專利名稱：一種檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入側(cè)翼序列和拷貝數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類基因工程領(lǐng)域，具體地說，是一種檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入側(cè)翼序列和拷貝數(shù)的方法，及其在金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子插入位點檢測中的應(yīng)用，適用于在金魚和養(yǎng)殖魚類Tgf2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因或插入誘變后代中進行快速準(zhǔn)確的開展基因組插入拷貝數(shù)和側(cè)翼序列的鑒定。
背景技術(shù)：
DNA轉(zhuǎn)座子(transposon)是一類能在宿主基因組中變更插入位置的可移動遺傳因子，其變更插入位置的過程稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。很多不同的轉(zhuǎn)座子(如P因子和Mosl)介導(dǎo)的基因組插入誘變已被作為大規(guī)模遺傳篩選的工具，不僅在單細(xì)胞生物如細(xì)菌和酵母中，而且在多細(xì)胞生物包括蠕蟲、果蠅和擬南芥的研究中都被證明是成功的，它們?yōu)榘l(fā)現(xiàn)和解碼這些生物的性狀主控基因作出了巨大的貢獻。近年來，我們在一些金魚品系中發(fā)現(xiàn)了一個新的、具有天然轉(zhuǎn)座活性MT家族轉(zhuǎn)座子，為近年發(fā)現(xiàn)的第二例具有天然轉(zhuǎn)座活性的脊椎動物轉(zhuǎn)座子，根據(jù)國際轉(zhuǎn)座子的命名標(biāo)準(zhǔn)，命名該轉(zhuǎn)座子為Tgf2轉(zhuǎn)座子。Tgf2轉(zhuǎn)座子來源于鯉科魚類，其在鯉科養(yǎng)殖魚類中的轉(zhuǎn)基因整合率約為50%，是第I代線性化質(zhì)粒注射方法的10倍。與昆蟲PiggyBac轉(zhuǎn)座子傾向插入TTAA和Tcl/mariner轉(zhuǎn)座子家族偏好AT位點相比，鯉科Tgf2轉(zhuǎn)座子為隨機插入，這為開辟鯉科養(yǎng)殖魚類全基因組插入誘變研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，進行轉(zhuǎn)座子在生物基因組插入拷貝數(shù)和側(cè)翼序列一般采用反向PCR(inverse PCR)方法。反向PCR在擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品基因組DNA，再用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子，然后通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段，并進行測序，從而獲得插入拷貝數(shù)的側(cè)翼序列和拷貝數(shù)。反向PCR方法存在一些缺點和不足，例如，I、酶切、自連過程受到很多不確定因素的影響，需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段，這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA ;2、為提高分子間連接的效率，連接反應(yīng)中基因組DNA的濃度要低，因為高濃度的DNA可能會提高非同源連接水平，從而產(chǎn)生非特異擴增；3、成環(huán)的雙鏈DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反應(yīng)，它只可以擴增出較短的DNA片段；4、魚類轉(zhuǎn)座子插入位點存在多拷貝，反向PCR引物可能與多個基因序列雜交，嚴(yán)重干擾轉(zhuǎn)座子插入位點側(cè)翼序列的鑒定。中國專利文獻CN101962659A公開了一種基于Tgf2轉(zhuǎn)座子的魚類基因轉(zhuǎn)移載體及其制備方法，由轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒組成，轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒由魚類啟動子序列，如斑馬魚KrtS啟動子、目的基因、以及金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子左右臂序列構(gòu)建，輔助質(zhì)粒由斑馬魚β -actin啟動子和金魚Tgf2轉(zhuǎn)座酶編碼基因構(gòu)建，為進行魚類轉(zhuǎn)基因研究提供了新方法。中國專利文獻CN101962660A公開了一種基于Tgf2轉(zhuǎn)座子的魚類轉(zhuǎn)基因方法及其載體和載體的制備方法，通過注射轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒，并輔以基于Tgf2轉(zhuǎn)座酶mRNA兩種載體，共同注射入魚類1-2期細(xì)胞期受精卵，即可實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)基因，與常規(guī)魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，具有整合效率高、負(fù)載容量大、通用、安全和高效的優(yōu)點。但是關(guān)于一種檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入側(cè)翼序列和拷貝數(shù)的方法目前還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入側(cè)翼序列和拷貝數(shù)的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入側(cè)翼序列和拷貝數(shù)的方法，所述的方法包括以下步驟(I)通過對帶有Tgf2轉(zhuǎn)座子的金魚基因組DNA提??；(2)再對全基因組DNA進行限制性內(nèi)切酶酶切；(3)酶切好的DNA片段與splinkerette接頭連接；(4)接下來分別進行第一輪PCR和第二輪PCR分別擴增轉(zhuǎn)座子插入位點5’和3’側(cè)翼序列，對第二輪PCR產(chǎn)物進行克隆和序列測定，從而檢測出Tgf2轉(zhuǎn)座子在魚類基因組側(cè)翼序列，并推測插入的拷貝數(shù)，所述的檢測出的Tgf2轉(zhuǎn)座子在魚類基因組側(cè)翼序列數(shù)即為插入的拷貝數(shù)。
所述的步驟(I)中的金魚基因組DNA帶有Tgf2轉(zhuǎn)座子插入位點，包括基因組本身帶有Tgf2轉(zhuǎn)座子的金魚各品系，以及通過轉(zhuǎn)座方式插入Tgf2轉(zhuǎn)座子的其他魚類。所述的步驟(2)中的限制性內(nèi)切酶為Sau3Al，酶切好的DNA片段帶有"GATC"粘性末端。所述的步驟(3)中的splinkerette接頭包含長序列SEQ ID No: I和短序列SEQID No:2。所述的splinkerette接頭的合成步驟為把權(quán)利要求4所述的splinkerette接頭長序列與短序列等濃度等體積混合，95°C保溫5min，然后以1°C /15s逐步降至4°C，長序列與短序列退火形成splinkerette接頭。所述的splinkerette接頭一側(cè)帶有段序列的"GATC"粘性末端，另一側(cè)帶有由于短序列中的AT堿基互補配對形成一個7bp的發(fā)卡結(jié)構(gòu)而形成錯配區(qū)。所述的步驟(3)中酶切好的DNA片段與splinkerette接頭均帶有〃GATC〃粘性末端，通過T4連接酶連接,形成酶切DNA片段兩端帶有splinkerette接頭的DNA片段。所述的步驟(4)中進行轉(zhuǎn)座子插入位點5’側(cè)翼序列擴增的第一輪PCR，所用引物為 Splinkl :SEQ ID %:5和18€2-5’65卩3: SEQ ID No: 3 ;對第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍，并進行第二輪 PCR，所用的引物為Splink2: SEQ ID No:6 和 Tgf2_5’GSP4 :SEQ ID No:4，對第二輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5 α中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，檢測出Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組5’側(cè)翼序列，并推測出插入拷貝數(shù)。所述的步驟(4)中進行轉(zhuǎn)座子插入位點3’側(cè)翼序列擴增的第一輪PCR，所用引物為Splinkl: SEQ ID No: 5和 Tgf 2-3’GSPl: SEQ ID No: 7 ;對第一輪 PCR 產(chǎn)物稀釋 50 倍，進行第二輪PCR，所用的引物為Splink2: SEQ ID吣:6和了8€2-3’65卩2: SEQ ID No:8，對第二輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5 α中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，檢測出Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組3’側(cè)翼序列，并推測出插入拷貝數(shù)。本發(fā)明優(yōu)點在于1、可在金魚基因組Tgf2轉(zhuǎn)座子插入后代中，進行快速準(zhǔn)確的開展基因組插入拷貝數(shù)和側(cè)翼序列的鑒定；
2、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有簡便、高效和低成本特點，可為利用Tgf2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的其他魚類基因組插入誘變和轉(zhuǎn)基因后代的拷貝數(shù)和側(cè)翼序列的檢測提供快速、準(zhǔn)確的方法。


附圖I是金魚基因組提取瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖2是合成的帶有"GATC"粘性末端和一個7-bp發(fā)卡結(jié)構(gòu)的splinkerette接頭圖譜。附圖3是金魚基因組DNA用限制性內(nèi)切酶Sau3Al酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖4是Splinkerette PCR法擴增Tgf2轉(zhuǎn)座子5’側(cè)翼序列的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖5是Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入?yún)^(qū)5’端的序列比對結(jié)果。附圖6是Splinkerette PCR法擴增Tgf2轉(zhuǎn)座子3’側(cè)翼序列的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖7是Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入?yún)^(qū)3’端的序列比對結(jié)果。附圖8是Tgf2轉(zhuǎn)座子插入金魚基因組的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖9是Tgf2轉(zhuǎn)座子插入金魚基因組的序列比對結(jié)果。附圖10是Tgf2轉(zhuǎn)座子插入金魚基因組的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。附圖11是Tgf2轉(zhuǎn)座子插入金魚基因組的序列比對結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細(xì)說明。本發(fā)明的目的是建立一種檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入側(cè)翼序列和拷貝數(shù)的方法，克服反向PCR在內(nèi)切酶的選擇、酶切、自連、形成超螺旋、非特異擴增等問題，以及難以檢測出金魚等魚類基因組轉(zhuǎn)座子多拷貝插入位點等。本發(fā)明由于接頭的引物是與中間錯配區(qū)的一條鏈的序列完全一致，因此，能避免接頭到接頭間的非特異性擴增，具有操作簡單、檢測效率高和具有檢測出多拷貝插入位點的特點。本發(fā)明適用于Tgf2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的金魚或其他魚類基因組插入誘變和轉(zhuǎn)基因研究分析。本發(fā)明的一種檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入拷貝數(shù)和側(cè)翼序列的方法，包括以下步驟通過對帶有Tgf2轉(zhuǎn)座子的金魚基因組DNA提??；再對全基因組DNA進行限制性內(nèi)切酶酶切；酶切好的DNA片段與splinkerette接頭連接；接下來分別進行第一輪PCR和第二輪PCR分別擴增轉(zhuǎn)座子插入位點5’和3’側(cè)翼序列，對第二輪PCR產(chǎn)物進行克隆和序列測定，從而檢測出Tgf2轉(zhuǎn)座子在魚類基因組側(cè)翼序列，并推測插入的拷貝數(shù)。需要說明的是，所述的金魚基因組DNA帶有Tgf2轉(zhuǎn)座子插入位點，包括基因組本身帶有Tgf2轉(zhuǎn)座子的金魚各品系，以及通過轉(zhuǎn)座方式插入Tgf2轉(zhuǎn)座子的其他魚類。所述的對全基因組DNA進行酶切的限制性內(nèi)切酶為Sau3Al，酶切好的DNA片段帶有"GATC"粘性末端。
所述的splinkerette 接頭包含長序列(5’-CGAAGAGTAACCGTTGCTAGGAGAGACCGTGGCTGAATGA GACTG GTGTCGACACTAGTGG-3，) (SEQ ID No:I)和短序列(5，-GATCCCACTAGTGTCGACACCAGTCTCTAATTTTTTTTT TCAAAAAAA- 3，)(SEQ ID No:2)。所述的splinkerette接頭的合成步驟為把權(quán)利要求4所述的splinkerette接頭長序列與短序列等濃度等體積混合，95°C保溫5min，然后以1°C /15s逐步降至4°C，長序列與短序列退火形成splinkerette接頭。合成的splinkerette接頭一側(cè)帶有段序列的〃GATC〃粘性末端，另一側(cè)帶有由于短序列中的AT堿基互補配對形成一個7bp的發(fā)卡結(jié)構(gòu)而形成錯配區(qū)。所述的酶切好的DNA片段與splinkerette接頭均帶有〃GATC〃粘性末端,通過T4連接酶連接，形成酶切DNA片段兩端帶有splinkerette接頭的DNA片段。所述的進行轉(zhuǎn)座子插入位點5’側(cè)翼序列擴增的第一輪PCR，所用引物為=Splink1:5’-CGAAGAGTAACCGTTGCTAGGAGAGACC-3’ (SEQ ID No:5)和 Tgf2_5’ GSP3: 5’-TAAGTACTTTTTGACTGTAAATAAAATTGTAAGGAGT -3’ (SEQ ID No: 3);對第一輪 PCR 產(chǎn)物稀釋 50 倍，并進行第二輪 PCR，所用的引物為Splink2: 5’- GTGGCTGAA TGAGACTGGTGTCGAC-3’ (SEQ ID吣6)和丁8€2-5’65卩4: 5’-AAGTATTGA TTTTTAATTGTACTCAAGTAA AGT-3’ (SEQ ID No:4)，對第二輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5a中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，檢測出Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組5’側(cè)翼序列，并推測出插入拷貝數(shù)。所述的進行轉(zhuǎn)座子插入位點3’側(cè)翼序列擴增的第一輪PCR，所用引物為SPI inkI:5’-CGAAGAGTAACCGTTGCTAGGAGAGACC-3’ (SEQ ID No :5)和 Tgf2_3’GSPl:5’-AGACTAATACACCTCTTCCCGCATCG-3’ (SEQ ID No:7);對第一輪PCR產(chǎn)物稀釋 50 倍，進行第二輪 PCR，所用的引物為Splink2: 5’- GTGGCTGAATGAGACTGGTGTCGAC-3’ (SEQ ID No:6)和 Tgf2-3’ GSP2: 5’ -GGCTTGACACTAACAATTT TGAGAATC-3’(SEQ ID No: 8)，對第二輪 PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5 α中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，檢測出Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組3’側(cè)翼序列，并推測出插入拷貝數(shù)。由于Tgf2轉(zhuǎn)座子在基因組插入位點的兩側(cè)均帶有8-bp重復(fù)標(biāo)識，根據(jù)帶有相同的8-bp重復(fù)標(biāo)識的兩側(cè)序列設(shè)計引物，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5 α中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，從而鑒定出Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組側(cè)翼序列。這種由通過在基因組轉(zhuǎn)座子Tgf2插入位點兩側(cè)引入特異性splinkerette接頭的反向PCR方法，由于接頭的引物與中間錯配區(qū)的一條鏈的序列完全一致，因此，能避免接頭到接頭間的非特異性擴增?？朔鹘y(tǒng)反向PCR在內(nèi)切酶的選擇、酶切、自連、形成超螺旋、非特異擴增等問題，以及難以檢測出基因組魚類轉(zhuǎn)座子多拷貝插入位點等。因此，本發(fā)明具有操作簡單、檢測效率高和具有檢測出金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子多拷貝插入位點的特征。實施例I帶Tgf 2轉(zhuǎn)座子插入的魚類基因組DNA的提取
由于金魚基因組中存在Tgf2轉(zhuǎn)座子的插入，取95%酒精保存或活金魚尾鰭約100-200mg，剪碎，55°C烘干 5_6min ；加入 410 μ L 的 STE 裂解液(ρΗ=8· 10)，80 μ L 的 SDS(10%，ρΗ=8. 14)和1(^1^的蛋白酶1((2(^8/1111);翻轉(zhuǎn)搖勻，561水浴保溫14-15個小時；力口Λ 340 μ L到400 μ L的飽和氯化鈉溶液混勻，輕搖3min ;加入340 μ L到400 μ L的氯仿，搖勻；4°C 12000rpm離心20min，將上清液移入另一干凈的離心管中；加入450 μ L到500 μ L的異丙醇(_20°C)，12000rpm離心20min (4°C);倒去上清液，留沉淀，加入800 μ L的75%乙醇洗漆;12000rpm離心5min至Ij 15min (4°C );到去乙醇,烘干沉淀,加入100 μ L至Ij 200 μ L的雙蒸水，再加2 μ L的RNase。取I μ I金魚基因組DNA，O. 8%凝膠電泳檢測基因組DNA的質(zhì)量(圖1)，其余于4 1冰箱保存?zhèn)溆谩?需要說明的是，所述的帶Tgf2轉(zhuǎn)座子插入的魚類轉(zhuǎn)基因方法詳見中國專利申請201010223188. 8 一種基于Tgf2轉(zhuǎn)座子的魚類轉(zhuǎn)基因方法及其載體和載體的制備方法。實施例2 Splinkerette接頭的合成
委托上海生工公司合成splinkerette接頭所需的一條寡核苷酸長序列(SEQ IDNo: I)和一條寡核苷酸短序列(SEQ ID No:2);分別把寡核苷酸長序列和短序列用無菌雙蒸水溶解為50 μ m/μ 1，分別取50 μ I寡核苷酸長序列和短序列等體積混合，95°C保溫5min，然后在PCR儀上以TC /15s逐步降至4°C，長序列與短序列在退火過程中就可形成splinkerette接頭,_20°C保存。合成的splinkerette接頭一側(cè)帶有限制性內(nèi)切酶Sau3Al的"GATC 〃粘性末端，另一側(cè)帶有由短序列中的AT堿基互補配對形成一個7-bp的發(fā)卡結(jié)構(gòu)而形成錯配區(qū)(圖2)。實施例3金魚基因組DNA的酶切及連接splinkerette接頭
取實施例I中提取的包含Tgf2轉(zhuǎn)座子的金魚基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶Sau3Al進行37°C水浴酶切12h，酶切反應(yīng)在30 μ I體系中進行，包含10 μ I Genomic DNA (2. 5 μ g)，3 μ I10 X Sau3Al Restriction buffer,4 μ I Sau3Al enzyme (IOU/μ I),0.3 μ I AcetylatedBSA (lOmg/ml) ,12. 7μ I ddH20。酶切產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，以TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳檢測酶切的效果(圖3)。將酶切完全的金魚基因組Sau3Al酶切DNA產(chǎn)物在65°C水浴20min，以終止限制性內(nèi)切酶活性，于_20°C保存?zhèn)溆?。將Sau3Al酶切DNA產(chǎn)物
4.5 μ I 與 splinkerette 接頭 Ιμ 用 4μ1 T4 DNA 連接酶(Takara 公司，5U/ μ I)在 40 μ I反應(yīng)體系中連接12 h，之后65°C水浴20min，并用大量DNA純化試劑盒(天根)過柱純化。實施例4 Splinkerette PCR法擴增Tgf2轉(zhuǎn)座子5’側(cè)翼序列
根據(jù) Tgf2 轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計引物 Tgf2 5' -GSP3 (SEQ ID No:3)和 Tgf2 5，-GSP4 (SEQID No:4)，進行2輪PCR擴增。第一輪擴增以實施例3純化的帶有splinkerette接頭的基因組酶切片段5 μ I 為模板，加入5 μ I 10 XLA buffer (Mg2+ plus),5 μ I dNTP mixture2.5mM,I μ I splink I (SEQ ID No:5), I μ I Tgf2_5，GSP3 (SEQ ID No:3),0. 5 μ I LATaq 酶，32. 5 μ I ddH20，總體積 50 μ I。反應(yīng)程序為94°C 5min ;94°C 15s，65°C 30s, 72°C3min，28個循環(huán)；72°C延長lOmin。第二輪擴增以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍為模板，力口入 5 μ I 10 XLA buffer (Mg2+ plus), 5 μ I dNTP mixture 2. 5mM, I μ I splink 2 (SEQID No:6), I μ I Tgf2-5，GSP4 (SEQ ID No:4),0. 5 μ I LA Taq 酶，32. 5 μ I ddH20，總體積 50μ1。反應(yīng)程序為94°C 5min ;94°C 15s，57°C 30s, 72 °C 3min，30 個循環(huán)；72°C 延長IOmin0第二輪擴增產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳檢測(圖4)。經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠分離后，割膠回收亮帶，將回收產(chǎn)物分別連接至pMD-19T載體(TaKaRa)中，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆，接種到氨芐青霉素含量為50 μδ/πι1的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，取200μ1菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司進行測序。用Bioedit軟件進行序列分析，Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入?yún)^(qū)5’端的結(jié)果如圖5所示，共檢測出6種Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組5’側(cè)翼序列，并推測出插入拷貝數(shù)為6個。實施例5 Splinkerette PCR法擴增Tgf2轉(zhuǎn)座子3’側(cè)翼序列
根據(jù) Tgf2 轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計引物 Tgf2 5，-GSPl (SEQ ID No:7)和 Tgf2 5，-GSP2 (SEQID No:8)，進行2輪PCR擴增。第一輪擴增以實施例3純化的帶有splinkerette接頭的基因組酶切片段5 μ I 為模板，加入5 μ I 10 XLA buffer (Mg2+ plus),5 μ I dNTP mixture2. 5mM, I μ I Splink I (SEQ ID No:5), I μ I Tgf2-3J GSPl (SEQ ID No:7),0. 5 μ I LATaq 酶，32. 5 μ I ddH20，總體積 50 μ I。反應(yīng)程序為94°C 5min ；94°C 15s，68°C 30s, 72°C3min，28個循環(huán)；72°C延長lOmin。第二輪擴增以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍為模板，力口入 5 μ I 10 XLA buffer (Mg2+ plus), 5 μ I dNTP mixture 2. 5mM, I μ I Splink I (SEQID No:6), I μ I Tgf2-3，GSP2 (SEQ ID No:8),0. 5 μ I LA Taq 酶，32. 5 μ I ddH20，總體積 50μ1。反應(yīng)程序為94°C 5min ；94°C 15s,61°C 30s, 72 °C 3min，30 個循環(huán)；72°C 延長IOmin0第二輪擴增產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳檢測 (圖6)。經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠分離后，割膠回收目的片段，將回收產(chǎn)物分別連接至PMD-19T載體(TaKaRa)中，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆，接種到氨芐青霉素含量為50 μδ/πι1的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，取200μ1菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司進行測序。用Bioedit軟件進行序列分析，Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入?yún)^(qū)5’端的結(jié)果如圖7所示，共檢測出6種Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組5’側(cè)翼序列，并推測出插入拷貝數(shù)為6個。實施例6 Tgf2轉(zhuǎn)座子插入金魚基因組的鑒定I
選取實施例4、5中均檢測到的Tgf2轉(zhuǎn)座子插入側(cè)翼序列(Tgf2末端8堿基CTTGTTAC相同)設(shè)計引物Tgf2-fl (SEQ ID No:9)和Tgf2-rl (SEQ ID No:10)，以實施例I中提取的金魚基因組為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系為1 μ I Genomic DNA, 5 μ I 10 XLA buffer(Mg2+ plus),5 μ I dNTP mixture 2. 5mM,I μ I Tgf2-fl(SEQ ID No:9),I μ I Tgf2-rl(SEQID No:10)，0. 5 μ I LA Taq 酶，32. 5 μ I ddH20，總體積 50 μ I。反應(yīng)程序為94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 5min，28個循環(huán)；72°C延長lOmin。擴增產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳檢測。經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠分離后，割膠回收
5.Ikb和O. 4kb目的片段(圖8)，將回收產(chǎn)物分別連接至pMD-19T載體(TaKaRa)中，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，接種到氨芐青霉素含量為50 μδ/πι1的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，取200μ1菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司進行測序。用Bioedit軟件進行序列分析，5. Ikb長片段序列中保留有4. 7kb完整的金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子。O. 4kb短片段為金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子自主剪切后留下的序列，其中，序列-I為Tgf2轉(zhuǎn)座子完全剪切或野生型基因序列，序列-2為Tgf2轉(zhuǎn)座子不完全剪切后多出部分8-bp正向重復(fù)“TAC”序列，序列-3為Tgf2轉(zhuǎn)座子不完全剪切后多出部分Tgf2轉(zhuǎn)座子(CAGACCTCTG)序列(圖9)。上述結(jié)果證明了實施例4、5獲得的金魚基因組Tgf2轉(zhuǎn)座子插入側(cè)翼序列的正確性。實施例7 Tgf2轉(zhuǎn)座子插入金魚基因組的鑒定2
選取實施例4、5中均檢測到的Tgf2轉(zhuǎn)座子插入側(cè)翼序列(Tgf2末端8堿基GTTGTGTC相同)設(shè)計引物Tgf2-f2 (SEQ ID No:ll^PTgf2-r2(SEQ ID No: 12)，以實施例I中提取的金魚基因組為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系為1 μ I Genomic DNA, 5 μ I 10 XLA buffer(Mg2+ plus) ,5 μ I dNTP mixture 2. 5mM, I μ I Tgf2-f2 (SEQ ID Νο:11)，1μ1 Tgf2-r2(SEQ ID No:12),0. 5 μ I LA Taq 酶，32. 5 μ I ddH20，總體積 50 μ I。反應(yīng)程序為94°C5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 5min，28 個循環(huán)；72°C 延長 lOmin。擴增產(chǎn)物經(jīng) I. 2% 瓊脂糖凝膠，以TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳檢測(圖10)。經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠分離后，割膠回收目的片段，將回收產(chǎn)物分別連接至PMD-19T載體(TaKaRa)中，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆，接種到氨芐青霉素含量為50 μδ/πι1的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，取200μ1菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司進行測序。用Bioedit軟件進行序列分析，5. 2kb長片段序列中保留有4. 7kb的完整金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子，O. 5kb短片段序列為金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子自主完全剪切或野生型基因序列(圖11)。上述結(jié)果進一步證明 了實施例4、5獲得的金魚基因組Tgf2轉(zhuǎn)座子插入側(cè)翼序列的正確性。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入側(cè)翼序列和拷貝數(shù)的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟(I)通過對帶有Tgf2轉(zhuǎn)座子的金魚基因組DNA提?。?2)再對全基因組DNA進行限制性內(nèi)切酶酶切；(3)酶切好的DNA片段與splinkerette接頭連接；(4)接下來分別進行第一輪PCR和第二輪PCR分別擴增轉(zhuǎn)座子插入位點5’和3’側(cè)翼序列，對第二輪PCR產(chǎn)物進行克隆和序列測定，從而檢測出Tgf2轉(zhuǎn)座子在魚類基因組側(cè)翼序列，并推測插入的拷貝數(shù)，所述的檢測出的Tgf2轉(zhuǎn)座子在魚類基因組側(cè)翼序列數(shù)即為插入的拷貝數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步驟(I)中金魚基因組DNA帶有Tgf2轉(zhuǎn)座子插入位點，包括基因組本身帶有Tgf2轉(zhuǎn)座子的金魚各品系，以及通過轉(zhuǎn)座方式插入Tgf2轉(zhuǎn)座子的其他魚類。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中限制性內(nèi)切酶為Sau3Al，酶切好的DNA片段帶有〃GATC〃粘性末端。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中splinkerette接頭包含長序列SEQ ID No: I和短序列SEQ ID No:2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述的splinkerette接頭的合成步驟為把權(quán)利要求4所述的splinkerette接頭長序列與短序列等濃度等體積混合,95°C保溫5min,然后以1°C /15s逐步降至4°C,長序列與短序列退火形成splinkerette接頭。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述的splinkerette接頭一側(cè)帶有段序列的"GATC〃粘性末端，另一側(cè)帶有由于短序列中的AT堿基互補配對形成一個7bp的發(fā)卡結(jié)構(gòu)而形成錯配區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中酶切好的DNA片段與splinkerette接頭均帶有〃GATC〃粘性末端,通過T4連接酶連接,形成酶切DNA片段兩端帶有splinkerette接頭的DNA片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中進行轉(zhuǎn)座子插入位點5’側(cè)翼序列擴增的第一輪PCR，所用引物為Splinkl :SEQ ID No: 5和Tgf2_5’GSP3: SEQ IDNo:3 ;對第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍，并進行第二輪PCR，所用的引物為Splink2: SEQ IDNo:6和Tgf2-5’GSP4 SEQ ID No:4，對第二輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5 a中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，檢測出Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組5’側(cè)翼序列，并推測出插入拷貝數(shù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中進行轉(zhuǎn)座子插入位點3’側(cè)翼序列擴增的第一輪PCR，所用引物為Splinkl: SEQ ID No: 5和Tgf2_3’GSPl: SEQID No: 7 ;對第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍，進行第二輪PCR，所用的引物為Splink2: SEQ ID如:6和了§€2-3’65 2: SEQ ID No:8，對第二輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5 a中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，檢測出Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組3’側(cè)翼序列，并推測出插入拷貝數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入側(cè)翼序列和拷貝數(shù)的方法通過對帶有Tgf2轉(zhuǎn)座子的金魚基因組DNA提??；再對全基因組DNA進行限制性內(nèi)切酶酶切；酶切好的DNA片段與splinkerette接頭連接；接下來分別進行第一輪PCR和第二輪PCR分別擴增轉(zhuǎn)座子插入位點5'和3'側(cè)翼序列，對第二輪PCR產(chǎn)物進行克隆和序列測定，從而檢測出Tgf2轉(zhuǎn)座子在魚類基因組側(cè)翼序列，并推測插入的拷貝數(shù)。本發(fā)明優(yōu)點在于具有簡便、高效和低成本特點，可為利用Tgf2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的其他魚類基因組插入誘變和轉(zhuǎn)基因后代的拷貝數(shù)和側(cè)翼序列的檢測提供快速、準(zhǔn)確的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102628083SQ20121010519
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者田玉梅, 蔣霞云, 鄒曙明 申請人:上海海洋大學(xué)