專(zhuān)利名稱(chēng)：藏羚羊絨及其制品的熒光定量pcr定性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于PCR檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種藏羚羊絨及其制品的熒光定量PCR定性檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
藏玲羊(Pantholops hodgsonii)是我國(guó)特有的珍稀物種之一，屬于國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》。藏羚羊生活在高寒的可可西里地區(qū)，全身覆蓋著一層厚厚的毛，其底絨非常細(xì)軟，直徑約10 U m，質(zhì)地極佳，保暖性好，被稱(chēng)為“shahtoosh”,波斯語(yǔ)羊絨之王的意思。一條重100-150克的Shahtoosh披肩，可以輕易地從一個(gè)戒指中穿過(guò)，被認(rèn)為是最上等、最昂貴的時(shí)尚，其售價(jià)可達(dá)數(shù)萬(wàn)美元。藏羚羊被喻為“高原的精靈”，自然條件下無(wú)法收集其脫落的絨毛。而實(shí)際編織這樣一條圍巾，要消耗300-400克藏羚羊生絨，即3-4頭藏羚羊的生命。正是國(guó)際市場(chǎng)的追捧和高額利益的驅(qū)使，藏羚羊的生命受到了嚴(yán)重的威脅，在20世紀(jì)最后20年遭大量偷獵，現(xiàn)存種群數(shù)量約7萬(wàn)至10萬(wàn)只。按國(guó)家野生動(dòng)物保護(hù)法，獵殺和走私藏羚羊3頭即屬重大案件，應(yīng)從重處理，追究刑事責(zé)任。近年來(lái)，不法分子已經(jīng)不再將整張羊皮走私出境，而是采取瞞報(bào)夾帶等更加隱蔽復(fù)雜的手法，將藏羚羊絨藏在其他物品中，或混在羊絨、羊毛制品中，將藏羚羊絨運(yùn)至印度、尼泊爾等地區(qū)進(jìn)行加工，再賣(mài)到歐美市場(chǎng)。目前對(duì)于藏羚羊絨的鑒別，主要依靠其纖維外觀形態(tài)，通常使用的儀器設(shè)置有光學(xué)顯微鏡，掃描電鏡。圖1A-1D顯示了光學(xué)顯微鏡放大1400倍的藏羚羊毛、藏羚羊絨，及羊絨、細(xì)羊毛的纖維縱向形態(tài)。由圖可見(jiàn)，在相同的放大倍數(shù)下，藏羚羊絨的直徑比一般的羊絨、細(xì)羊毛要細(xì)，鱗片呈環(huán)狀，比較稀疏，與羊絨的表觀較為相似，容易混淆。因此，需要有一種更好的方法，能夠快速準(zhǔn)確地鑒別藏羚羊絨及其制品的方法，從而對(duì)保護(hù)藏羚羊、打擊違法走私活動(dòng)起到積極的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的就在于提供一種新的基于DNA檢測(cè)的藏羚羊絨及其制品的熒光定量PCR定性檢測(cè)方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種藏羚羊絨及其制品的熒光PCR定性檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種用于檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明的藏羚羊絨及其制品的熒光定量PCR定性檢測(cè)方法包括以下步驟第一步，以藏羚羊絨的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；第二步，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)，以確定是否為藏羚羊絨；其特征在于，用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增藏羚羊絨DNA的特異性引物對(duì)和探針。其中，所述特異性引物對(duì)的序列如SEQ ID NO. I和2所示；所述特異性探針的序列如 SEQ ID NO. 3 所示。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述PCR擴(kuò)增的條件如下反應(yīng)體系為ABITaqman universal PCR master mix (2X) 10 μ 1,DNA模板4 μ I,引物 I. 6 μ 1，探針 2 μ 1，ddH20 2. 4μ I ；反應(yīng)的條件為:95。0，51^11;951，158，581，458，40個(gè)循環(huán)。本發(fā)明提供的藏羚羊絨及其制品的檢測(cè)試劑盒含有以下試劑(a)擴(kuò)增藏羚羊絨DNA的特異性引物對(duì)；(b)藏羚羊絨DNA的特異性探針。根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒還可以包括(c)標(biāo)準(zhǔn)參照物。其中，所述擴(kuò)增藏羚羊絨DNA的特異性引物對(duì)的序列如SEQ IDNO :1和2所示；所述擴(kuò)增藏羚羊絨DNA的特異性探針的序列如SEQ IDNO 3所示。本發(fā)明的藏羚羊絨及其制品的檢測(cè)試劑盒可用于熒光定性檢測(cè)藏羚羊絨及其制品O本發(fā)明的設(shè)計(jì)的藏羚羊絨實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的特異性引物對(duì)和探針及其制成的檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)藏羚羊絨及其制品不僅特異性好，而且靈敏度高，對(duì)于保護(hù)藏羚羊、打擊違法走私活動(dòng)具有非常積極的作用。


圖IA D分別顯示了光學(xué)顯微鏡放大1400倍的藏羚羊毛、藏羚羊絨、羊絨、及細(xì)羊毛的纖維縱向形態(tài)。圖2為PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果的示意圖。圖3顯示了藏羚羊引物探針序列與山羊序列的blast結(jié)果。圖4顯示了藏羚羊引物探針序列與綿羊序列的blast結(jié)果。圖5顯示了藏羚羊絨的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果。圖6顯示了 10倍梯度稀釋后的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)情況，由上而下依次為1，10，IO2,IO3 和 IO4O圖7顯示了 10倍梯度稀釋的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果的線性關(guān)系。圖8顯示了不同配比的藏羚羊絨檢測(cè)情況，由上而下依次為100%、10%和I %。圖9為實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物的部分測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過(guò)比較藏玲羊(Pantholops hodgsonii)、山羊(Capra hircus)、及綿羊(Ovis aries)的線粒體12SrRNA基因的序列，選取合適的序列進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的引物和探針的設(shè)計(jì)，并對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)選。在此基礎(chǔ)上，又分別對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的引物和探針的特異性和靈敏度進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，本發(fā)明設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的引物對(duì)和探針不僅特異性好，而且靈敏度高。以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的藏羚羊絨及其制品的熒光定量PCR定性檢測(cè)方法作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I、藏羚羊絨實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的引物和探針設(shè)計(jì)比較藏玲羊(Pantholopshodgsonii)、山羊(Capra hircus)、綿羊(Ovisaries)線粒體12SrRNA基因的序列，選取合適的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。針對(duì)藏羚羊線粒體12SrRNA基因的熒光定量PCR產(chǎn)物大小為76bp。引物和探針的序列如下chiruF :5’ -CCCTCCTCAAATAAACATAATGCA-3’ ； (SEQ ID NO. I)chiruR :5’ -TTGTTACGACTTGTCTCCTCTCATG-3’ ； (SEQ ID NO. 2)Pchiru :FAM-TTAAATATACTTACACGCACCCAC-MGB。(SEQ ID NO. 3) 同時(shí)設(shè)計(jì)了藏羚羊、山羊、綿羊共有的通過(guò)引物，產(chǎn)物大小為88bp。引物和探針的序列如下GsyF :5’ -GGGTTTACGACCTCGATGTTG-3’ ； (SEQ ID NO. 4)GsyR :5，-ACGTAGGACTTTAATCGTTGAACAAA-3，； (SEQ ID NO. 5)Pgsy :FAM-ACCGCTATCAAAGGTT-MGB。(SEQ ID NO. 6)實(shí)施例2、PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化引物濃度為ΙΟμΜ，探針濃度為2μΜ。反應(yīng)體系除ABI Taqman universal PCRmaster mix (2X) 10 μ I, DNA模板4 μ I以外,其他成分如表I所示。反應(yīng)的條件為95°C，5min;95°C，15s，58°C，45s，40 個(gè)循環(huán)。表I、優(yōu)化反應(yīng)體系中其他成分的用量(単位μ I)
體系引物探針 ddH20
10.4 I4.6
20.8 I4.2
31.2 I3.8
41.6 I3.4
50.4 23.6
60.8 23.2
71.2 22.8
81.6 22.4優(yōu)化的結(jié)果如圖2所示。由圖2的結(jié)果可見(jiàn)，體系8的熒光信號(hào)強(qiáng)度，Ct值最小，故選體系8為擴(kuò)增藏羚羊絨成分的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，即引物終濃度為O. 8 μ M，探針終濃度為O. 2 μ Μ。實(shí)施例3、藏羚羊絨成分實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的引物和探針特異性比對(duì)與驗(yàn)證3. I、藏羚羊絨成分實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的引物和探針特異性比對(duì)
經(jīng)比對(duì)，藏羚羊的12SrRNA基因與山羊和綿羊的12SrRNA基因的相似性為93%，與綿羊12SrRNA基因的相似性為93%。圖3顯示了藏羚羊引物探針序列與山羊序列的blast結(jié)果。圖4顯示了藏羚羊引物探針序列與綿羊序列的blast結(jié)果。3. 2、藏羚羊絨實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的引物和探針特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分別取藏玲羊絨、山羊絨、綿山毛5mg,用progema毛發(fā)抽提試劑盒抽提DNA,70y I洗脫液洗脫DNA。引物濃度為10 μ M，探針濃度為2 μ M。分別以ddH20，藏羚羊絨、山羊絨、綿山毛DNA為模板進(jìn)行實(shí)行熒光PCR擴(kuò)增。退火溫度為58°C 45s。引物終濃度為O. 8 μ M， 探針終濃度為O. 2 μ Μ，反應(yīng)體系如表2。表2、牦牛引物探針特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系(單位μ I)
權(quán)利要求
1.ー種藏羚羊絨及其制品的熒光定量PCR定性檢測(cè)方法，包括以下步驟 第一歩，以藏羚羊絨的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 第二步，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)，以確定是否為藏羚羊絨； 其特征在于，用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增藏羚羊絨DNA的特異性引物對(duì)和探針。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述特異性引物對(duì)的序列如SEQID NO. I和2所示。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述特異性探針的序列如SEQID NO. 3所/Jn ο
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件如下 反應(yīng)體系為ABI Taqman universal PCR master mix (2X) 10 μ I,DNA模板4 μ I,引物I. 6 μ 1，探針 2μ 1，ddH20 2. 4 μ I ； 反應(yīng)的條件為95°C,5min ;95°C，15s，58°C，45s，40 個(gè)循環(huán)。
5.ー種藏羚羊絨及其制品的檢測(cè)試劑盒，其特征在于含有以下試劑 (a)擴(kuò)增藏羚羊絨DNA的特異性引物對(duì)； (b)藏羚羊絨DNA的特異性探針。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括(c)標(biāo)準(zhǔn)參照物。
7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增藏羚羊絨DNA的特異性引物對(duì)的序列如SEQ ID NO :1和2所示。
8.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增藏羚羊絨DNA的特異性探針的序列如SEQ ID NO 3所示。
9.如權(quán)利要求5 8中任一項(xiàng)所述的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，用于熒光檢測(cè)藏羚羊絨及其制品。
10.如權(quán)利要求I所述的藏羚羊絨DNA的熒光定量PCR的特異性引物和特異性探針，其特征在于 所述藏羚羊絨DNA的特異性引物的序列如SEQ ID NO :1和2所示； 所述藏玲羊絨DNA的特異性探針的序列如SEQ ID NO 3所示。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種藏羚羊絨及其制品的熒光PCR定性檢測(cè)方法，包括第一步，以藏羚羊絨的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；第二步，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)，以確定是否為藏羚羊絨；其中，用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增藏羚羊絨DNA的特異性引物對(duì)和探針。本發(fā)明的藏羚羊絨及其制品的熒光PCR定性檢測(cè)方法不僅特異性好，而且靈敏度高，對(duì)于保護(hù)藏羚羊、打擊違法走私活動(dòng)具有非常積極的作用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102634583SQ20121011373
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者嚴(yán)安, 候穎, 唐敏峰, 張小明, 楊娟, 王衛(wèi)華, 董正廉, 費(fèi)靜 申請(qǐng)人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)品與原材料檢測(cè)技術(shù)中心, 中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局