專利名稱：一種檢測肺炎支原體的lamp試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種檢測肺炎支原體的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)試劑盒。
背景技術(shù)：
肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是引起人類呼吸道感染的重要病原菌，約10% 40%的社區(qū)獲得性肺炎(CAP)是由Mp感染引起的。嬰幼兒由于免疫功能相對低下，更容易引起重癥Mp感染，甚至引起肺炎支原體腦炎等嚴重感染。近幾年國內(nèi)報道的Mp感染引起的肺炎發(fā)病率比重不斷升高，給社會造成的疾病負擔日趨明顯。鑒于肺炎支原體分離培養(yǎng)困難，目前其檢測方法主要依靠血清學檢測和核酸檢測。由于血清學技術(shù)主要針對抗體進行檢測，有明顯的滯后性，且受個體免疫差異影響大，所以檢測靈敏度和特異度較差。隨著分子生物學的發(fā)展，目前已有多種PCR方法用于肺炎支原體的檢測，包括普通PCR，巢式PCR，熒光PCR等，這些雖在靈敏度方面有所改進，但由于核酸檢測需要較嚴格的檢測環(huán)境，需要精密儀器的配套使用，檢測費用較高，同樣也無法滿足基層和現(xiàn)場檢測的需求。環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)(loop-mediatedisotherm amplification,LAMP)是由Notomi于2000年開發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和兩對特殊的引物,特異地識別祀序列上的6個獨立區(qū)域,在等溫條件下(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)。近年來，國外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測。Hong TC等人(2004)根據(jù)LAMP的原理設(shè)計了實時定量LAMP方法，以快速檢測SARS-CoV，結(jié)果LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(2007)建立了快速診斷H5N1禽流感病毒的LAMP檢測體系。LAMP還可以檢測細菌、真菌等病原微生物，其靈敏度和特異性都有很好的體驗。但目前尚未見基于顏色判定的LAMP方法在肺炎支原體檢測中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于檢測肺炎支原體的特異性LAMP引物組。本發(fā)明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、可視化的、操作簡單的LAMP檢測試劑盒。本發(fā)明提供了一種用于檢測肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的祀序列，其具有SEQ ID NO. 5所示的序列或其特異性片段。本發(fā)明提供了用于擴增SEQ ID NO. 5所示靶序列的特異性引物組合。本發(fā)明提供了一種用于檢測肺炎支原體的特異性LAMP引物組合，包括以下4條引物F3 :5，-TCTTACCACTGTTAACGGCC-3，；
B3 :5， -CCGCTTTGGTCAACACATCA-3，；FIP :5’ -ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3’ ；BIP :5’ -AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAG CC-3，。本發(fā)明提供了上述引物組在制備肺炎支原體的檢測試劑盒或檢測試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種含有上述4條引物的檢測試劑。本發(fā)明提供了一種含有上述4條引物的肺炎支原體的LAMP檢測試劑盒。本發(fā)明的試劑盒還包含變色指示劑羥基萘酚藍(HNB)。本發(fā)明還提供了上述試劑盒在檢測肺炎支原體中的應(yīng)用。上述試劑盒在檢測肺炎支原體中的應(yīng)用中，25 ii L LAMP檢測體系的具體配置為IOmM dNTP 混合溶液 2. 5 ill，3mM 羥基萘酚藍 I yl，4M 甜菜堿 I yl，8U/ Bst 酶 I ，IOXBst buffer2. 5u I, IOu M F3 引物 0. 5 y 1，10 y M B3 引物 0. 5 y 1，100 y M FIP 引物
0.4u l,100uM BIP 引物 0. 4iil，150mM 硫酸鎂 liil，去核酸水 13. 2 yl，模板 I yl。進一步地，檢測反應(yīng)條件為63°C恒溫lh，85°C 3min，然后終止反應(yīng)。本發(fā)明試劑盒還包含陰性對照和陽性對照，所述陰性對照為去核酸水，所述陽性對照為肺炎支原體基因組DNA。每次檢測標本時必須設(shè)立NEG對照(陰性對照)和POS對照(陽性對照)，兩種對照對于結(jié)果判讀起決定性作用有效擴增NEG(_)和P0S(+)無效擴增NEG(+)和POS (+)提示體系污染無效擴增NEG(-)和POS (-)提示體系錯誤或者試劑失效。只有對照有效擴增情況下的樣品檢測結(jié)果才可信，否則試驗需要重復。結(jié)果判定方法為反應(yīng)結(jié)束后，肉眼直接觀測反應(yīng)管，深藍色體系為陰性結(jié)果(圖I右)，天藍色體系為陽性結(jié)果(圖I左)。本發(fā)明的肺炎支原體LAMP檢測試劑盒對20種呼吸道常見菌株進行檢測用于評價該試劑盒的特異性，同時對肺炎支原體進行檢測下限的確定。結(jié)果顯示，利用該方法檢測59株肺炎支原體均陽性，其余20種非肺炎支原體和人類染色體均擴增陰性，說明該方法的靈敏度、特異性良好，達100%。在對純菌檢測中，本發(fā)明LAMP試劑盒的最低檢測限為100個拷貝，說明本發(fā)明的檢測試劑盒具有很高的靈敏度。本發(fā)明提供的試劑盒使用顏色變化代替濁度變化判定結(jié)果，易于觀察；使用的變色指示劑為羥基萘酚藍(HNB)價格便宜，比使用熒光指示劑的LAMP反應(yīng)更加經(jīng)濟實惠；且變色指示劑HNB性質(zhì)穩(wěn)定，在反應(yīng)前添加，避免了熒光指示劑在檢測后打開反應(yīng)管添加，增加了污染的可能性。本發(fā)明LAMP檢測試劑盒檢測肺炎支原體整個試驗只需要Ih左右即可，相對于常規(guī)PCR反應(yīng)要2 4h才能完成檢測，大大縮短了檢測時間，本發(fā)明試劑盒可快速、靈敏地檢測出肺炎支原體，其操作簡單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于疾病監(jiān)測、現(xiàn)場應(yīng)急以及臨床標本的檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用。


圖I為體系檢測結(jié)果判定；體系檢測結(jié)果判定。反應(yīng)結(jié)束后肉眼根據(jù)體系顏色直接判定實驗結(jié)果，天藍色(左圖)為陽性，深藍色(右圖)為陰性。圖2為體系檢測限評價，以肺炎支原體標準菌株ATCC15531模板系列濃度梯度I拷貝/ U I-IO5拷貝/ U I為模板，每個濃度梯度取I U I檢測，其中0-2為深藍色,3-7為天藍色。0 :陰性對照；1 :1拷貝；2 :10拷貝；3 : IO2拷貝；4 : IO3拷貝；5 : IO4拷貝；6 : IO5拷貝；7 :陽性對照。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實施例I引物的設(shè)計本發(fā)明首先在國內(nèi)分離到60株肺炎支原體臨床株，并將這60株肺炎支原體的Pl基因全長進行擴增測序。通過對60株國內(nèi)肺炎支原體pi基因和NCBI數(shù)據(jù)庫已報道的pi基因序列比對，選取pi基因中最為保守的區(qū)域使用Primer Explorer V3軟件設(shè)計特異性引物。該保守區(qū)域的特異性靶序列如SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列。設(shè)計4條引物，包括兩條內(nèi)引物(FIP和BIP)和兩條外引物(F3和B3)，其核酸序列如下F3 :5， -TCTTACCACTGTTAACGGCC-3，；B3 :5， -CCGCTTTGGTCAACACATCA-3，；FIP :5，-ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3，；BIP :5，-AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3，。 實施例2肺炎支原體LAMP檢測方法的建立通過設(shè)置不同濃度的MgS04(150mM) 0 U 1,0. 5 U I, I U I, I. 5 U I, 2 U I ;不同濃度的甜菜堿(4M) 0u l,lu l,2u l,4u l,8u l,16u I ;以及實施例I得到的4個引物濃度，F(xiàn)IP/BIP 引物(IOOuM) 0. 2u 1,0. 4u 1,0. 8u I, I. 6u I ；F3/B3 引物(IOuM) 0. 5u I,l.Ou l,1.5u l,2.0u I0其它條件選擇實驗過程的優(yōu)選試驗條件。分別在不同的溫度(61°〇至65°0反應(yīng)lh，85°C 3min，終止反應(yīng)，由于在65°C反應(yīng)Ih的條件下擴增最快，優(yōu)選在此條件下進行反應(yīng)。在63°C反應(yīng)lh，85°C 3min，對不同濃度的MgSO4、Betaine和內(nèi)外引物濃度比例的反應(yīng)體系進行優(yōu)化反應(yīng)，最終通過對含有IO3拷貝的肺炎支原體標準菌株ATCC15531模板擴增效果作為反應(yīng)的最終濃度，結(jié)果為，F(xiàn)IP/BIP引物終濃度為I. 6uM，F(xiàn)3/B3引物終濃度為
0.2u MjMgSO4終濃度為6mM，甜菜堿終濃度為0. 16M時體系擴增效果最好，體系優(yōu)化可參見表I,表2。表ILAMP擴增體系硫酸鎂與甜菜堿試劑濃度優(yōu)化
硫酸鎂 MgSO4 (150mM)
0[jl 0.5[j,l I^il 1.5(^1 2\A 0[j,l - - - - - 甜菜減 I^il__-__±__+__±__-_
權(quán)利要求
1.一種用于檢測肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的祀序列,其具有SEQ ID NO. 5所示的序列或其特異性片段。
2.用于擴增權(quán)利要求I所述靶序列的特異性引物組合。
3.如權(quán)利要求2所述的特異性LAMP引物組合，包括以下4條引物F3 :5’ -TCTTACCACTGTTAACGGCC-3’ ；B3 :5’ -CCGCTTTGGTCAACACATCA-3’ ；FIP :5’ -ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3’ ；BIP :5’ -AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3’。
4.權(quán)利要求3所述的引物組在制備肺炎支原體的檢測試劑盒或檢測試劑中的應(yīng)用。
5.一種含有權(quán)利要求3所述引物組的檢測試劑。
6.一種含有權(quán)利要求3所述引物組的肺炎支原體的LAMP檢測試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包含變色指示劑羥基萘酚藍。
8.權(quán)利要求6或7所述的試劑盒在檢測肺炎支原體中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，25ii L LAMP檢測體系的具體配置為IOmMdNTP 混合溶液 2. 5iil，3mM 羥基萘酚藍 liil，4M 甜菜堿 liil，8U/iil Bst 酶 I yl，IOXBstbuffer2. 5u I, IOu M F3 引物 0. 5 y 1，10 y M B3 引物 0. 5 y 1，100 y M FIP 引物 0.4 yl，100 ii M BIP 引物 0. 4 iil，150mM 硫酸鎂 Iu I,去核酸水 13. 2u I,模板 Iul0
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，檢測反應(yīng)條件為63°C恒溫lh，85°C3min,然后終止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測肺炎支原體的LAMP試劑盒，所述試劑盒包含有4條LAMP引物，與LAMP反應(yīng)液一起構(gòu)成檢測體系，本發(fā)明的4條LAMP引物的核苷酸序列如SEQID No.1-4所示。本發(fā)明的試劑盒可快速、靈敏地檢測肺炎支原體，最低檢測限為100個拷貝。本發(fā)明試劑盒使用方法簡單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于疾病監(jiān)測、現(xiàn)場應(yīng)急以及臨床標本的檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用。
文檔編號C12R1/35GK102618655SQ201210112439
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者何利華, 孟凡亮, 張建中, 肖迪, 趙飛, 陶曉霞, 顧一心 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所