專利名稱：重組輪狀病毒vp6載體蛋白及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種載體蛋白，尤其是一種重組的輪狀病毒TB-Chen株VP6載體蛋白及其制備，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
輪狀病毒(Rotavirus，簡稱RV)是嬰幼兒腹瀉的主要病原體。世界范圍內(nèi)每年大約有60多萬例RV感染患者死亡，其中80%發(fā)生在發(fā)展中國家。RV屬呼腸病毒科(Meoviridae)，輪狀病毒屬(Motavirus\ RV基因組由11個片段的雙鏈RNA組成，分別編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4, VP6和VP7)和6個非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP5/NSP6)。

根據(jù)RV組(亞組)抗原蛋白VP6的抗原性的不同，可將至今已發(fā)現(xiàn)的輪狀病毒RV分為A G七個組，A組是嬰幼兒腹瀉的主要病原體。根據(jù)病毒蛋白編碼框(ORF)核苷酸序列同源性差異，可將A組輪狀病毒RV的12個蛋白(基因)分為不同的基因型。根據(jù)RV基因型分類標(biāo)準(zhǔn)，A組輪狀病毒RV的結(jié)構(gòu)蛋白VP6至少可分為16個基因型(11-116型)。VP6蛋白由第6基因片段編碼，含397個氨基酸，分子量約為44. 8KDa。VP6蛋白是輪狀病毒RV中含量最豐富的蛋白，約占病毒總蛋白量的51%。RV內(nèi)殼中間層由260個致密的VP6蛋白三聚體共780個蛋白分子構(gòu)成。VP6蛋白具有重要的生物學(xué)功能，是病毒基因組轉(zhuǎn)錄和病毒組裝不可缺少的成分。VP6蛋白也具有重要的免疫學(xué)性質(zhì)。近年進(jìn)行的VP6蛋白免疫學(xué)研究表明，一些抗VP6蛋白的IgA單克隆抗體諸如7D9所產(chǎn)生的IgA具有保護(hù)作用，在SCID鼠中可清除其慢性RV病毒感染。一些研究表明VP6蛋白的抗病毒作用可能是通過IgA的分泌途徑而阻礙了病毒的復(fù)制循環(huán)過程，或作為一種黏膜的分泌型IgAJf RV感染的上皮細(xì)胞排除，從而起到保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)VP6蛋白分子中至少存在兩個Th細(xì)胞抗原表位和一個交叉反應(yīng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位。有研究表明在使用麥芽糖結(jié)合VP6蛋白對小鼠進(jìn)行黏膜免疫后，IFN- Y被認(rèn)為是⑶4+T細(xì)胞分泌的唯一有效的抗RV的細(xì)胞因子。眾多的實驗表明，經(jīng)VP6蛋白免疫后，在動物體內(nèi)確實能引起抗RV感染的作用?？筕P6蛋白單克隆抗體具有抑制病毒轉(zhuǎn)錄活性和保護(hù)小鼠免受病毒感染的作用。用重組表達(dá)的VP6蛋白免疫小鼠，也可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。VP6蛋白可自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。由于VLPs沒有感染性，在研究細(xì)胞相互作用，開發(fā)診斷制劑和疫苗方面，具有更好的安全性。與單一分子的重組抗原相比，VLPs具有更好的免疫原性，可刺激機體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。由于VLPs具有高密度的呈遞抗原表位，可產(chǎn)生很強的免疫反應(yīng)，是許多疫苗研制中很有前景的材料。輪狀病毒TB-Chen株是從臨床胃腸炎患者中分離得到的公知輪狀病毒株，是我國第一株完成了全基因組分析的A組人輪狀病毒RV株,輪狀病毒TB-Chen株全稱為RVA/Human-wt/CHN/TB-Chen/1996/G2P[4]。這是一個公知的具有很好基礎(chǔ)研究和開發(fā)應(yīng)用價值的病毒株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組輪狀病毒VP6載體蛋白。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種重組輪狀病毒VP6載體蛋白的制備方法。本發(fā)明提供的是這樣一種重組輪狀病毒VP6載體蛋白，其特征在于重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因上有下列六個供外源抗原表位基因插入的限制性內(nèi)切酶位點Sac I(gagctc),BspT104 I (ttcgaa),Kpn I (ggtacc),Bln I (cctagg),Sac II (ccgcgg),XhoI (ctcgag)，其中:
重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的核苷酸序列如下
I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa
51aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
201aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
351aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa 501 tagatcacaa cctgcgcatg_agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcgaacat acagcaattt 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg 701 atggtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc 801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat 851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcRcaRcact CRaRcatcat 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac 1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg 1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg 1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa 重組輪狀病毒VP6載體蛋白由380個氨基酸組成，其氨基酸序列如下
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val lie Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys o 所述重組輪狀病毒VP6載體蛋白通過下列步驟構(gòu)建
1)根據(jù)輪狀病毒TB-Chen株VP6蛋白基因的核苷酸序列，人工設(shè)計下列引物對
P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；
P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；
P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；
P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；
P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；
P244R ；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；
P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；
P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；
P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ；
以及下列引物
PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；
PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT ；
2)以輪狀病毒TB-Chen株VP6蛋白編碼基因為模板，以下列為引物對，進(jìn)行PCR擴增 PETL5/P174R 和 P174F/PVP6-3 ；
PETL5/P197R 和 P197F/PVP6-3 ；
PETL5/P244R 和 P244F/PVP6-3 ；
PETL5/P275R 和 P275F/PVP6-3 ；
PETL5/P298R 和 P298F/PVP6-3 ；
PETL5/P308R 和 P308F/PVP6-3 ；PCR擴增反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)混合液體積為IOOy 1，其中，分別含有60pmol的上述各引物對，以及 30ng 模板 DNA，I X IO5 pmol 的 dNTPs，10 μ I 的 IOX PCR 緩沖液，5U Taq DNA聚合酶，其余用水補足；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3 min，94°C變性40s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸反應(yīng)lmin，共40個循環(huán)，最后72°C延伸10 min ;分別得到
帶有Sac I位點序列的PCR擴增片段6174F和6174R ;
帶有BspT104 I位點序列的PCR擴增片段6197F和6197R ；
帶有Kpn I位點序列的PCR擴增片段6244F和6624R ；
帶有Bln I位點序列的PCR擴增片段6275F和6275R ；
帶有Sac II位點序列的PCR擴增片段6298F和6298R ；
帶有Xho I位點序列的PCR擴增片段6308F和6308R ；
用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化上述六對擴增片段；
3)將步驟2)所得下列各擴增片段，按常規(guī)分別用下列對應(yīng)的內(nèi)切酶即內(nèi)切酶I/內(nèi)切酶II進(jìn)行雙酶切
帶有Sac I位點序列的PCR擴增片段6174F:Nde I/Sac I ；
帶有Sac I位點序列的PCR擴增片段6174R:Sac I/BamH I ；
帶有BspT104 I位點序列的PCR擴增片段6197F:Nde I/BspT104 I ；
帶有BspT104 I位點序列的PCR擴增片段6197R:BspT104 I/BamH I ；
帶有Kpn I位點序列的PCR擴增片段6244F:Nde I/Kpn I ；
帶有Kpn I位點序列的PCR擴增片段6624R:Kpn I/BamH I ；
帶有Bin I位點序列的PCR擴增片段6275F:Nde I/Bln I ；
帶有Bin I位點序列的PCR擴增片段6275R:Bln I/BamH I;
帶有Sac II位點序列的PCR擴增片段6298F:Nde I/Sac II;
帶有Sac II位點序列的PCR擴增片段6298R:Sac I I/BamH I;
帶有Xho I位點序列的PCR擴增片段6308F:Nde I/Xho I ；
帶有Xho I位點序列的PCR擴增片段6308R:Xho I/BamH I ；
酶切反應(yīng)體系為分別含有3μ I的上述各基因片段，以及3μ I的內(nèi)切酶I (15U)，3μ I的內(nèi)切酶II(15U)，和8μ I的IOX緩沖液及63 μ I的水；將各酶切混合液分別于37°C水浴反應(yīng)3小時后，得對應(yīng)的六個酶切片段，分別用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化六個酶切片段；
4)將步驟3)所得六個酶切片段對分別與T4DNA連接酶及緩沖液混合后，在18°C連接反應(yīng)6h,最終在同一個VP6蛋白上構(gòu)建出攜帶有Sac I (gagctc), BspT104 I (ttcgaa),Kpn I (RRtacc),Bln I (cctagg), Sac II (ccrcrr),Xho I (ctcRaR)六個酶切位點的 VP6載體蛋白編碼基因；
5)、將步驟4)得到的VP6載體蛋白編碼基因用常規(guī)的基因克隆和重組技術(shù)，連接到ρΕΤ表達(dá)質(zhì)粒DNA的Nde I/BamH I位點，得到攜帶VP6F載體蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒pET6F ;
6)按常規(guī)將步驟5)所得重組質(zhì)粒經(jīng)菌體轉(zhuǎn)化擴增后，進(jìn)行酶切鑒定和核苷酸序列測定，之后將重組質(zhì)粒PET6F在下列條件下分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞10 μ I重組質(zhì)粒pET6F與100 μ I BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰上放置30分鐘，42 °C放置70秒鐘，力口Λ 500 μ I的LB培養(yǎng)液后，在37 °C培養(yǎng)30分鐘；培養(yǎng)物涂在含200 μ g/ml氨芐青霉素的I.5%瓊脂培養(yǎng)板上,將培養(yǎng)板于37°C培養(yǎng)14個小時,挑取單個菌落放入含200 μ g/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)和表達(dá),得攜帶有Sac I (gagctc),BspT104 I (ttcgaa),Kpn I(ggtacc), Bln I (cctagg), Sac II (ccgcgg), Xho I (ctcgag) 6 個供外源抗原表位基因插入的限制性內(nèi)切酶位點的重組輪狀病毒VP6載體蛋白rVP6F。所述步驟2)的輪狀病毒TB-Chen株為公知的病毒株。所述步驟4)所得VP6F載體蛋白編碼基因由1146個核苷酸組成，前端為編碼蛋氨酸(M)的起始秘密子ATG，末端由2個終止密碼子(TGA TAA)組成。
所述步驟6)所得重組輪狀病毒VP6載體蛋白由380個氨基酸組成，分子量為43. 2Kd，其編碼基因由1146個核苷酸組成。本發(fā)明提供的帶有六個供外源抗原表位基因插入的限制性內(nèi)切酶位點的重組輪狀病毒VP6載體蛋白rVP6F，不影響VP6蛋白原有的分子結(jié)構(gòu)，保留了 VP6蛋白原有所有抗原表位，并都位于蛋白分子的表面，可最大限度的展示外源抗原表位免疫學(xué)性質(zhì)，以便將其他病毒的抗原表位插入本發(fā)明的重組輪狀病毒VP6載體蛋白中，從而構(gòu)建出輪狀病毒RV與其他病毒聯(lián)合重組的嵌合疫苗及試劑。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。實施例I
1)人工設(shè)計下列引物對
P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；
P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；
P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；
P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；
P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；
P244R ；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；
P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；
P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；
P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ；
以及下列引物
PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；
PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT ；
2)以輪狀病毒TB-Chen株VP6蛋白編碼基因為模板，以下列為引物對，進(jìn)行PCR擴增 PETL5/P174R 和 P174F/PVP6-3 ；
PETL5/P197R 和 P197F/PVP6-3 ；
PETL5/P244R 和 P244F/PVP6-3 ；
PETL5/P275R 和 P275F/PVP6-3 ；PETL5/P298R 和 P298F/PVP6-3 ；
PETL5/P308R 和 P308F/PVP6-3 ；
具體是
在PCR反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)混合液體積為100 μ I，包含30ng模板DNA，I X IO5 pmol的dNTPs, IOX PCR緩沖液 10μ 1，5U Taq DNA聚合酶，60pmol 的引物對PETL5/P174R和P174F/PVP6-3，其余用水補足；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3 min，94°C變性40s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸反應(yīng)lmin，共40個循環(huán)，最后72°C延伸10 min ;得到帶有NdeI和Sac I位點序列的PCR擴增片段6174F，和帶有Sac I和BamH I位點序列的PCR擴增片段6174R ;用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化該擴增片段；將PCR擴增片段6174F和6174R分別用Nde I/Sac I 和 Sac I/BamH I 雙酶切，即
A、6174F酶切片段制備酶切反應(yīng)體系為3μI的6174F片段，3 μ I的Nde I (15U)，3μ I的Sac I (15U),8y I的IOX緩沖液，63 μ I的水；將酶切混合液分別于37°C水浴反應(yīng)3小時后，得酶切片段，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化該酶切片段；
B、除使用SacI/BamH I雙酶切外，6174R酶切片段制備與6174F酶切片段相同；
C、酶切片段的連接將6174F和6174R酶切片段與T4DNA連接酶及緩沖液混合后，在18°C連接反應(yīng)6h，得到攜帶有Sac I位點(gagctc)的VP6編碼基因
3)運用步驟2)的PCR擴增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P197R和P197F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/BspT104 I和BspT104 I/BamH I，在步驟2)獲得的攜帶有Sac I位點的VP6編碼基因上插入BspT104 I (ttcgaa)位點，得到檇帶有Sac I位點和BspT104 I位點的VP6編碼基因；
4 )用與步驟2 )相同的PCR擴增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P244R和P244F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Kpn I和Kpn I/BamH I，在步驟3)所得攜帶有Sac I位點和BspT104 I位點的VP6編碼基因上插入Kpn I (ggtacc)位點，得到攜帶有Sac I位點、BspT104 I位點及Kpn I (ggtacc)位點的VP6編碼基因
5)用與步驟2)相同的PCR擴增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P275R和P275F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Bln I和Bin I/BamH I，在步驟4)所得攜帶有Sac I位點、BspT104 I位點及Kpn I (RRtacc)位點的VP6編碼基因上插入Bln I (cctaRR)位點，得至Ij攜帶有 Sac I 位點、BspT104 I 位點、Kpn I (RRtacc)位點及 Bln I (cctaRR)位點的 VP6編碼基因；
6 )用與步驟2 )相同的PCR擴增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P298R和P298F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Sac II和Sac I I/BamH I，在步驟5)所得攜帶有Sac I位點、BspT104 I位點、Kpn I (RRtacc)位點及Bln I (cctaRR)位點的VP6編碼基因上插入Sac II (ccrcrr)位點，得到攜帶有 Sac I 位點、BspT104 I 位點、Kpn I (RRtacc)位點、SacII (ccrcrr)位點及Sac II (ccrcrr)位點的VP6編碼基因:
7)、用與步驟2)相同的PCR擴增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P308R和P308F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Xho I和Xho I/BamH I，在步驟6)所得攜帶有Sac I位點、BspT104 I 位點、Kpn I (RRtacc)位點、Bln I (ccrcrr)位點及 Sac II (ccrcrr)位點的VP6編碼基因上插入Xho I (ctcgag)位點，得到攜帶有Sac I位點、BspT104 I位點、KpnI (RRtacc)位點、Bln I (ccrcrr)位點、Sac II (ccrcrr)位點及 Xho I (ctcRaR)位點的VP6載體蛋白編碼基因，該VP6F載體蛋白編碼基因由1146個核苷酸組成，前端為編碼蛋氨酸(M)的起始秘密子ATG，末端由2個終止密碼子(TGA TAA)組成，其核苷酸序列為
I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa
51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg
201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag
351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa 501 tagatcacaa cctgcgcatg agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcgaacat acagcaattt 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg 701 atggtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc 801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat 851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcRcaRcact CRaRcatcat 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac 1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg 1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg 1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
8)、將步驟7)得到的VP6載體蛋白編碼基因用常規(guī)的基因克隆和重組技術(shù)，連接到ρΕΤ表達(dá)質(zhì)粒DNA的Nde I/BamH I位點，得到攜帶VP6F載體蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒pET6F ；
9)按常規(guī)將步驟8)所得重組質(zhì)粒經(jīng)菌體轉(zhuǎn)化擴增后，進(jìn)行酶切鑒定和核苷酸序列測定，之后將重組質(zhì)粒PET6F在下列條件下分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞10 μ I重組質(zhì)粒pET6F與100 μ I BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞混勻，并上放置30分鐘，轉(zhuǎn)42 °C放置70秒鐘，加入500 μ I LB培養(yǎng)液后，在37°C培養(yǎng)30分鐘；培養(yǎng)物涂含200 μ g/ml氨芐青霉素的I. 5%瓊脂培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板于37°C培養(yǎng)14個小時，挑取單個菌落放入含200 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)和表達(dá)，得重組輪狀病毒VP6載體蛋白rVP6F，該重組輪狀病毒VP6載體蛋白rVP6F由380個氨基酸組成，其氨基酸序列如下
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys o本發(fā)明所得重組輪狀病毒VP6載體蛋白rVP6F，經(jīng)下列免疫學(xué)Western Blot檢 測
1)將重組輪狀病毒VP6載體蛋白rVP6F，用作對照的重組輪狀病毒NSP2蛋白，用作對照的牛血清白蛋白，各取2yg，分別溶于20μ I水，分別加入5μ I 5Χ變性緩沖液，混勻，在100°C 變性 5min ；
2)將I)的變性蛋白樣品用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%SDS-PAGE)分離，并在電壓15V、電流50mA的條件下，電泳轉(zhuǎn)印25 min,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜置于含5%脫脂奶粉的PBS/T液中于4° C封閉過夜；
3)用PBS/T洗膜5次，分別加入抗輪狀病毒全病毒豚鼠免疫血清抗體(1%脫脂奶粉1:400稀釋)，抗重組輪狀病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗體(1%脫脂奶粉1:400稀釋)，抗重組輪狀病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗體(1%脫脂奶粉1:400稀釋)，于37°C孵育I. 5 h ;用PBS/T液洗膜5次，每次5 min ；
4)加入HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG(1:2，000如上稀釋)/ HRP標(biāo)記的兔抗人IgG (1:800如上稀釋)，37°C孵育I h;PBS/T漂洗5次，DAB顯色；顯色后，蒸餾水漂洗膜，終止顯色，觀察并分析結(jié)果如下
重組VP6載體蛋白rVP6F能與抗輪狀病毒全病毒豚鼠免疫血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。重組VP6載體蛋白rVP6F能與抗重組輪狀病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。重組VP6載體蛋白不能與抗重組輪狀病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。用重組VP6載體蛋白rVP6F按常規(guī)免疫豚鼠得到的血清抗體，能與輪狀病毒全病毒中的VP6蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。用重組VP6載體蛋白rVP6F免疫得到的豚鼠免疫血清抗體，能與重組輪狀病毒VP6蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)?？怪亟M輪狀病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗體只與重組輪狀病毒NSP2蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。抗輪狀病毒全病毒豚鼠免疫血清抗體，或抗重組輪狀病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗體與用作陰性對照的重組輪狀病毒NSP2蛋白和牛血清白蛋白均無免疫反應(yīng)。結(jié)論本發(fā)明提供的重組VP6載體蛋白rVP6F具有特異的抗原反應(yīng)性和免疫原性。
序列表
重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的核苷酸序列I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa 51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa 501 tagatcacaa cctgcgcatg_agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcRaacat acagcaattt 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg 701 atRRtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc 801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat 851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcRcaRcact CRaRcatcat 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac 1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg 1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg 1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa 重組輪狀病毒VP6載體蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val lie Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys o
引物
P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；
P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；
P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；
P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；
P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；
P244R ；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；
P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；
P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；
P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ；
PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；
PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT。
權(quán)利要求
1.一種重組輪狀病毒VP6載體蛋白，其特征在于重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因上有下列六個供外源抗原表位基因插入的限制性內(nèi)切酶位點Sac I (gagctc), BspT104 I(ttcgaa), Kpn I (ggtacc), Bln I (cctagg), Sac II (ccgcgg), Xho I (ctcgag),其中重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的核苷酸序列如下 、 I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa 、51aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 、101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 、151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg 、201aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca、、 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg、 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag 、351aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 、401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 、451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa、 501 tagatcacaa cctgcgcatg agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag、 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcgaacat acagcaattt、、 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct、 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg、 701 atggtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc、 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc、 801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat 、851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcRcaRcact CRaRcatcat 、901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt、 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac、 1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg 、1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg 、1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa 重組輪狀病毒VP6載體蛋白由380個氨基酸組成，其氨基酸序列如下Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val lie Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys o
2.如權(quán)利要求I所述的重組輪狀病毒VP6載體蛋白，其特征在于通過下列步驟構(gòu)建 1)根據(jù)輪狀病毒TB-Chen株VP6蛋白基因的核苷酸序列，人工設(shè)計下列引物對P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；P244R ；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ； 以及下列引物PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT ； 2)以輪狀病毒TB-Chen株VP6蛋白編碼基因為模板，以下列為引物對，進(jìn)行PCR擴增 PETL5/P174R 和 P174F/PVP6-3 ；PETL5/P197R 和 P197F/PVP6-3 ；PETL5/P244R 和 P244F/PVP6-3 ；PETL5/P275R 和 P275F/PVP6-3 ；PETL5/P298R 和 P298F/PVP6-3 ；PETL5/P308R 和 P308F/PVP6-3 ； PCR擴增反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)混合液體積為IOOy 1，其中，分別含有60pmol的上述各引物對，以及 30ng 模板 DNA，I X IO5 pmol 的 dNTPs，10 μ I 的 IOX PCR 緩沖液，5U Taq DNA聚合酶，其余用水補足；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3 min，94°C變性40s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸反應(yīng)lmin，共40個循環(huán)，最后72°C延伸10 min ;分別得到 帶有Sac I位點序列的PCR擴增片段6174F和6174R ; 帶有BspT104 I位點序列的PCR擴增片段6197F和6197R ；帶有Kpn I位點序列的PCR擴增片段6244F和6624R ； 帶有Bln I位點序列的PCR擴增片段6275F和6275R ； 帶有Sac II位點序列的PCR擴增片段6298F和6298R ； 帶有Xho I位點序列的PCR擴增片段6308F和6308R ； 用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化上述六對擴增片段； 3)將步驟2)所得下列各擴增片段，按常規(guī)分別用下列對應(yīng)的內(nèi)切酶即內(nèi)切酶I/內(nèi)切酶II進(jìn)行雙酶切 帶有Sac I位點序列的PCR擴增片段6174F:Nde I/Sac I ； 帶有Sac I位點序列的PCR擴增片段6174R:Sac I/BamH I ； 帶有BspT104 I位點序列的PCR擴增片段6197F:Nde I/BspT104 I ； 帶有BspT104 I位點序列的PCR擴增片段6197R:BspT104 I/BamH I ； 帶有Kpn I位點序列的PCR擴增片段6244F:Nde I/Kpn I ； 帶有Kpn I位點序列的PCR擴增片段6624R:Kpn I/BamH I ； 帶有Bin I位點序列的PCR擴增片段6275F:Nde I/Bln I ； 帶有Bin I位點序列的PCR擴增片段6275R:Bln I/BamH I; 帶有Sac II位點序列的PCR擴增片段6298F:Nde I/Sac II; 帶有Sac II位點序列的PCR擴增片段6298R:Sac I I/BamH I; 帶有Xho I位點序列的PCR擴增片段6308F:Nde I/Xho I ； 帶有Xho I位點序列的PCR擴增片段6308R:Xho I/BamH I ； 酶切反應(yīng)體系為分別含有3μ I的上述各基因片段，以及3μ I的15U內(nèi)切酶I，3μ1的15U內(nèi)切酶II，和8μ I的IOX緩沖液及63 μ I的水；將各酶切混合液分別于37°C水浴反應(yīng)3小時后，得對應(yīng)的六個酶切片段，分別用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化六個酶切片段； 4)將步驟3)所得六個酶切片段對分別與T4DNA連接酶及緩沖液混合后，在18°C連接反應(yīng)6h,最終在同一個VP6蛋白上構(gòu)建出攜帶有Sac I (gagctc), BspT104 I (ttcgaa),Kpn I (ggtacc),Bln I (cctagg), Sac II (ccgcgg),Xho I (ctcgag)六個酶切位點的 VP6載體蛋白編碼基因； 5)、將步驟4)得到的VP6載體蛋白編碼基因用常規(guī)的基因克隆和重組技術(shù)，連接到ρΕΤ表達(dá)質(zhì)粒DNA的Nde I/BamH I位點，得到攜帶VP6F載體蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒pET6F ； 6)按常規(guī)將步驟5)所得重組質(zhì)粒經(jīng)菌體轉(zhuǎn)化擴增后，進(jìn)行酶切鑒定和核苷酸序列測定，之后將重組質(zhì)粒PET6F在下列條件下分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞10 μ I重組質(zhì)粒pET6F與100 μ I的BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰上放置30分鐘，42°C放置70秒鐘，加入500 μ I的LB培養(yǎng)液后，在37°C培養(yǎng)30分鐘；培養(yǎng)物涂在含200 μ g/ml氨芐青霉素的I. 5%瓊脂培養(yǎng)板上,將培養(yǎng)板于37°C培養(yǎng)14個小時,挑取單個菌落放入含200 μ g/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)和表達(dá),得 攜帶有Sac I (gagctc),BspT104 I (ttcgaa),Kpn I(ggtacc), Bln I (cctagg), Sac II (ccgcgg), Xho I (ctcgag)六個供外源抗原表位基因插入的限制性內(nèi)切酶位點的重組輪狀病毒VP6載體蛋白rVP6F。
全文摘要
本發(fā)明提供一種重組輪狀病毒VP6載體蛋白及其制備，重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因上有下列六個供外源抗原表位基因插入的限制性內(nèi)切酶位點，不影響VP6蛋白原有的分子結(jié)構(gòu)，保留了VP6蛋白原有所有抗原表位，并都位于蛋白分子的表面，可最大限度的展示外源抗原表位免疫學(xué)性質(zhì)，以便將其他病毒的抗原表位插入本發(fā)明的重組輪狀病毒VP6載體蛋白中，從而構(gòu)建出輪狀病毒RV與其他病毒聯(lián)合重組的嵌合疫苗及試劑。
文檔編號C12N15/70GK102643335SQ201210112598
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者陳元鼎 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所