn)因子都有可能是微小核糖核酸的靶位點(diǎn)，當(dāng)微小核糖核酸本身先發(fā)生了紊亂表達(dá)，比如本來抑制疾病促進(jìn)因子的微小核糖核酸表達(dá)量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表達(dá)量升高了，其最終結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致下游一系列基因表達(dá)的變化以及某些通路的整體紊亂，進(jìn)而誘發(fā)疾病發(fā)生；其次，微小核糖核酸的變化也可以是疾病的結(jié)果，這是因?yàn)楫?dāng)疾病(如癌癥)發(fā)生時(shí)，會(huì)導(dǎo)致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇烈擴(kuò)增，若微小核糖核酸正好位于這一變化區(qū)段內(nèi)，那么其表達(dá)量將發(fā)生極其顯著的變化。最近研究發(fā)現(xiàn)慢性淋巴細(xì)胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中幾種微小核糖核酸的表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)；分析比較人肺癌、乳腺癌組織中微小核糖核酸表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)有若干組織特定的微小核糖核酸的表達(dá)水平相對(duì)于正常組織發(fā)生了變化。也有研究證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展并且與二型糖尿病等代謝性疾病有密切關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果提示微小核糖核酸表達(dá)與疾病發(fā)生和發(fā)展之間存在必然聯(lián)系。微小核糖核酸完全可以作為一類新的疾病標(biāo)志物，相比于傳統(tǒng)的病理切片或單一使用的生化指標(biāo)等手段，能更加準(zhǔn)確幫助疾病定性，診斷疾病的發(fā)展階段，判斷并發(fā)癥的發(fā)生和惡性疾病復(fù)發(fā)率及疾病的預(yù)后,并判斷藥效和療效。此外,微小核糖核酸還是潛在的藥物靶點(diǎn)，如果抑制疾病過程中上調(diào)的微小核糖核酸和過表達(dá)下調(diào)的微小核糖核酸，將有可能極大地緩解疾病的發(fā)生和發(fā)展。然而，因?yàn)槿撕蛣?dòng)物微小核糖核酸的研究工作才開展4年左右，目前還沒有相關(guān)的微小核糖核酸試劑盒。因此，需要我們更深入研究腫瘤，各種急慢性傳染病和急慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，心血管系統(tǒng)疾病， 內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等)過程中微小核糖核酸的特異變化，對(duì)微小核糖核酸的進(jìn)一步探索將為我們提供疾病診療新途徑。微小核糖核酸試劑盒的研發(fā)和在臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用將產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是通過研究各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，艾滋病等)和急慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，心血管系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等)過程中血清微小核糖核酸的特異變化，得到在疾病及正常生理狀態(tài)下差異表達(dá)程度大的一類血清微小核糖核酸探針，應(yīng)用于疾病和病程輔助鑒定，惡性疾病復(fù)發(fā)率及預(yù)后和藥效判斷相關(guān)的試劑盒和生物芯片，以提高疾病的早期發(fā)現(xiàn)率以及確診的準(zhǔn)確性和療效。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的一種技術(shù)方案為血清中微小核糖核酸分子的檢測(cè)方法I)收集血清樣本；2)將10 μ I血清作為buffer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，來制備cDNA樣品；3)用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；4)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；5) EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。所述步驟5)之后還包括下列步驟用熒光染料EVA GREEN檢測(cè)并比較血清樣本相對(duì)于正常血清中微小核糖核酸的量的變化。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的另一種技術(shù)方案為血清中微小核糖核酸分子的檢測(cè)方法I、使用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取血清總RNA(10ml血清通常能富集約 10 μ g左右的RNA)；2、通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA ；3、用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；4、進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；5、EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。所述步驟5之后還包括下列步驟用熒光染料EVA GREEN檢測(cè)并比較血清樣本相對(duì)于正常血清中微小核糖核酸的量的變化。在上述檢測(cè)方法中，我們首次使用了 RT-PCR技術(shù)來發(fā)現(xiàn)并證明人和動(dòng)物血清中能檢測(cè)到各種微小核糖核酸，而且它們具有不同的組織來源和表達(dá)豐度。其次，為了研究在各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，艾滋病等)和急慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，心血管系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等)過程中血清微小核糖核酸的特異變化，我們選取再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、糖尿病病人血清樣品，同時(shí)用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物進(jìn)行了血清微小核糖核酸的定量PCR實(shí)驗(yàn)，以得到與疾病相關(guān)的差異表達(dá)的一類血清微小核糖核酸探針。我們直接用病人血清進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)，用熒光染料EVA GREEN檢測(cè)并比較相對(duì)于正常血清各種疾病血清中微小核糖核酸的量的變化。一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的生物芯片，包括人血清中能正常檢測(cè)到的全部微小核糖核酸的探針。此芯片能高通量地篩選血清中穩(wěn)定變化的微小核糖核酸探針，同時(shí)通過血清中微小核糖核酸的整體變化預(yù)測(cè)和診斷疾病。最后我們通過定量PCR技術(shù)和生物芯片技術(shù)篩選得到和再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、糖尿病等疾病相關(guān)的血清微小核糖核酸，作為輔助預(yù)測(cè)疾病以及診斷病變程度的探針，來制備PCR試劑盒。一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒，通過如下方法制備得到I.通過測(cè)序的方法或定量PCR方法確定正常人血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸；II.通過定量PCR方法和生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預(yù)測(cè)是否發(fā)生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針；III.將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內(nèi)的試劑，制備成用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒。其中步驟I和步驟II中所述的定量PCR方法為①收集人血清樣本，②將10 μ I血清作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，來制備cDNA 樣品，③用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物，向PCR體系中加入熒光染料 EVAGREEN,利用ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)；或者①使用Trizol試劑提取人血清總RNA，②通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，③ 用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物，向PCR體系中加入熒光染料EVA GREEN, 利用ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。其中，步驟②中所述的逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4μ I 15XAMV buffer、2y I IOmM 每種dNTP mixture、0. 5 μ I Rnase Inhibitor、〗μ I AMV以及I. 5 μ I基因特異性反向引物混合物，反應(yīng)步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)I小時(shí)，85°C孵育5分鐘。步驟③所述的利用ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為95°C 5分鐘進(jìn)行I個(gè)循環(huán)一95°C 15秒，60°C I分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。步驟II所述的通過生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸的方法如下I)合成步驟I確定的在正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補(bǔ)探針；2)把步驟I確定的在正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補(bǔ)探針用芯片點(diǎn)樣儀SmartArray 點(diǎn)制在一張75X 25mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上制得生物芯片，點(diǎn)制在芯片上的樣品還包括作為內(nèi)標(biāo)的U6、tRNA，人工制備的30個(gè)堿基長(zhǎng)度的外標(biāo)，陽性對(duì)照Hex ；3)提取正常人和病人血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量；
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4)微小核糖核酸的分離取 50 100 μ g 總 RNA 用 Ambion’ s miRMA Isolation Kit分離微小核糖核酸；5)微小核糖核酸樣品的熒光標(biāo)記利用T4RNA連接酶標(biāo)記方法進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后再用無水乙醇沉淀，吹干后用于芯片雜交；6)雜交與清洗將RNA溶于配方為15 %甲酰胺；O. 2 % SDS ；3XSSC ； 50XDenhardt’s solution的16 μ I雜交液中，于42°C雜交過夜，雜交結(jié)束后，先在42°C含 0. 2% SDS, 2X SSC的液體中洗4分鐘，而后在0. 2X SSC液體中室溫洗4分鐘，玻片甩干后即可用于掃描；7)芯片掃描芯片用LuxScan 10K/A雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描；8)數(shù)據(jù)提取及分析采用LuxScan 3. O圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，最后用SAM分析挑選差異表達(dá)基因。一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒的制作方法，包含如下步驟I.通過測(cè)序的方法或定量PCR方法確定正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸；II.通過生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預(yù)測(cè)是否發(fā)生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針；III.將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內(nèi)的試劑，制備成用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒。其中，步驟I所述的定量PCR方法為①收集人血清樣本，②將10 μ I血清作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，來制備cDNA樣品，③用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物，向PCR體系中加入熒光染料EVA GREEN,利用ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)；或者①使用Trizol試劑提取人血清總RNA，②通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，③ 用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物，向PCR體系中加入熒光染料EVA GREEN, 利用ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。步驟②中所述的逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4 μ I 15 XAMV buffer>2 μ I IOmM每種 dNTP mixture、0. 5 μ I Rnase Inhibitor>2 μ I AMV 以及 I. 5μ I 基因特異性反向引物混合物，反應(yīng)步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)I小時(shí)，85°C孵育5分鐘。步驟③所述的利用ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為95°C 5分鐘進(jìn)行I個(gè)循環(huán)一95°C 15秒，60°C I分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。步驟II所述的通過生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸的方法如下I)合成步驟I確定的在正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補(bǔ)探針；2)把步驟I確定的在正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補(bǔ)探針用芯片點(diǎn)樣儀SmartArray 點(diǎn)制在一張75X 25mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上制得生物芯片，點(diǎn)制在芯片上的樣品還包括作為內(nèi)標(biāo)的U6、tRNA，人工制備的30個(gè)堿基長(zhǎng)度的外標(biāo)，陽性對(duì)照Hex ；3)提取正常人和病人血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量；
4)微小核糖核酸的分離取 50 100 μ g 總 RNA 用 Ambion’ s miRMA Isolation Kit分離微小核糖核酸；5)微小核糖核酸樣品的熒光標(biāo)記利用T4RNA連接酶標(biāo)記方法進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后再用無水乙醇沉淀，吹干后用于芯片雜交；6)雜交與清洗將RNA溶于配方為15 %甲酰胺；O. 2 % SDS ；3XSSC ； 50XDenhardt’s solution的16 μ I雜交液中，于42°C雜交過夜，雜交結(jié)束后，先在42°C含 0. 2% SDS, 2X SSC的液體中洗4分鐘，而后在0. 2X SSC液體中室溫洗4分鐘，玻片甩干后即可用于掃描；7)芯片掃描芯片用LuxScan 10K/A雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描；8)數(shù)據(jù)提取及分析采用LuxScan 3. O圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，最后用SAM分析挑選差異表達(dá)基因。目前對(duì)疾病進(jìn)行臨床診斷的生物化學(xué)及分子生物學(xué)手段還比較繁瑣和粗糙，比如對(duì)于癌癥的診斷，需要將手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)染色檢驗(yàn)，過程復(fù)雜又耗時(shí)耗力。此外， 目前尚沒有一套早期預(yù)測(cè)及診斷重癥疾病的簡(jiǎn)易又精確的方法。鑒于目前疾病診斷方法的單一以及早期發(fā)現(xiàn)與預(yù)測(cè)的困難，我們亟待找到一種比目前現(xiàn)有方法都更簡(jiǎn)單可靠同時(shí)又簡(jiǎn)單易行的新方法來鑒定疾病的發(fā)生以及判斷病理階段。我們選取血清中的微小核糖核酸作為研究對(duì)象，希望通過檢測(cè)血清中的微小核糖核酸解決臨床早期診斷等問題。檢測(cè)血清中的微小核糖核酸有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)首先，血清相對(duì)組織較易獲得，甚至在平常體檢中都可以收集到；其次，血清中的微小核糖核酸反映的是整個(gè)機(jī)體的生理病理情況，其檢測(cè)結(jié)果具有指導(dǎo)意義；第三，血清中某些特定的微小核糖核酸可以指示特定的組織器官的病變，因此其又可以作為疾病診斷的一個(gè)參數(shù)?？傊?，檢測(cè)血清中的微小核糖核酸，簡(jiǎn)單易行且效果優(yōu)越，從血清中的微小核糖核酸的特異性變化這一新角度出發(fā)發(fā)現(xiàn)疾病并且區(qū)分程度，將建立一種更敏感更精確的用于疾病早期確診等的全新技術(shù)。本發(fā)明與原有技術(shù)相比，其優(yōu)勢(shì)在于一、簡(jiǎn)單易行，成本低廉。二、特別適用于輔助早期診斷。三、輸出的結(jié)果簡(jiǎn)單明了且精確。


圖I正常人血清中直接檢測(cè)到的部分微小核糖核酸RT-PCR結(jié)果。圖2提取正常人血清中RNA，檢測(cè)其中微小核糖核酸的RT-PCR結(jié)果。圖3病人血清中部分微小核糖核酸相對(duì)于正常人血清中微小核糖核酸的變化量。
具體實(shí)施例方式I、血清中的微小核糖核酸的RT-PCR實(shí)驗(yàn)我們使用了 RT-PCR技術(shù)次發(fā)現(xiàn)并證明人和動(dòng)物血清中不僅能檢測(cè)到各種微小核糖核酸，而且其表達(dá)量相當(dāng)豐富。具體步驟為(1)收集小鼠，大鼠，正常人及某些病人的血清。⑵制備cDNA樣品。此操作有兩種方案，一種方案為將10 μ I血清作為buffer直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，另一種為使用Trizol試劑(Invitrogen公司)先提取血清總RNA(10ml血清通常能富集約10 μ g左右的RNA)，然后通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括 4μ1 5 X AMV buffer>2 μ I IOmM each dNTP mixture (Takara 公司)、0· 5 μ I RNaseInhibitor (Takara公司)、2μ I AMV (Takara公司)以及I. 5 μ I基因特異性反向引物混和物，反應(yīng)步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)I小時(shí)，85°C孵育5分鐘。(3)PCR及電泳觀察。 將cDNA按1/50稀釋，取1μ I稀釋后的cDNA，加入O. 3μ I Taq酶(Takara公司)，0· 2μ I ΙΟμΜ 正向引物，O. 2μ I ΙΟμΜ通用反向引物，L 2μ I 25mM MgCl2,1. 6μ I 2. 5mM each dNTP mixture (Takara 公司)，2 μ I 10XPCR buffer, 13. 5 μ IH2O, 20 μ I 體系進(jìn)行 PCR。PCR 的反應(yīng)條件是95°C 5分鐘進(jìn)行I個(gè)循環(huán)一950C 15秒，60°C I分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物取10 μ I進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在紫外燈下觀察。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖。圖I是以正常人血清為研究對(duì)象，將血清作為buffer直接進(jìn)行RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們選用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸進(jìn)行PCR反應(yīng)， 圖I為其中的12種微小核糖核酸。它們分別是血細(xì)胞特異性的微小核糖核酸miR-181a、 miR-181b、miR-223、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-150，來自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸 miR-1、miR-133a、miR-206，來自腦組織的微小核糖核酸miR_9、miR-124a,以及來自肝臟的微小核糖核酸miR_122a。從結(jié)果可以看出上述四種組織來源的微小核糖核酸在血液中都能檢測(cè)到。但是并非全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸在血清中都有高豐度表達(dá)，有些微小核糖核酸是很微量的，甚至不能正常檢測(cè)到。為了進(jìn)一步驗(yàn)證血清中存在微小核糖核酸，我們先提取正常人血清中的RNA，然后選用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。圖2的結(jié)果與圖I的結(jié)果很吻合，PCR產(chǎn)物都單一，表明這兩種實(shí)驗(yàn)方法都能檢測(cè)到人血清微小核糖核酸的表達(dá)和豐度。此外，我們用同樣的方法檢測(cè)了小鼠和大鼠血清中五百多個(gè)微小核糖核酸的表達(dá)和豐度，同樣發(fā)現(xiàn)不同組織來源的微小核糖核酸在小、大鼠血清中有表達(dá)。2、血清中微小核糖核酸的real-time PCR實(shí)驗(yàn)為了研究各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，艾滋病等)和急慢性疾病 (如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，心血管系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等)過程中血清微小核糖核酸的特異變化，我們進(jìn)行了血清微小核糖核酸的定量PCR實(shí)驗(yàn)。定量PCR實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)步驟同RT-PCR —樣，唯一不同是在PCR的時(shí)候加入了熒光染料EVA GREEN。儀器使用的是ABI Prism7300熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為95°C 5分鐘進(jìn)行I個(gè)循環(huán)一95°C 15 秒，60°C I分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)處理方法為Λ Λ Ct法，Ct設(shè)為反應(yīng)達(dá)到域值時(shí)的循環(huán)數(shù)，則每個(gè)微小核糖核酸相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參的表達(dá)量可以用方程2_"CT表示，其中ACt = Ct# .-Ct #。我們將病人血清樣本與正常人血清樣本直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，通過定量PCR反應(yīng)比較其中所含微小核糖核酸的量。我們選取再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、糖尿病病人血清樣品，同時(shí)用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。圖3僅是上述提及的四種組織來源的12種微小核糖核酸在正常人和病人血清中進(jìn)行定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。再生障礙性貧血、乳腺癌、骨肉瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、糖尿病病人血清中微小核糖核酸的量相對(duì)于正常人的量的比值分別有上調(diào)和下調(diào)，表明血清微小核糖核酸可以作為一類新的疾病診療預(yù)測(cè)的標(biāo)志物。此外，從圖3可知，在一種疾病中不同微小核糖核酸在血清中表達(dá)水平不同，提示可能是不同疾病過程中，對(duì)不同組織來源的微小核糖核酸，血細(xì)胞免疫應(yīng)答不同或細(xì)胞破裂或分泌微小核糖核酸途徑不同造成的。3、用于診斷疾病的血清微小核糖核酸芯片的制作
為了驗(yàn)證通過定量PCR篩選出的與疾病相關(guān)的一類血清微小核糖核酸探針準(zhǔn)確可靠性，我們制作了血清微小核糖核酸的生物芯片，該芯片包含了人血清中能正常檢測(cè)到的全部微小核糖核酸的探針。此外,芯片能高通量地篩選血清中穩(wěn)定變化的微小核糖核酸探針，同時(shí)通過血清中微小核糖核酸的整體變化預(yù)測(cè)和診斷疾病。我們首先通過測(cè)序的方法或定量PCR方法確定血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸，然后合成這些微小核糖核酸的的反向互補(bǔ)探針，再把這些探針用芯片點(diǎn)樣儀SmartArray 點(diǎn)制在一張75X25mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上。點(diǎn)制在芯片上的樣品還包括作為內(nèi)標(biāo)的U6、tRNA，人工制備的30 個(gè)堿基長(zhǎng)度的外標(biāo)，陽性對(duì)照Hex等。整個(gè)點(diǎn)陣分成4個(gè)亞陣，每個(gè)亞陣有23行，21列，點(diǎn)間距為185 μ m，點(diǎn)的直徑約為130 μ m，每條探針重復(fù)三次。芯片操作流程為(I)提取血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量；⑵微小核糖核酸的分離取50-100 μ g總 RNA 用 Ambion，s miRNA Isolation Kit (Cat #· 1560)分離微小核糖核酸；(3)微小核糖核酸樣品的熒光標(biāo)記利用T4 RNA連接酶標(biāo)記方法進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后再用無水乙醇沉淀， 吹干后用于芯片雜交；⑷雜交與清洗將RNA溶于16 μ L雜交液中(15%甲酰胺；0. 2% SDS ;3 XSSC ;50 XDenhardt’ s solution)，于 42°C雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在 42°C左右含0. 2% SDS, 2 X SSC的液體中洗4分鐘，而后在0. 2 X SSC液體中室溫洗4分鐘，玻片甩干后即可用于掃描；(5)芯片掃描芯片用LuxScanlOK/A雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描；(6)數(shù)據(jù)提取及分析采用LuxScan3. O圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，最后用SAM分析挑選差異表達(dá)基因。將定量PCR技術(shù)和生物芯片技術(shù)雙重驗(yàn)證的在疾病及正常生理狀態(tài)下差異表達(dá)程度大的一類血清微小核糖核酸探針，用于制備生物芯片，方法同上。此芯片與傳統(tǒng)芯片相比，制作工藝和操作流程沒有很大改進(jìn)，但是此芯片簡(jiǎn)化了探針庫，由此將大大減少芯片的制作成本和生產(chǎn)時(shí)間，易于制備。同時(shí)也增加了芯片的疾病針對(duì)性和實(shí)用性。將此芯片投入實(shí)踐，僅僅需要病人的血清而不需要任何其它組織就可以在早期發(fā)現(xiàn)疾病，幫助指導(dǎo)診斷和治療。4、專門用于疾病診斷與預(yù)測(cè)的微小核糖核酸試劑盒的制作用于診斷預(yù)測(cè)各種腫瘤，各種急慢性傳染病(如病毒性肝炎，艾滋病等)和急慢性疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，心血管系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等)的微小核糖核酸試劑盒的制作工藝和操作流程是基于定量PCR技術(shù)和生物芯片技術(shù)。我們首先通過測(cè)序的方法或PCR方法確定正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸。然后通過定量PCR 技術(shù)和生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預(yù)測(cè)是否發(fā)生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針。此試劑盒包括一批血清微小核糖核酸探針,Taq酶、dNTP等試劑。此試劑盒價(jià)值在于只需要血清而不需要其它組織樣品，通過最精簡(jiǎn)的探針庫檢測(cè)微小核糖核酸的變化趨勢(shì)，再通過該變化趨勢(shì)預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生可能或診斷疾病的病理階段。因此將此試劑盒投入實(shí)踐，特別對(duì)于不能活檢組織的疾病如胰腺癌等，可以增加在早期發(fā)現(xiàn)病變的可能，幫助指導(dǎo)診斷和治療。
權(quán)利要求
1. 一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒，其特征在于通過如下方法制備得到1.通過測(cè)序的方法或定量PCR方法確定正常人血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸；II.通過定量PCR方法和生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預(yù)測(cè)是否發(fā)生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針；III.將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內(nèi)的試劑， 制備成用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒，其特征在于步驟I和步驟II中所述的定量PCR方法為①收集人血清樣本，②將 ο μ I血清作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，來制備CDNA樣品，③ 用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物，向PCR體系中加入熒光染料EVAGREEN， 利用ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)；或者①使用Trizol試劑提取人血清總RNA，②通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，③用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物，向PCR體系中加入熒光染料EVA GREEN，利用 ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒，其特征在于步驟②中所述的逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4μ I 15XAMV buffer、2y I IOmM每種dNTP mixture、0. 5 μ I Rnase Inhibitor、2 μ I AMV以及I. 5 μ I基因特異性反向引物混合物，反應(yīng)步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)I小時(shí)，85°C孵育5分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒，其特征在于步驟③所述的利用ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為95°C 5分鐘進(jìn)行I個(gè)循環(huán)一950C 15秒，60°C I分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒，其特征在于步驟II所述的通過生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸的方法如下1)合成步驟I確定的在正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補(bǔ)探針；2)把步驟I確定的在正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補(bǔ)探針用芯片點(diǎn)樣儀SmartArray 點(diǎn)制在一張75X25mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上制得生物芯片， 點(diǎn)制在芯片上的樣品還包括作為內(nèi)標(biāo)的U6、tRNA，人工制備的30個(gè)堿基長(zhǎng)度的外標(biāo)，陽性對(duì)照Hex ；3)提取正常人和病人血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量；4)微小核糖核酸的分離取50 100μ g總RNA用Ambion’ s miRMA Isolation Kit 分離微小核糖核酸；5)微小核糖核酸樣品的熒光標(biāo)記利用T4RNA連接酶標(biāo)記方法進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后再用無水乙醇沉淀，吹干后用于芯片雜交；6)雜交與清洗將RNA溶于配方為15%甲酰胺；0.2% SDS ；3XSSC ；50XDenhardtJ s solution的16 μ I雜交液中，于42°C雜交過夜，雜交結(jié)束后，先在42°C含0. 2% SDS, 2 X SSC 的液體中洗4分鐘，而后在0. 2 X SSC液體中室溫洗4分鐘，玻片甩干后即可用于掃描；7)芯片掃描芯片用LuxScan10K/A雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描；8)數(shù)據(jù)提取及分析采用LuxScan3. O圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，最后用SAM分析挑選差異表達(dá)基因。
6.一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒的制作方法，其特征在于包含如下步驟I.通過測(cè)序的方法或定量PCR方法確定正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸;II.通過生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預(yù)測(cè)是否發(fā)生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針；III.將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內(nèi)的試劑， 制備成用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒的制作方法，其特征在于步驟I所述的定量PCR方法為①收集人血清樣本，②將 ο μ I血清作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，來制備CDNA樣品，③ 用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物，向PCR體系中加入熒光染料EVA GREEN, 利用ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)；或者①使用Trizol試劑提取人血清總RNA，②通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，③用人全部五百多個(gè)成熟體微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物，向PCR體系中加入熒光染料EVA GREEN，利用 ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒的制作方法，其特征在于步驟②中所述的逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4 μ I 15 XAMV buffer>2 μ I IOmM每種 dNTP mixture、0. 5 μ I Rnase Inhibitor>2 μ I AMV 以及 I. 5μ I 基因特異性反向引物混合物，反應(yīng)步驟為16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)I小時(shí)，85°C孵育5分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒的制作方法，其特征在于步驟③所述的利用ABI Prism7300熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為95°C 5分鐘進(jìn)行I個(gè)循環(huán)一95°C 15秒，60°C I分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒的制作方法， 其特征在于步驟II所述的通過生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸的方法如下1)合成步驟I確定的在正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補(bǔ)探針；2)把步驟I確定的在正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸的反向互補(bǔ)探針用芯片點(diǎn)樣儀SmartArray 點(diǎn)制在一張75X25mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上制得生物芯片， 點(diǎn)制在芯片上的樣品還包括作為內(nèi)標(biāo)的U6、tRNA，人工制備的30個(gè)堿基長(zhǎng)度的外標(biāo)，陽性對(duì)照Hex ；3)提取正常人和病人血清中總RNA，甲醛變性膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量；4)微小核糖核酸的分離取50 100μ g總RNA用Ambion’ s miRMA Isolation Kit 分離微小核糖核酸；5)微小核糖核酸樣品的熒光標(biāo)記利用T4RNA連接酶標(biāo)記方法進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后再用無水乙醇沉淀，吹干后用于芯片雜交；6)雜交與清洗將RNA溶于配方為15%甲酰胺；0.2% SDS ；3XSSC ；50XDenhardtJ ssolution的16μ I雜交液中，于42°C雜交過夜，雜交結(jié)束后，先在42°C含O. 2% SDS, 2X SSC 的液體中洗4分鐘，而后在O. 2 X SSC液體中室溫洗4分鐘，玻片甩干后即可用于掃描；7)芯片掃描芯片用LuxScan10K/A雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描；8)數(shù)據(jù)提取及分析采用LuxScan3. O圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，最后用SAM分析挑選差異表達(dá)基因。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒及其制作方法。本發(fā)明所述的試劑盒通過如下方法制備得到I.通過測(cè)序的方法或定量PCR方法確定正常血清中有一個(gè)以上拷貝的微小核糖核酸；II.通過生物芯片技術(shù)篩選在疾病及正常生理狀態(tài)下表達(dá)量和差異程度大的一類血清微小核糖核酸，作為預(yù)測(cè)是否發(fā)生癌變或其它疾病以及診斷病變程度的探針；III.將步驟II中得到的一類血清微小核糖核酸探針和包括Taq酶、dNTP在內(nèi)的試劑，制備成用于血清中微小核糖核酸檢測(cè)的試劑盒。此試劑盒投入實(shí)踐，特別對(duì)于不能活檢組織的疾病，可以增加在早期發(fā)現(xiàn)病變的可能，幫助指導(dǎo)診斷和治療，把疾病的確診和治療推上一個(gè)新高度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102605094SQ20121010418
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者巴一, 張峻峰, 張燕, 張紅杰, 張辰宇, 曾柯, 殷媛, 王可慧, 王進(jìn), 蔡星, 郭繼剛, 陳江寧, 陳熹 申請(qǐng)人:江蘇命碼生物科技有限公司