專利名稱：一種利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)microRNA的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種熒光納米銀簇探針檢測(cè)microRNA的分析方法，屬于檢測(cè)分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
microRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約18 25個(gè)核苷酸。它參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等。近期研究發(fā)現(xiàn)，miCToRNA在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，已成為一類理想的腫瘤標(biāo)記物。所以定量檢測(cè)miCToRNA對(duì)了解其生物功能，癌癥的早期診斷以及新藥的開(kāi)發(fā)，都具有十分重要的意義。與傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)相比，miCToRNA其獨(dú)有的特點(diǎn)，如序列短，家族序列同源性高及低豐度表達(dá)，增加了其檢測(cè)的難度。目前檢測(cè)microRNA的方法主要有Northern印跡分析,微陣列芯片技術(shù),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等。雖然Northern印跡是當(dāng)前microRNA分析的標(biāo)準(zhǔn)方法,但操作繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度低，分析檢測(cè)時(shí)需要大量的樣品及分離富集步驟，而且對(duì)污染非常敏感，實(shí)驗(yàn)中每一步操作不當(dāng)都會(huì)影響分析結(jié)果。微陣列芯片技術(shù)雖然可實(shí)現(xiàn)高通量，多組分同時(shí)檢測(cè)，但是其制作和檢測(cè)費(fèi)用高；芯片上可利用的樣品體積很小，導(dǎo)致靈敏度不高；此外，microRNA序列短，序列相似性高，不能同時(shí)優(yōu)化所有待測(cè)的microRNA雜交環(huán)境，所以選擇性不高。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是現(xiàn)在定量檢測(cè)microRNA的主要方法，包括引物延伸RT-PCR，莖環(huán)引物RT-PCR和microRNA加尾RT-PCR等方法。雖然基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的microRNA檢測(cè)方法具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，但是需要逆轉(zhuǎn)錄操作，增加了實(shí)驗(yàn)的成本和設(shè)計(jì)的復(fù)雜性。隨著新的microRNA序列不斷發(fā)現(xiàn)和對(duì)microRNA功能研究的逐步深入,對(duì)microRNA的分析檢測(cè)提出了新要求。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單直接，靈敏度高，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確檢測(cè)microRNA的分析技術(shù)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)microRNA的分析方法，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)，背景信號(hào)低、線性檢測(cè)范圍寬、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)便實(shí)用的分析技術(shù)。本發(fā)明利用靶標(biāo)microRNA誘導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)microRNA的分析方法如下。設(shè)計(jì)一條含有三種功能序列的DNA擴(kuò)增模板與祀標(biāo)microRNA結(jié)合序列，nicking核酸內(nèi)切酶酶切序列和合成熒光納米簇的DNA互補(bǔ)序列。從3’端到5’端排列順序?yàn)殪霕?biāo)microRNA結(jié)合序列,nicking核酸內(nèi)切酶酶切序列,祀標(biāo)microRNA結(jié)合序列，nicking核酸內(nèi)切酶酶切序列，和合成熒光納米簇的DNA互補(bǔ)序列。當(dāng)靶標(biāo)microRNA與DNA擴(kuò)增模板結(jié)合后，誘導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)和nicking核酸內(nèi)切酶特異性的酶切反應(yīng)得到大量單鏈DNA產(chǎn)物，其中一種單鏈DNA產(chǎn)物能夠與DNA擴(kuò)增模板結(jié)合，繼續(xù)充當(dāng)靶標(biāo)microRNA的引物作用，從而極大地提高擴(kuò)增的效率。另一種單鏈DNA產(chǎn)物即為熒光納米銀簇的合成DNA序列，能與加入的硝酸銀離子溶液在硼氫化鈉還原作用下，合成熒光納米銀簇探針，在一定波長(zhǎng)的入射光照射下，發(fā)射出相應(yīng)的熒光，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)并計(jì)算熒光改變值，與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線比對(duì)，推算出靶標(biāo)microRNA的濃度。此外，DNA擴(kuò)增模板中功能序列也可以有不同的組合和排列模式，如從3’端到5’端排列順序?yàn)榘袠?biāo)microRNA結(jié)合序列，nicking核酸內(nèi)切酶酶切序列，合成熒光納米簇的DNA互補(bǔ)序列，nicking核酸內(nèi)切酶酶切序列，和合成熒光納米簇的DNA互補(bǔ)序列。本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步描述如下利用祀標(biāo)microRNA與DNA擴(kuò)增模板結(jié)合后，誘導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)和nicking核酸內(nèi)切酶特異性的酶切反應(yīng)得到單鏈DNA產(chǎn)物，該單鏈DNA產(chǎn)物與加入的硝酸銀溶液在硼氫化鈉還原作用下制備熒光納米銀簇探針，測(cè)定反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)并計(jì)算熒光信號(hào)改變值，與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線比對(duì)，推算出祀標(biāo)microRNA的濃度。
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所述熒光納米銀簇探針粒徑為I 10nm，激發(fā)波長(zhǎng)為500 680nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 900nm。本發(fā)明的靶標(biāo)microRNA檢測(cè)方法包括以下操作步驟步驟I將靶標(biāo)microRNA加入到DNA擴(kuò)增模板溶液中，進(jìn)行孵育反應(yīng)；步驟2向步驟I中所得的反應(yīng)液中加入恒溫?cái)U(kuò)增混合液，孵育反應(yīng)后，熱失活酶，終止反應(yīng)；步驟3向步驟2中所得的反應(yīng)液中加入硝酸銀溶液與檸檬酸緩沖溶液，混勻后，離心取上清，然后加入硝酸銀溶液和新鮮配制的硼氫化鈉溶液，黑暗中反應(yīng)后合成熒光納米銀簇；步驟4測(cè)定步驟3中所得的熒光納米銀簇溶液的熒光信號(hào)。所述步驟I中靶標(biāo)microRNA來(lái)自于組織、血液或細(xì)胞的生物樣本。所述步驟I中的孵育反應(yīng)在37°C 55 °C和反應(yīng)緩沖溶液中，步驟I中的DNA擴(kuò)增模板反應(yīng)液和靶標(biāo)microRNA的體積比為0. I 10，反應(yīng)時(shí)間為5 50分鐘，所述的DNA擴(kuò)增模板濃度為10 800nM ;所述的靶標(biāo)microRNA濃度為IaM IOOnM ;所述的DNA擴(kuò)增模板含有三種功能序列與靶標(biāo)microRNA結(jié)合序列，nicking核酸內(nèi)切酶酶切序列和合成熒光納米簇的DNA互補(bǔ)序列，所述的反應(yīng)緩沖溶液為25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，0. 5mM 二硫蘇糖醇和pH為6. O 8. 9。所述步驟2的孵育反應(yīng)是在35°C 55°C和反應(yīng)緩沖液中，步驟I所得的反應(yīng)液和恒溫?cái)U(kuò)增混合液體積比為0. I 10，反應(yīng)20 200分鐘，恒溫?cái)U(kuò)增混合液中含有恒溫聚合酶、nicking核酸內(nèi)切酶、RNase抑制劑和dNTP ;所述的恒溫聚合酶濃度為0. OlUy Γ1 I. OU μ L_\nicking核酸內(nèi)切酶濃度為0. IU μ Γ1 I. OUy Λ RNase抑制劑濃度為0. IUμ Γ1 I. OU μ ΙΛ dNTP溶液濃度為80 500 μ M ;所述的反應(yīng)緩沖液為IOmM硝酸鈉、20mM硝酸銨、20mM TriS-HNO3>2mM 硝酸鎂和 0. 1% Triton X-100 和 pH 為 6. O 8. 9。所述恒溫聚合酶為商品化的VentR (610-)0嫩聚合酶411丨290嫩聚合酶或1(16110￥Fragment聚合酶。所述nicking 核酸內(nèi)切酶為商品化的 Nt. CviPII、Nb. BbvCI> Nb. BtsI、Nt. BsmAI>Nt. BbvCI、Nt. BspQI、Nt. AlwI 或 Nt. BstNBI。
所述的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線是由已知濃度的靶標(biāo)microRNA的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述操作步驟反應(yīng)后，測(cè)定反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)并計(jì)算熒光改變值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液中microRNA的濃度和體系中熒光改變值制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。所述步驟3中硝酸銀濃度為10 800 μ Μ，硼氫化鈉溶液為新鮮配制，其濃度為10 10mM，反應(yīng)溫度為25°C 55°C，反應(yīng)時(shí)間為20 120分鐘。本發(fā)明的方法中DNA擴(kuò)增模板中采用雙nicking核酸內(nèi)切酶酶切序列的設(shè)計(jì)，利用擴(kuò)增得到的單鏈DNA序列與DNA擴(kuò)增 模板再結(jié)合，充當(dāng)引物作用，極大地提高了擴(kuò)增效率。DNA擴(kuò)增模板中合成熒光納米簇的DNA互補(bǔ)序列的設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了一種新型的熒光納米探針的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的熒光探針相比，熒光納米探針具有優(yōu)良的光學(xué)特性，如高熒光強(qiáng)度、抗光漂白性、發(fā)光顏色可調(diào)、激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)等。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(I)靈敏度高DNA擴(kuò)增模板中通過(guò)雙microRNA結(jié)合序列(或雙合成熒光納米簇的DNA互補(bǔ)序列)和nicking核酸內(nèi)切酶酶切序列的設(shè)計(jì),使得擴(kuò)增產(chǎn)物和祀標(biāo)microRNA一樣，能夠與DNA擴(kuò)增模板進(jìn)行結(jié)合，啟動(dòng)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，達(dá)到指數(shù)信號(hào)放大的作用，從而極大地提高了檢測(cè)靈敏度。(2)選擇性好基于靶標(biāo)miRNA與DNA擴(kuò)增模板的特異性堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，使得其它分子的干擾影響很小。(3)背景信號(hào)低熒光納米銀簇的合成與DNA序列的堿基組成直接相關(guān)，只有堿基組成特異性的DNA序列才能合成穩(wěn)定熒光信號(hào)的熒光納米銀簇。(4)多重檢測(cè)利用不同堿基組成的DNA序列合成的納米銀簇探針光學(xué)特性的差異，針對(duì)不同的祀標(biāo)microRNA,設(shè)計(jì)不同的DNA擴(kuò)增模板,可以實(shí)現(xiàn)多重microRNA檢測(cè)。(5)高通量檢測(cè)采用96或384酶標(biāo)板，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和待測(cè)樣本的檢測(cè)，減少檢測(cè)誤差。(6)操作過(guò)程簡(jiǎn)便快速整個(gè)檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單。(7)無(wú)污染整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不需要用到有機(jī)溶劑或是有毒試劑。


圖I利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)miR-141的分析方法的原
理示意圖。圖2工作曲線制備。(A)不同濃度miR-141反應(yīng)溶液的熒光光譜；(B)不同濃度miR-141反應(yīng)溶液的熒光改變值(F/Ffl)與miR-141濃度對(duì)數(shù)值的工作曲線。圖3特異性實(shí)驗(yàn)。㈧不同靶標(biāo)microRNA反應(yīng)溶液的熒光光譜；⑶實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較柱狀圖(f/fq-i)。圖4利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)miR-21的分析方法的原
理示意圖。圖5利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)let_7a的分析方法的原理示意圖。圖6利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)miR-646的分析方法的原
理示意圖。
圖7利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針多重檢測(cè)miR-141和miR-21的分析方法的原理示意圖。符號(hào)說(shuō)明附圖I 中，miR-141 為 5’-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’，A 為靶標(biāo) miR-141 結(jié)合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’ )，X 為 Nt. B stNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3’ ) ,B為合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’-TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，T為擴(kuò)增產(chǎn)生與miR-14一致的DNA序列(5’ -TAACACTGTCTGGTAAAGATGG-3’ )，R為合成熒光納米銀簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3’)，C 為 Nt. BstNBI 核酸內(nèi)切酶,D 為VentR (exo-)DNA 聚合酶。附圖2中，F(xiàn)為miR-141標(biāo)準(zhǔn)溶液在644nm處的熒光值，F(xiàn)0為空白樣本(不含有miR-141)在644nm處的熒光值，(F/F0-l)表示miR-141標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光改變值。附圖3中，F(xiàn)為靶標(biāo)microRNA溶液在644nm處的熒光值，F(xiàn)0為空白樣本(不含有microRNA)在644nm處的熒光值，(F/F0-l)表示microRNA溶液的熒光改變值。 附圖4 中，miR-21 為 5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’，A 為靶標(biāo) miR_21 結(jié)合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’)，X 為 Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3’)，B 為合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，T為擴(kuò)增產(chǎn)生與miR-21一致的DNA序列(5，-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’ )，R為合成熒光納米銀簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3’)，C 為 Nt. BstNBI 核酸內(nèi)切酶,D 為VentR (exo-)DNA 聚合酶。附圖5 中，let-7a 為 5’ -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’，A 為靶標(biāo) let_7a 結(jié)合序列(5，-AACTATACAACCTACTACCTCA-3’)，X 為 Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3’)，B 為合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，T為擴(kuò)增產(chǎn)生與let_7a一致的DNA序列(5’ -TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT-3’ )，R為合成熒光納米銀簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3’)，C 為 Nb. BbvCI 核酸內(nèi)切酶，D 為VentR (exo-)DNA 聚合酶。附圖6 中，miR-646 為 5，-AAGCAGCUGCCUCUGAGGC-3’，A 為靶標(biāo) miR-646 結(jié)合序列(5，-GCCTCAGAGGCAGCTGCTT-3’)，X 為 Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3’)，B 為合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’ )，T為擴(kuò)增產(chǎn)生與miR-646一致的DNA序列(5’ -AAGCAGCTGCCTCTGAGGC-3’)，R/R’ 合成熒光納米銀簇的DNA序列(5，-CCCACCCACCCGCCCAA-3’)，C 為 Nb. BbvCI 核酸內(nèi)切酶，D 為 phi29DNA 聚合酶。附圖7 中，miR-141 為 5 ’ -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3 ’，miR_21序列為 5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’，A 為靶標(biāo) miR-21 結(jié)合序列(5，-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’)，X 為 Nt. B stNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3’ )，E 為靶標(biāo) miR-141 結(jié)合序列(5’ -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’)，B 為合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，F(xiàn)為合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’ -ATCGGGGGCGA-3’)，T為擴(kuò)增產(chǎn)生與miR-21 —致的 DNA 序列(5，-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’)，U 為擴(kuò)增產(chǎn)生與 miR-141 — 致的DNA序列(5，-TAACACTGTCTGGTAAAGATGG-3，)，R為合成熒光納米銀簇的DNA序列(5，-ATCGCCCCCGAT-3’)，S 為合成熒光納米銀簇的 DNA 序列(5’ -CCCACCCACCCGCCCAA-3’)，C為Nt. BstNBI核酸內(nèi)切酶，D為VentR (exo-)DNA聚合酶。
具體實(shí)施實(shí)例
通過(guò)下述實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是不能限制本發(fā)明的內(nèi)容實(shí)施實(shí)例I :利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)miR-141 (5’ -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3，)的分析方法，檢測(cè)原理如附圖I所示。采用VentR (exo-) DNA聚合酶和Nt. BstNBI核酸內(nèi)切酶。DNA擴(kuò)增模板上的序列排布為靶標(biāo)miR-141結(jié)合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3，)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3，)，miR-141結(jié)合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’ ) ,Nt. BstNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3’)，以及合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，3’端磷酸化。下面對(duì)miR-141檢測(cè)的具體實(shí)施來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。其中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件。本發(fā)明中的室溫是指進(jìn)行實(shí)施操作的實(shí)驗(yàn)室溫度23 28°C。具體操作步驟如下在4yL DNA擴(kuò)增模板溶液(200nM)中加入I μ L靶標(biāo)miR-141溶液，反應(yīng)緩沖溶液為25mMTriS-HNO3，50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，O. 5mM二硫蘇糖醇，pH為7. 9。于88°C孵育10分鐘后，然后加入恒溫?cái)U(kuò)增混合液5 μ L，包括VentR (exo-) DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nt. BstNBI 核酸內(nèi)切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制劑(O. 8Uμ Γ1)和 dNTP (250 μ Μ)，反應(yīng)緩沖液為 IOmM 硝酸鈉、20mM 硝酸銨、20mM TriS-HNO3>2mM 硝酸鎂和O. 1% Triton X-100，pH為8. 8。于53°C孵育反應(yīng)50分鐘，然后于90°C孵育5分鐘終止反應(yīng)。向上述反應(yīng)液中加入8 μ L硝酸銀溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L檸檬酸鈉緩沖溶液(20mM，pH 7. O)，震蕩混勻后，12，000轉(zhuǎn)離心10分鐘后取上清溶液，于黑暗中放置15分鐘后，加入新鮮配制的I μ L硼氫化鈉(3. 6mM)溶液,混勻，于黑暗中放置I小時(shí)，測(cè)定溶液的突光信號(hào)。工作曲線的制作分別準(zhǔn)備已知濃度的miR-141標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為laM，IOaM, IOOaM, IfM, IOfM, IOOfM, IpM, IOpM, IOOpM,和 InM,以及空白樣本(不含有 miR-141,即miR-141濃度為0)，按照上述步驟進(jìn)行操作，測(cè)定各個(gè)反應(yīng)液的熒光光譜，如圖2(A)所示。計(jì)算其熒光改變值(F/Ffl)，即miR-141標(biāo)準(zhǔn)溶液在644nm處的熒光值(F)與空白樣本(不含有miR-141)在644nm處的熒光值(Ftl)的比值減1，然后根據(jù)miR-141標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和其熒光改變值(F/Ffl)制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖2(B)所示，miR-141標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對(duì)數(shù)值與其熒光改變值(FAVl)在IaM InM范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為Y =
10.57+1. 251gX。圖3所示為該本發(fā)明方法的特異性實(shí)驗(yàn)，選取miR-429，miR_200b，let_7d，miR-21作為miR-141對(duì)照樣本(檢測(cè)濃度為IpM)，以及空白樣本(不含有miR-141，即miR-141 濃度為 0)，miR-429 序列為 5’ -UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3’，miR-200b 序列為5’ -UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3’，let_7d 序列為 5’ -AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3’，miR_21序列為5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’，如圖3(A)為各個(gè)靶標(biāo)反應(yīng)液的熒光光譜，如圖3(B)為各個(gè)靶標(biāo)反應(yīng)液的熒光改變值(F/Ffl)的柱狀圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法特異性強(qiáng)。實(shí)施實(shí)例2 利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)miR-21 (5 ’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3，)的分析方法，檢測(cè)原理如附圖4所示。采用VentR (exo-) DNA聚合酶和Nt. BstNBI核酸內(nèi)切酶。DNA擴(kuò)增模板上的序列排布為靶標(biāo)miR-21結(jié)合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3，)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3，)，miR-21結(jié)合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3’)，以及合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，3’端磷酸化。下面對(duì)miR-21檢測(cè)的具體實(shí)施來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。其中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件。本發(fā)明中的室溫是指進(jìn)行實(shí)施操作的實(shí)驗(yàn)室溫度23 28°C。具體操作步驟如下在4 μ LDNA擴(kuò)增模板溶液(200ηΜ)中加入I μ L靶標(biāo)miR-21溶液，反應(yīng)緩沖溶液為25mMTris_HN03，50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，O. 5mM 二硫蘇糖醇，pH為7.9。于88°C孵育10分鐘后，然后加入恒溫?cái)U(kuò)增混合液5 μ L，包括VentR (exo-) DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nt. BstNBI 核酸內(nèi)切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制劑(O. 8Uμ Γ1)和dNTP (250 μ Μ)，反應(yīng)緩沖液為IOmM硝酸鈉、20mM硝酸銨、20mMTris-HN03、2mM硝酸鎂和0.1% Triton X-100，pH為8. 8。于53°C孵育反應(yīng)50分鐘，然后于90°C孵育5分鐘終止反應(yīng)。向上述反應(yīng)液中加入8 μ L硝酸銀溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L檸檬酸鈉緩沖溶液(20mM, pH 7. O)，震蕩混勻后，12，000轉(zhuǎn)離心10分鐘后取上清溶液，于黑暗中放置15分鐘后，加入新鮮配制的I μ L硼氫化鈉(3. 6mM)溶液，混勻，于黑暗中放置I小時(shí)，測(cè)定溶液的 突光信號(hào)。工作曲線的制作分別準(zhǔn)備已知濃度的miR-21標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白樣本(不含有miR-21,即miR-21濃度為O)，按照上述步驟進(jìn)行操作，測(cè)定各個(gè)反應(yīng)液的熒光光譜，計(jì)算其熒光改變值(F/Ffl)，即miR-21標(biāo)準(zhǔn)溶液在644nm處的熒光值與空白樣本在644nm處的熒光值的比值減I，然后根據(jù)miR-21標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和其熒光改變值(F/Ffl)制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。實(shí)施實(shí)例3 利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)I et_7a (5 ’ -UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’ )的分析方法，檢測(cè)原理如附圖5所示。采用phi29DNA聚合酶和Nb. BbvCI核酸內(nèi)切酶。DNA擴(kuò)增模板上的序列排布為靶標(biāo)let-7a結(jié)合序列(5，-AACTATACAACCTACTACCTCA-3’ ) ,Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3’ )，let_7a 結(jié)合序列(5，-AACTATACAACCTACTACCTCA-3’)，Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3’)，以及合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，3’端磷酸化。下面對(duì)let_7a檢測(cè)的具體實(shí)施來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。其中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件。本發(fā)明中的室溫是指進(jìn)行實(shí)施操作的實(shí)驗(yàn)室溫度23 28V。具體操作步驟如下在4μ L DNA擴(kuò)增模板溶液(200ηΜ)中加入I μ L靶標(biāo)let-7a溶液，反應(yīng)緩沖溶液為25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，O. 5mM 二硫蘇糖醇，pH為7. 9。于88°C孵育10分鐘后，然后加入恒溫?cái)U(kuò)增混合液5 μ L，包括phi29DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nb. BbvCI 核酸內(nèi)切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制劑(O. 8Uμ Γ1)和 dNTP (250 μ Μ)，反應(yīng)緩沖液為 IOmM 硝酸鈉、20mM 硝酸銨、20mM TriS-HNO3>2mM 硝酸鎂和O. 1% Triton X-100，pH為8. 8。于37°C孵育反應(yīng)50分鐘，然后于90°C孵育5分鐘終止反應(yīng)。向上述反應(yīng)液中加入8 μ L硝酸銀溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L檸檬酸鈉緩沖溶液(20mM，pH 7. O)，震蕩混勻后，12，000轉(zhuǎn)離心10分鐘后取上清溶液，于黑暗中放置15分鐘后，加入新鮮配制的I μ L硼氫化鈉(3. 6mM)溶液,混勻，于黑暗中放置I小時(shí)，測(cè)定溶液的突光信號(hào)。工作曲線的制作分別準(zhǔn)備已知濃度的let_7a標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白樣本(不含有l(wèi)et-7a,即let_7a濃度為0)，按照上述步驟進(jìn)行操作，測(cè)定各個(gè)反應(yīng)液的熒光光譜，計(jì)算其熒光改變值(F/Ffl)，即let-7a標(biāo)準(zhǔn)溶液在644nm處的熒光值與空白樣本在644nm處的熒光值的比值減1，然后根據(jù)let-7a標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和其熒光改變值(F/F^l)制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。實(shí)施實(shí)例4 利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)miR-646 (5’-AAGCAGCUGC⑶⑶GAGGC-3’)的分析方法，檢測(cè)原理如附圖6所示。采用phi29DNA聚合酶和Nb. BbvCI核酸內(nèi)切酶。DNA擴(kuò)增模板上的序列排布為靶標(biāo)miR-646結(jié)合序列(5’-GCCTCAGAGGCAGCTGCTT-3’)，Nb. BbvCI酶切序列(5’ -GCTGAGG-3’)，合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5，-GGGTGGGTGGGCGGGTT-3’ )，Nb. BbvCI 酶切序列(5，-GCTGAGG-3’ )，以及合成熒光納米 銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’ -GGGTGGGTGGGCGGGTT-3’)，3’端磷酸化。下面對(duì)miR-646檢測(cè)的具體實(shí)施來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。其中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件。本發(fā)明中的室溫是指進(jìn)行實(shí)施操作的實(shí)驗(yàn)室溫度23 28°C。具體操作步驟如下在4 μ LDNA擴(kuò)增模板溶液(200ηΜ)中加入I μ L靶標(biāo)miR-646溶液，反應(yīng)緩沖溶液為25mMTris_HN03，50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，
O.5mM 二硫蘇糖醇，pH為7. 9。于88°C孵育10分鐘后，然后加入恒溫?cái)U(kuò)增混合液5 μ L，包括 phi29DNA 聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nb. BbvCI 核酸內(nèi)切酶(O. 4U μ L-1) ,RNase 抑制劑(O. 8Uμ Γ1)和dNTP (250 μ Μ)，反應(yīng)緩沖液為IOmM硝酸鈉、20mM硝酸銨、20mMTris-HN03、2mM硝酸鎂和0.1% Triton X-100，pH為8. 8。于37°C孵育反應(yīng)50分鐘，然后于90°C孵育5分鐘終止反應(yīng)。向上述反應(yīng)液中加入8 μ L硝酸銀溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L檸檬酸鈉緩沖溶液(20mM, pH 7. O)，震蕩混勻后，12，000轉(zhuǎn)離心10分鐘后取上清溶液，于黑暗中放置15分鐘后，加入新鮮配制的I μ L硼氫化鈉(3. 6mM)溶液，混勻，于黑暗中放置I小時(shí)，測(cè)定溶液的突光信號(hào)。工作曲線的制作分別準(zhǔn)備已知濃度的miR-646標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白樣本(不含有miR-646,即miR-646濃度為O)，按照上述步驟進(jìn)行操作，測(cè)定各個(gè)反應(yīng)液的熒光光譜，計(jì)算其熒光改變值(F/Ffl)，即miR-646標(biāo)準(zhǔn)溶液在644nm處的熒光值與空白樣本在644nm處的熒光值的比值減I，然后根據(jù)miR-646標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和其熒光改變值(F/F^l)制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。實(shí)施實(shí)例5 利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針多重檢測(cè)miR-141 (5’ -UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’ )和 miR-21 (5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’ )的分析方法，檢測(cè)原理如附圖7所示。采用VentR (exo-)DNA聚合酶和Nt. BstNBI核酸內(nèi)切酶。DNA擴(kuò)增模板I上的序列排布為靶標(biāo) miR-141 結(jié)合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’ )，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-TCTTGACTC-3，)，miR-141 結(jié)合序列(5，-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’ )，Nt. BstNBI酶切序列(5，-TCTTGACTC-3’)，以及合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5’ -TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，3’端磷酸化。DNA擴(kuò)增模板2上的序列排布為革巴標(biāo) miR-21 結(jié)合序列(5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’)，Nt. BstNBI 酶切序列(5，-ACGTGACTC-3’)，miR-21 結(jié)合序列(5’ -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’)，Nt. B stNBI酶切序列(5’ -ACGTGACTC-3’)，以及合成熒光納米銀簇的DNA互補(bǔ)序列(5，-TTGGGCGGGTGGGTGGG-3’)，3’ 端磷酸化。下面對(duì)miR-141、miR-21檢測(cè)的具體實(shí)施來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。其中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件。本發(fā)明中的室溫是指進(jìn)行實(shí)施操作的實(shí)驗(yàn)室溫度23 28°C。具體操作步驟如下在4 μ LDNA擴(kuò)增模板I和DNA擴(kuò)增模板2的混合溶液(各200ηΜ)中加入I μ L靶標(biāo)miR-141或者miR-21或者二者的混合溶液，反應(yīng)緩沖溶液為25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，O. 5mM 二硫蘇糖醇，pH為7. 9。于88°C孵育10分鐘后，然后加入恒溫?cái)U(kuò)增混合液5 μ L,包括VentR (exo-)DNA聚合酶(O. 05U μ Γ1)、Nt. BstNBI 核酸內(nèi)切酶(O. 4U μ Γ1)、RNase 抑制劑(O. 8U μ Γ1)和dNTP (250 μ Μ)，反應(yīng)緩沖液為IOmM硝酸鈉、20mM硝酸銨、20mMTriS-HNO3、2mM硝酸鎂和 O.1% Triton X-100，pH為8. 8。于53°C孵育反應(yīng)50分鐘，然后于90°C孵育5分鐘終止反應(yīng)。上述反應(yīng)液中加入8 μ L硝酸銀溶液(497. 5 μ Μ)和100 μ L檸檬酸鈉緩沖溶液(20mM，pH 7. O)，震蕩混勻后，12，000轉(zhuǎn)離心10分鐘后取上清溶液，于黑暗中放置15分鐘后，加入新鮮配制的I μ L硼氫化鈉(3. 6mM)溶液,混勻，于黑暗中放置I小時(shí)，測(cè)定溶液的熒光信號(hào)。工作曲線的制作分別準(zhǔn)備已知濃度的miR-141和miR-21標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白樣本(不含有miR-141和miR-21)，按照上述步驟進(jìn)行操作，測(cè)定各個(gè)反應(yīng)液的熒光光譜，計(jì)算其熒光改變值(F/Ffl)，即miR-141標(biāo)準(zhǔn)溶液在其特征性發(fā)射峰644nm處的熒光值與空白樣本在644nm處的熒光值的比值減1，miR-21標(biāo)準(zhǔn)溶液在其特征性發(fā)射峰625nm處的熒光值與空白樣本在625nm處的熒光值的比值減I，然后根據(jù)miR-141和miR-21標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和其熒光改變值(F/Ffl)分別制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
權(quán)利要求
1.一種利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針檢測(cè)HiiCT0RNA的分析方法，其特征在于，利用IESmicroRNA與DNA擴(kuò)增模板結(jié)合后,誘導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)和nicking核酸內(nèi)切酶特異性的酶切反應(yīng)得到大量單鏈DNA產(chǎn)物，該單鏈DNA產(chǎn)物與加入的硝酸銀溶液在硼氫化鈉還原作用下制備熒光納米銀簇探針，測(cè)定反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)并計(jì)算熒光信號(hào)改變值，與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線比對(duì)，推算出祀標(biāo)microRNA的濃度。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述熒光納米銀簇探針粒徑為I 10nm，激發(fā)波長(zhǎng)為500 680nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 900nm。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的靶標(biāo)microRNA檢測(cè)包括以下操作步驟 步驟I將靶標(biāo)microRNA加入到DNA擴(kuò)增模板溶液中，進(jìn)行孵育反應(yīng)； 步驟2向步驟I中所得的反應(yīng)液中加入恒溫?cái)U(kuò)增混合液，孵育反應(yīng)后，熱失活酶，終止反應(yīng); 步驟3向步驟2中所得的反應(yīng)液中加入硝酸銀溶液，混勻后，離心取上清，然后加入硝酸銀溶液和新鮮配制的硼氫化鈉溶液，在黑暗中反應(yīng)合成熒光納米銀簇； 步驟4測(cè)定步驟3中所得的熒光納米銀簇溶液的熒光信號(hào)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟I中靶標(biāo)microRNA來(lái)自于組織、血液或細(xì)胞的生物樣本。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟I中的孵育反應(yīng)在37°C 55°C和反應(yīng)緩沖溶液中，步驟I中的DNA擴(kuò)增模板反應(yīng)液和靶標(biāo)microRNA的體積比為O. I 10，反應(yīng)時(shí)間為5 50分鐘，所述的DNA擴(kuò)增模板濃度為10 800nM ;所述的靶標(biāo)microRNA濃度為IaM IOOnM ;所述的DNA擴(kuò)增模板和靶標(biāo)microRNA所述的DNA擴(kuò)增模板含有三種功能序列與靶標(biāo)microRNA結(jié)合序列，nicking核酸內(nèi)切酶酶切序列和合成熒光納米簇的DNA互補(bǔ)序列，所述的反應(yīng)緩沖溶液為25mM Tris-HNO3, 50mM硝酸鈉，5mM硝酸鎂，0. 5mM 二硫蘇糖醇和pH為6. O 8. 9。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟2的孵育反應(yīng)是在35°C 55°C和反應(yīng)緩沖液中，步驟I所得的反應(yīng)液和恒溫?cái)U(kuò)增混合液體積比為0. I 10，反應(yīng)20 200分鐘，恒溫?cái)U(kuò)增混合液中含有恒溫聚合酶、nicking核酸內(nèi)切酶、RNase抑制劑和dNTP ;所述的恒溫聚合酶濃度為Ο.Ο υμΙ^-Ι.Ου μ L'nicking核酸內(nèi)切酶濃度為0. IU μ L—1 I. OUμ ΙΛ RNase抑制劑濃度為0. IU μ Γ1 I. OU μ Λ dNTP溶液濃度為80 500 μ M ;所述的反應(yīng)緩沖液為IOmM硝酸鈉、20mM硝酸銨、20mM 1^8-順03、21111硝酸鎂和0. I % TritonX-IOO和pH為6. O 8. 9。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述恒溫聚合酶為商品化的VentR (exo-)DNA聚合酶、phi29DNA聚合酶或Klenow Fragment聚合酶。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述nicking核酸內(nèi)切酶為商品化的Nt. CviPII、Nb. BbvCI、Nb. BtsI、Nt. BsmAI、Nt. BbvCI、Nt. BspQI、Nt. AlwI 或 Nt. BstNBI。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟3中硝酸銀濃度為10 800μ Μ，硼氫化鈉溶液為新鮮配制，其濃度為10μΜ IOmM,反應(yīng)溫度為25°C 55°C,反應(yīng)時(shí)間為20 120分鐘。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，是由已知濃度的靶標(biāo)microRNA的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述操作步驟反應(yīng)后，測(cè)定反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)并計(jì)算熒光改變值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 溶液中microRNA的濃度和體系中熒光改變值制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)合成熒光納米銀簇探針定量檢測(cè)microRNA的分析方法。該方法是，設(shè)計(jì)一條含有三種功能序列的DNA擴(kuò)增模板與靶標(biāo)microRNA結(jié)合序列，nicking核酸內(nèi)切酶酶切序列和合成熒光納米簇的DNA互補(bǔ)序列。當(dāng)靶標(biāo)microRNA與DNA擴(kuò)增模板結(jié)合后，誘導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)和nicking核酸內(nèi)切酶特異性的酶切反應(yīng)，得到大量單鏈DNA產(chǎn)物，其中合成熒光納米銀簇的DNA序列與硝酸銀溶液在硼氫化鈉的還原作用下制備熒光納米銀簇探針，測(cè)定反應(yīng)體系的熒光信號(hào)并計(jì)算熒光改變值，與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線比對(duì)，推算出靶標(biāo)microRNA的濃度。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性檢測(cè)范圍寬、背景信號(hào)低、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于組織，血液或細(xì)胞的生物樣本中microRNA檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102719526SQ20121010745
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者劉玉強(qiáng), 葉邦策, 尹斌成 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)