專利名稱：一種ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶蛋白技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH。
背景技術(shù)：
生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)經(jīng)常因?yàn)楦鞣N形式的損傷從而喪失功能，修復(fù)/清除受損蛋白是蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的一種形式。分子伴侶能夠輔助受損蛋白重新折疊，一些酶促修復(fù)過程也能逆轉(zhuǎn)某些蛋白的損傷，不能修復(fù)的蛋白則被蛋白水解系統(tǒng)降解從而徹底清除。AAA蛋白酶(ATPases Associated with a variety of cellular Activities)同時(shí)具有蛋白酶和分子伴侶活性，能介導(dǎo)細(xì)菌、線粒體中膜蛋白的降解和修復(fù)，形成一個(gè)膜結(jié)合蛋白的質(zhì)量控制系統(tǒng)。FtsH(Filamentation temperature-sensitive H)屬于AAA蛋白酶家族，是重要的膜結(jié)合蛋白酶。在生物體內(nèi)，F(xiàn)tsH通過寡聚化形成一個(gè)六聚環(huán)形結(jié)構(gòu)，將蛋白水解活性位點(diǎn)埋在六聚復(fù)合體空穴中央。FtsH蛋白的保守模塊包括N-端跨膜域、AAA結(jié)構(gòu)、鋅離子結(jié)合模塊等。FtsH具有ATP酶活性，蛋白水解活性和分子伴侶活性，參與蛋白質(zhì)質(zhì)量平衡控制，還與熱激、高滲、光脅迫、低溫、病害等響應(yīng)有聯(lián)系。由于FtsH功能的多樣性，所以與細(xì)胞內(nèi)諸多代謝活動(dòng)和發(fā)育進(jìn)程相關(guān)，具有重要的意義。近年來，對(duì)其蛋白酶活性有了一定研究，但是仍然存在許多問題有待進(jìn)一步解決。而且，在不同的物種中，F(xiàn)tsH的序列變異很大，因此，分離并確定FtsH的序列一直是一個(gè)難以解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來自于嗜熱菌Alicyclobacillus hesperidium中ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH，提供了極端生存條件下的研究對(duì)象，以補(bǔ)充現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明提供一種ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH，其特征在于所述酶的氨基酸序列為 SEQ ID NO lo本發(fā)明還提供一種核苷酸，用于編碼上述的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH。所述的核苷酸的序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明還提供重組質(zhì)粒，用于表達(dá)本發(fā)明的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH，該重組質(zhì)粒攜帶的基因序列為SEQ ID NO :2。上述的蛋白酶用于研究細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，可應(yīng)用于農(nóng)作物的基因改造。本發(fā)明獲得的來自于嗜熱菌Alicyclobacillus hesperidium中ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH，具有ATP酶活性,蛋白水解活性和分子伴侶活性,可應(yīng)用于農(nóng)作物的基因改造。本發(fā)明的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH可應(yīng)用于基因工程農(nóng)作物的改造，能夠更好地提高作物抵御環(huán)境壓力，大大提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。但實(shí)例僅限于說明，并不限于此。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。實(shí)施例I :本發(fā)明的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH基因全長(zhǎng)cDNA獲取本發(fā)明首先利用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行全基因組測(cè)序、拼接與注釋。將具有FtsH保守區(qū)的基因自起始密碼子AUG至終止密碼子UGG進(jìn)行捕獲。具體步驟為I> Alicyclobacillus hesperidium 的全基因組測(cè)序總DNA的提取和文庫(kù)的構(gòu)建離心獲取Alicyclobacillus hesperidium菌體，參照 Fermentas 公司 GeneJET Genomic DNA Purification Kit 進(jìn)行總 DNA 提取。參照KAPA NGS Library Preparation Kit 構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。用 Illumina HiSeq2000 最先進(jìn)的Solexa paired-end進(jìn)行全基因組測(cè)序,產(chǎn)生160倍覆蓋率的數(shù)據(jù)。應(yīng)用Velvet (Sequenceassembler for very short reads)拼接方法，得到130個(gè)contigs。并初步進(jìn)行基因組注釋，找到了約1800個(gè)編碼蛋白基因。2、ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH基因全長(zhǎng)cDNA預(yù)測(cè)生物信息學(xué)分析，在1800個(gè)編碼蛋白基因中，找到具有N-端跨膜域、AAA結(jié)構(gòu)、鋅離子結(jié)合模塊等ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH保守區(qū)域的蛋白序列。自起始密碼子AUG至終止密碼子UAA即為預(yù)測(cè)的cDNA序列，全長(zhǎng)cDNA閱讀框長(zhǎng)1809bp，預(yù)測(cè)其編碼一個(gè)含有602個(gè)氨基酸殘基，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: I所述，其對(duì)應(yīng)基因的核苷酸序列為SEQ ID NO 2o3、ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH基因全長(zhǎng)cDNA獲取總RNA的提取和cDNA合成離心獲取Alicyclobacillus hesperidium菌體,參照Qiagen公司RNeasy Mini Kit試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取。cDNA全長(zhǎng)基因片段的擴(kuò)增米用 Invitrogen 公司 M-MLV Reverse transcriptase 進(jìn)行第一鏈的合成，得到 10 μ I cDNA
第一鏈產(chǎn)物。cDNA全長(zhǎng)PCR反應(yīng)根據(jù)預(yù)測(cè)ATP-依賴的金屬蛋白酶Ft sH基因片段的序列設(shè)計(jì)特異性引物 Pl，P2(P1 5 ' -ATGAACCGTTTTTACCGGAGC-3 ' SEQ IDNO 3 ；P2 5 ' -TCAGCCACAGCTTTCCATGATC-3 ' SEQ ID NO 4)。取 cDNA 2 μ I 用于 PCR 反應(yīng)，體系50 μ I。反應(yīng)條件為 94°C 3min ;94°C 30sec，60°C 30sec，72°C 2min共 30個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0擴(kuò)增得到ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH基因閱讀框的片段1809bp，用Omega切膠回收試劑盒進(jìn)行片段純化。按照TransGen公司的pEASY-Blunt Cloning Kit進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)細(xì)胞DH5 α。取200 μ I轉(zhuǎn)化液涂板，培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選10個(gè)陽性克隆進(jìn)行鑒定，活化后送至Invitrogen公司測(cè)序鑒定。實(shí)施例2 :Alicyclobacillus hesperidium ATP-依賴的金屬蛋白酶 FtsH 全長(zhǎng)cDNA的異源表達(dá)。以原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)Alicyclobacillus hesperidium ATP-依賴的金屬蛋白 酶FtsH重組蛋白，具體步驟如下I、重組質(zhì)粒 FtsH_pET32a 的構(gòu)建與鑒定根據(jù) Alicyclobacillus hesperidiumATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH基因的全長(zhǎng)cDNA序列，在其兩端分別弓丨入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Sac I和Sal I位點(diǎn)，擴(kuò)增本發(fā)明的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH基因，亞克隆進(jìn)原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a，測(cè)序確定為正確的插入基因載體2、重組質(zhì)粒FtsH_pET32a轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)，在LA(含有100yg/ml)平板中37°C培養(yǎng)過夜，通過藍(lán)白篩選篩選轉(zhuǎn)化子。挑白色轉(zhuǎn)化子單菌落接種于LA平板，37°C培養(yǎng)過夜。用牙簽沾少許菌落做PCR。PCR條件94°C IOmin ；94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 2min，共30個(gè)循環(huán)；72°C IOmin后完成擴(kuò)增。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3、ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH誘導(dǎo)表達(dá)與純化將已經(jīng)驗(yàn)證的帶有重組質(zhì)粒FtsH-pET32a的E.coli BL21在LA平板上劃線，37 °C培養(yǎng)。挑取單菌落接入液體LA試管，37°C搖床培養(yǎng)過夜。按I %接種量接入IOOml LA培養(yǎng)基，37°C搖床210r/min培養(yǎng)至菌濃OD6tltl達(dá)到O. 6 O. 8，加入IPTG至終濃度lmM，37°C搖床培養(yǎng)4小時(shí)，誘導(dǎo)FtsH蛋白表達(dá)，離心收集上清液。上清液經(jīng)過鎳離子螯合親和層析柱純化，收集蛋白洗脫峰，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化情況。將含有目的蛋白的洗脫液進(jìn)行脫鹽濃縮，獲得Alicyclobacillushesperidium來源的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH。4、ATP_依賴的金屬蛋白酶FtsH活性及熱穩(wěn)定性分析將本發(fā)明純化后的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH溶于50mM Tris-acetate (pH8. O)，70°C溫浴2小時(shí)；2 μ g本發(fā)明ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH或溫浴后的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH分別與I μ g β -酪蛋白(Sigma)，終濃度50mM Tris-醋酸(pH8. O)，5mM醋酸鎂，12. 5 μ M醋酸鋅，80mM氯化鈉，100 μ g/mL 834，1.4禮@-巰基乙醇溶液混合，2(^1反應(yīng)體系，反應(yīng)前加入5mMATP，38°C反應(yīng)2小時(shí)。加入上樣緩沖液(O. 25MTris，I. 92M甘氨酸，I % SDS, ρΗ8· 4-8. 9)終止反應(yīng)，冰浴。樣品用12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。以不加入本發(fā)明的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH為空白組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入本發(fā)明的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH的反應(yīng)體系，β_酪蛋白條帶亮度明顯弱于空白組，且70°C溫浴后的蛋白活性不變。以真核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)Alicyclobacillus hesperidium ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH重組蛋白，具體步驟如下I、重組質(zhì)粒 pR0K2_FtsH 的構(gòu)建與鑒定根據(jù) Alicyclobacillus hesperidiumATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH基因的全長(zhǎng)cDNA序列，在其兩端分別弓丨入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Kpn I和Sac I位點(diǎn)，擴(kuò)增本發(fā)明的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH基因，亞克隆進(jìn)真核表達(dá)質(zhì)粒pR0K2，測(cè)序確定為正確的插入基因載體。2、凍融法將重組質(zhì)粒pR0K2-FtsH轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌LBA4404，在YEB (含50mg/L卡那霉素和125mg/L利福平)平板中28°C培養(yǎng)2-3d，篩選轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基(含50mg/L卡那霉素和125mg/L利福平)中，28°C 220rpm搖培16 小時(shí)，用菌液做 PCR。PCR 條件-MV 5min ；94°C 30sec,60°C lmin,72°C 2min，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin后完成擴(kuò)增。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3、水稻的遺傳轉(zhuǎn)化取陽性農(nóng)桿菌接種在YEB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2天。單菌落接入5ml YEB液體培養(yǎng)基，220rpm搖培24小時(shí)，5000rpm離心10分鐘，棄上清。20ml含有100 μ M乙酰丁香酮的AAM培養(yǎng)基重懸，劇烈搖動(dòng)，調(diào)整菌液濃度0D_為O. 1-1. O左右，靜止I小時(shí)。取水稻授粉后15-20天的未成熟穗，種子剝殼后清洗消毒。挑出幼胚并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，27°C暗培養(yǎng)10-14天。等待愈傷長(zhǎng)大后繼代，選擇第三代后的胚性愈傷組織，力口入上述處理的農(nóng)桿菌菌液，略微搖動(dòng)后靜止30分鐘，于無菌濾紙上晾干愈傷后接種于共培養(yǎng)基，25°C暗培養(yǎng)3天。挑取共培養(yǎng)的愈傷于廣口培養(yǎng)瓶，無菌水清洗。最后用250mg/L氨芐青霉素的無菌水靜置一小時(shí)，晾干。第二天轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基(250mg/L氨芐青霉素，lmg/LZT, 500mg/L哌拉)篩選抗性愈傷。4、轉(zhuǎn)基因水稻的培養(yǎng)與觀察每?jī)芍軐⒂鷤D(zhuǎn)移至新的選擇培養(yǎng)基上，約需三周即可見瘤狀抗性愈傷組織從褐化干癟的愈傷組織中長(zhǎng)出。將顏色鮮黃的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上3-5天。挑選一部分轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上，3周后長(zhǎng)出幼芽和根。將幼苗移至生根培養(yǎng)基上，幼苗用于耐熱性等分析。5、轉(zhuǎn)基因水稻和空白組耐熱性分析轉(zhuǎn)基因水稻組和未轉(zhuǎn)基因空白組植株同時(shí)于42°C預(yù)處理2小時(shí)，進(jìn)一步50°C光照培養(yǎng)箱熱激處理8小時(shí)，隨后將熱脅迫的幼苗移至正常生長(zhǎng)條件下進(jìn)行恢復(fù)生長(zhǎng)；恢復(fù)2周后觀察植株表型。結(jié)果表明2周后，含有本發(fā)明 Alicyclobacillus hesperidium來源的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH轉(zhuǎn)基因水稻組空白組基本恢復(fù)正常生長(zhǎng)，而空白組損傷較重，說明空白組植株比含有本發(fā)明Alicyclobacillushesperidium來源的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH轉(zhuǎn)基因水稻組植株更容易受到傷害。6、含有本發(fā)明Alicyclobacillus hesperidium來源的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH轉(zhuǎn)基因水稻與空白組高溫脅迫下的葉綠素?zé)晒馓匦苑治隹剐悦缟L(zhǎng)6周后，于恒溫光照培養(yǎng)箱進(jìn)行48°C、50°C高溫脅迫處理，隨后于正常生長(zhǎng)條件下進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。分別于熱激處理前、熱激處理后、恢復(fù)I天、恢復(fù)2天用便攜式熒光測(cè)定儀檢測(cè)I片最大展開葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，包括初始熒光(Ftl)、最大熒光(Fm)、可變熒光(Fv)、葉綠體的光化學(xué)效率(Fv/Fm)。測(cè)定前暗適應(yīng)20分鐘，測(cè)定時(shí)先照射檢測(cè)光(< O. 05 μ mol/m2/s)，再照射飽和脈沖光(12000 μ mol/m2/s)。每種轉(zhuǎn)基因株系分別選擇抗性植株5株，選擇同等數(shù)量的空白株，進(jìn)行各種熱激處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過2天恢復(fù)期，轉(zhuǎn)基因水稻植株的Fv/m基本恢復(fù)正常，而在空白組植株中，F(xiàn)v/FmM處于較低水平，表明高溫脅迫下，空白組植株遭受了比含有本發(fā)明Alicyclobacillus hesperidium來源的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH轉(zhuǎn)基因植株更嚴(yán)重的傷害。
權(quán)利要求
1.一種ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH，其特征在于所述酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:Io
2.—種核苷酸,用于編碼權(quán)利要求I所述的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸，其序列為SEQID NO :2。
4.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒用于表達(dá)權(quán)利要求I所述的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH。
5.如權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒攜帶的基因的核苷酸序列為 SEQ ID NO 2o
6.權(quán)利要求I所述的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH用于研究細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH，所述酶的氨基酸序列為SEQ ID NO1。本發(fā)明獲得的來自于嗜熱菌Alicyclobacillus hesperidium中ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH，具有ATP酶活性，蛋白水解活性和分子伴侶活性，可應(yīng)用于農(nóng)作物的基因改造。本發(fā)明的ATP-依賴的金屬蛋白酶FtsH可應(yīng)用于基因工程農(nóng)作物的改造，能夠更好地提高作物抵御環(huán)境壓力，大大提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102618521SQ20121010497
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月11日
發(fā)明者劉桂友, 姜楠, 王萍, 陳曉云, 陳祖耕 申請(qǐng)人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所