專利名稱：一種突變的中性植酸酶及其基因和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶的基因工程和酶生化工程領(lǐng)域。本發(fā)明涉及活性提高的突變中性植酸酶，本發(fā)明還涉及編碼該突變中性植酸酶的基因及用途。
背景技術(shù)：
磷是動(dòng)物必需的ー種常量礦物元素，磷的添加對(duì)配合飼料生產(chǎn)成本及產(chǎn)品質(zhì)量有重要影響。植酸酶(phytase)即肌醇六磷酸酶(myo-inositol hexaphosphatephosphohydrotase)是催化植酸及其植酸鹽水解產(chǎn)生肌醇和磷酸(或者磷酸鹽)這類酶的總稱。添加植酸酶能夠顯著提高植物性飼料中磷的利用率，減少飼料中無(wú)機(jī)磷的添加量以及動(dòng)物糞便中無(wú)機(jī)磷的排出，減輕環(huán)境的磷污染，提高畜牧生產(chǎn)和生態(tài)效益。目前從微生物中獲得植酸酶的報(bào)道有以下三種⑴來(lái)源于大腸桿菌的雙功能酶(appA)，它具有植酸酶和磷酸酶的功能，但只在酸性條件下表現(xiàn)出強(qiáng)的植酸酶活性；(2)來(lái)源于黑曲霉的酸性植酸酶(PhyA)具有較高的活性，其酶促反應(yīng)的pH有效范圍在4. 5-6.0之間，適用于胃呈酸性的單胃動(dòng)物及少數(shù)魚類；(3)來(lái)源于芽孢桿菌的中性植酸酶(PhyC)，最適酶促反應(yīng)PH在7. 0-7. 5之間適用于消化道為中性的鯉科魚類，可有效彌補(bǔ)酸性植酸酶的不足。國(guó)內(nèi)外科研人員對(duì)中性植酸酶的研究主要集中于產(chǎn)酶菌篩選和基因工程菌的構(gòu)建方面。姚斌等從枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中克隆了中性植酸酶基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有生物學(xué)功能但比活較原始酶下降了 30% (姚斌，袁鐵錚，王元火，等.來(lái)源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大腸桿菌的表達(dá).生物工程學(xué)報(bào)，2001，17(1) :11-15)。陳艷等(陳艷，孫健義，趙學(xué)新，等.Bacillusamyloliquegaciens中性植酸酶基因的原核表達(dá)及蛋白純化和性質(zhì).食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005,24(2) :60-65.)將來(lái)源于淀粉液化芽孢桿菌的植酸酶在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因工程菌的植酸酶活性僅為出發(fā)菌株的I. 27倍，表達(dá)重組酶活性偏低。近年來(lái)，Rao %= (Rao DE, Rao KV, Reddy VD. Cloning and expression of Bacillus phytasegene (phy)in Escherichia coli and recovery of active enzyme from the inclusionbodies. Journal of Applied Microbiology. 2008,105 (3) :1128-1137.)在大腸桿菌中對(duì)芽孢桿菌中性植酸酶進(jìn)行了高效表達(dá)，結(jié)果表明其最適PH為7. O,最適溫度55°C，最大活性 16U/mg。Tung 等(Tung ET,Ma HW,Cheng C,et al. Stabilization of beta-propellerphytase by introducing Xaa—>Pro and bly—>Ala substitutions at consensuspositions. Protein Pept. Lett.，2008,15, 297-299.)運(yùn)用定點(diǎn)突變方法對(duì) BacillusIicheniformis植酸酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了改善,取得了較好的效果。定點(diǎn)突變結(jié)果表明，突變酶G117A/G266A與野生酶具有類似的米氏常數(shù)Km，催化效率keat和最適的Ca2+濃度，但是熱穩(wěn)定性有大幅上升。 定點(diǎn)突變是蛋白質(zhì)工程廣泛采用的技術(shù)，它是根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)理等信息，在基因水平進(jìn)行核苷酸突變，以達(dá)到改造酶分子中特定氨基酸殘基的目的，使酶的性質(zhì)最佳化。利用生物信息工具進(jìn)行蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)，并結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)提高淀粉液化芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061中性植酸酶的活性，尚未見(jiàn)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種突變的中性植酸酶，該突變的中性植酸酶與野生酶相比，在pH6. O 7. 5下活性增加25-35% ο本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供編碼上述突變中性植酸酶的基因(核苷酸序列)，該突變的中性植酸酶基因可用于構(gòu)建重組菌。本發(fā)明的再ー個(gè)目的是提供上述突變中性植酸酶的生產(chǎn)方法。
上述突變中性植酸酶核苷酸序列與野生酶核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)為HM747163)相比，第148位的編碼天冬氨酸的密碼子突變?yōu)榫幋a谷氨酸的密碼子。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施達(dá)到編碼權(quán)利要求I所述的突變中性植酸酶的核苷酸序列(即對(duì)應(yīng)野生型中性植酸酶氨基酸序列第148位的天冬氨酸密碼子突變?yōu)楸磉_(dá)谷氨酸的密碼子)，如SEQ ID NO. I所述。一種突變的中性植酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。該序列表示原中性植酸酶氨基酸序列(即野生型淀粉液化芽抱桿菌Bacillus amyIoliquefaciens DSM 1061PhyC基因所表達(dá)的氨基酸序列)的148位的天冬氨酸殘基被谷氨酸殘基所取代。含有上述核苷酸序列的表達(dá)載體。如質(zhì)粒等。用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)目的蛋白，表達(dá)產(chǎn)物利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠進(jìn)行親和純化。所述的突變中性植酸酶在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所提供的中性植酸酶與野生酶相比，活性顯著提高。本發(fā)明還提供了該突變中性植酸酶的基因序列，這些序列可用于構(gòu)建表達(dá)高活性中性植酸酶的重組菌。本發(fā)明還提供了所述的突變中性植酸酶的生產(chǎn)方法。本發(fā)明涉及的中性植酸酶可以作為一種飼料添加劑，能有效提高動(dòng)物對(duì)飼料中磷元素的利用率。


圖I表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖2突變酶表達(dá)及純化結(jié)果SDS-PAGE分析。圖3不同溫度下野生酶及突變酶活性比較。圖4不同pH下野生酶及突變酶活性比較。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步的闡述，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例I :淀粉液化芽抱桿菌 Bacillus amyIoliquefaciens DSM 1061 phyC 基因的獲得及第148位氨基酸殘基的突變
淀粉液化芽抱桿 菌Bacillus amyIoliquefaciens DSM 1061 從德國(guó) DSMZ 購(gòu)得。培養(yǎng)基的制備蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，121 °C，高壓蒸汽滅菌15min。菌體的收集將Bacillus amy Io liquefaciens DSM 1061接種到上述培養(yǎng)基中，置37°C搖床，180r · mirT1培養(yǎng)過(guò)夜，8000r · min'fC,離心15min，收集菌體。目的基因的提取采用改良的的酚-氯仿抽提法獲取Bacillusamyloliquefaciens DSM 1061的基因組，以該基因組為模版，使用如下PCR引物(由生エ生物工程(上海)公司合成)phyC-F:5，-GCGGATCC ATGAATCATTCAAAAACAC-3，(SEQ ID NO. 3)phyC-R:5，-GTC AAGCTT TTATTTTCCGCTTCTGTC-3’ (SEQ ID NO. 4)運(yùn)用Bio basic INC公司的PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。PCR循環(huán)參數(shù)94°C,3min ；94°C, Imin ；56°C, Imin ；72°C, Imin ;共進(jìn)行 36 個(gè)循環(huán)。Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 phyC基因的也可以通過(guò)基因的全序列合成獲得，如委托生エ生物工程(上海)有限公司按照Bacillus amyloliquefaciens DSM1061 phyC基因序列(GenBank登錄號(hào)為HM747163)進(jìn)行合成，合成的基因同樣可用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建。采用生エ生物工程(上海)有限公司的膠回收試劑盒將目的基因片段進(jìn)行純化。將純化的基因或者全合成的基因與pET22b(+)(美國(guó)Novagen公司)進(jìn)行常規(guī)的連接反應(yīng)，將連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5CI進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增。運(yùn)用質(zhì)粒提取試劑盒(Bio basic INC公司)，提取質(zhì)粒。運(yùn)用上述的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增鑒定確定插入的phyC基因，得到陽(yáng)性重組pET-phyC質(zhì)粒。根據(jù)Stratagene公司的Quik-Change多重定點(diǎn)突變?cè)噭┖械囊?設(shè)計(jì)如下引物5’ -ACAGATCCAGAACATCCGATTGCA-3’，以 pET-phyC 質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR，將 Aspl48 突變?yōu)镚lul48，用限制性內(nèi)切酶消化原始質(zhì)粒模板，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化高效率的感受細(xì)胞，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，即可得到含有突變基因(SEQ ID NO. I)的質(zhì)粒pET-phyC-D148E。實(shí)施例2 :表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選和鑒定為構(gòu)建植酸酶基因的高效表達(dá)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物刪除了該酶N端的26位氨基酸殘基構(gòu)成的信號(hào)肽部分。引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5· O軟件，在引物中分別引入限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII (加粗下劃線部分)，由生エ生物工程(上海)有限公司合成。引物如下phyC-F:5，-GC GGATCC' GAAGCATAAGCTGTCAGA-3J (SEQ ID NO. 5)phyC-R:5，-GTC Μ^￡ Γ TTTTCCGCTTCTGTC-3’ (SEQ ID NO. 6)以獲得的phyC全長(zhǎng)基因?yàn)槟０錚CR的反應(yīng)參數(shù)為94°C，lmin ；56°C,lmin ；72°C,Imin ;共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物和pET22b (+)載體分別用BamH I和Hind III消化并連接，構(gòu)建質(zhì)粒pET22b-phyC-D148E。連接液轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，提取質(zhì)粒并送生エ生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例3 :中性植酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)鑒定后的pET22b-phyC_D148E重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E. coli BL21 (DE3)中，同時(shí)將空載體pET22b(+)轉(zhuǎn)入相同宿主作為對(duì)照。各取100 μ L轉(zhuǎn)化液分別涂布于含Amp(100yg/mL)的LB平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)成大小合適的菌落。挑取含有重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別接種至含100 μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)液，置搖床37°C，180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1%接種量(V/V)轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)液中，37°C，180r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD6tltlたO. 6-0. 8)分別加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度I. Ommol/L，置20°C搖床，180r/min誘導(dǎo)表達(dá)6h。實(shí)施例4 :中性植酸酶的純化 取適量按實(shí)施例3方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌培養(yǎng)液,8000r/min離心15min收集菌體，用無(wú)菌水洗滌兩次后，菌體重懸于O. 5mL(pH 7. 5, 50mmol/L) Tris-HCl緩沖液中，冰浴中超聲破碎細(xì)胞。將超聲破碎后的樣品12000r/min，4°C離心IOmin取上清即為粗酶液。由于設(shè)計(jì)的pET22b-phyC_D148E表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物中性植酸酶上帶有6個(gè)連續(xù)的組氨酸，可以通過(guò)金屬離子層析柱(Ni-NTA瓊脂糖凝膠)親和純化。超聲波破碎誘導(dǎo)后的菌體于12000r/min離心,去除細(xì)胞碎片。上清液采用康為世紀(jì)Ni-Agarose 6x His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒在4°C下進(jìn)行純化。將粗酶液負(fù)載上柱，流速為lmL/min ;采用15倍柱體積平衡液(pH7. 0，20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L 咪唑，O. 5mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫的除去雜蛋白，流速為lmL/min ;然后用8倍柱體積洗脫液(pH7. 0,20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L咪唑,0. 5mol/NaCl)收集目的蛋白，流速為lmL/min ;最后將目的蛋白置透析袋中除鹽,濃縮保存。實(shí)施例5 :中性植酸酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定中性植酸酶活性測(cè)定方法參考GB/T 18634-2009。取適量酶液，底物植酸鈉濃度為5. Ommol/L,反應(yīng)體系中 CaCl2 濃度為 lmmol/L,緩沖體系為 0. 25mol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)，反應(yīng)總體積為6mL。將上述混合物置37°C反應(yīng)30min，加入4mL顯色及終止液(體積比2:1: I的43%的硝酸溶液，100g/L鑰酸銨，2. 35g/L偏釩酸銨溶液)，置分光光度計(jì)波長(zhǎng)為415nm處測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量。酶活性単位(U)定義為在一定條件下，毎分鐘釋放出Iumol無(wú)機(jī)磷所需的酶量為ー個(gè)酶活性単位。(I)中性植酸酶最適溫度的測(cè)定將反應(yīng)混合物分別置于20で、30で、40で、50で、55°C、60°C、65°C、70°C和80°C下水浴反應(yīng)30min，加入4mL顯色及終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)酶活。溫度對(duì)野生植酸酶和突變植酸酶活性影響結(jié)果如圖3所示。溫度升高植酸酶的活性隨之增強(qiáng)，到60°C時(shí)酶活性最高，說(shuō)明該中性植酸酶最適反應(yīng)溫度為60°C。相同溫度下，突變酶的活性要比野生酶活性高出約25%。(2)中性植酸酶最適pH的測(cè)定配制不同pH的含有底物植酸鈉的溶液(pH3. O為甘氨酸-HCL 緩沖液，pH4. 0-pH6. 5 分別為 HAc-NaAc 緩沖液，pH7. 0_pH9. O 為 Tris-HCl 緩沖液；pH10. O為甘氨酸-NaOH緩沖液)。將反應(yīng)混合物置于60°C水浴反應(yīng)30min，加入4mL顯色及終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)酶活。PH對(duì)野生植酸酶和突變植酸酶活力影響結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明酶最適pH為7.0，在此條件下，突變植酸酶比活為21U/mg。在pH6. O 7. 5這ー較寬的范圍內(nèi)，酶活性均在最大活性的70%以上，pH在6. O 7. 5下，突變酶的活性要比野生酶活性高25-35%。
權(quán)利要求
1.一種突變的中性植酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
2.編碼權(quán)利要求I所示的突變中性植酸酶的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，如SEQID NO. I所示。
4.含有權(quán)利要求2所述的核苷酸序列的表達(dá)載體。
5.用權(quán)利要求4所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。
6.權(quán)利要求I所述的突變中性植酸酶在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)基因工程技術(shù)改造得到的一種突變的中性植酸酶及其基因和用途，該突變的中性植酸酶氨基酸序列為SEQ ID NO.2，是以野生型淀粉液化芽孢桿菌DSM 1061 phyC基因?yàn)榛A(chǔ)，利用PCR技術(shù)對(duì)其基因進(jìn)行點(diǎn)突變獲得的。本發(fā)明公開(kāi)了改造的中性植酸酶及其相應(yīng)的DNA序列，還公開(kāi)了所述中性植酸酶的生產(chǎn)方法。本發(fā)明所述的突變中性植酸酶與野生酶相比，在pH 6.0～7.5下活性高出25-35％。該中性植酸酶可作為一種飼料添加劑，能有效提高動(dòng)物對(duì)飼料中植酸磷的利用率。本發(fā)明所提供的突變中性植酸酶基因可用于構(gòu)建表達(dá)該酶的重組菌。
文檔編號(hào)C12N15/55GK102649950SQ20121010897
公開(kāi)日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者余曉紅, 許偉, 路國(guó)偉, 邵榮 申請(qǐng)人:鹽城工學(xué)院