專利名稱：耐有機溶劑蛋白酶的突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程研究領(lǐng)域，涉及耐有機溶劑蛋白酶的突變體，具體的是通過基因工程改造得到的在有機溶劑中具有高穩(wěn)定性的蛋白酶。
背景技術(shù)：
生物催化技術(shù)廣泛用于制藥、精細化工等合成領(lǐng)域，然而通常反應(yīng)所用的底物或中間體水溶性差，因此在非水介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)是推動該領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵技木。而多數(shù)酶在有機溶劑中不穩(wěn)定、易失活，如何提高酶分子在有機溶劑中的穩(wěn)定性成為了關(guān)鍵瓶頸。現(xiàn)有技術(shù)對在有機溶劑中進行酶催化的研究著重于酶催化介質(zhì)工程、酶的物理化學修飾及固定化等技術(shù)，往往難以高效地改善酶的有機溶劑穩(wěn)定性及催化反應(yīng)效率，挖掘和開發(fā)在有機溶劑中具有高活性及高穩(wěn)定性的酶類是十分迫切的，可提升生物催化工程的關(guān)鍵理論與技術(shù)。Arnold 等(J. Am. Chem. Soc. 113，6336-6337)對 a -裂解蛋白酶表面四個帶電氨基酸殘基進行定點飽和突變，獲得的多個突變體在84%DMF中穩(wěn)定性提高。Rhee等(Biochim. Biophys. Acta. -Protein Struct. Mol. EnzymoI. 1547, 370-378)通過定向進化技術(shù)獲得了磷脂酶Al的三個突變體(SA8、SA17及SA20)在50%DMS0中的半衰期約是野生型的4倍。Reetz (Chem. Commun. 46，8657-8658)基于迭代飽和突變技術(shù)獲得的枯草桿菌脂肪酶突變體在こ腈、DMSO及DMF等有機溶劑中的穩(wěn)定性顯著提高。Dalfard等(J.Biochem. 148, 231-238)通過定點突變提高了 Salinivibrio /Troteoスバ■來源的蛋白酶在多種有機溶劑中的穩(wěn)定性，降低了其在有機相中的熱失活速率。以上現(xiàn)有技術(shù)的文獻顯示出蛋白質(zhì)分子改造手段對于提高酶在有機溶劑中的穩(wěn)定性具有突出的優(yōu)勢，然而在實驗水平上還沒有成熟的相關(guān)理論報道，更沒有可借鑒的分子改造方法。而運用定向進化策略對酶穩(wěn)定性進行改造研究具有較高的可行性。近年來蛋白酶在有機相中的反應(yīng)多樣性越來越受到人們的關(guān)注，其可進行合成小肽合成、糖軛合物，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)以及動力學拆分等，在醫(yī)藥中間體、日用品、化妝品、生物材料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。然而大多數(shù)蛋白酶在有機相中也容易失活，因此，提高蛋白酶在有機相中的穩(wěn)定性對于推動蛋白酶非水相生物催化應(yīng)用的發(fā)展具有突出的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的在于對本發(fā)明人團隊在先授權(quán)專利的蛋白酶進行定向進化，以得到在有機溶劑中具有更高穩(wěn)定性的蛋白酶；本發(fā)明的另ー個技術(shù)目的在于提供該酶在有機相中催化小肽合成的應(yīng)用，為有機相肽合成的エ業(yè)化進程進一歩提供基因資源。一、本發(fā)明通過定向進化技術(shù)對銅綠假單胞菌來源的耐有機溶劑蛋白酶PT121基因(見授權(quán)中國申請，授權(quán)公告號CN 101240254 B)進行分子改造，使改造后的蛋白酶的突 變體在有機溶劑穩(wěn)定性方面更加優(yōu)良。該耐有機溶劑蛋白酶突變體是通過用另一種氨基酸殘基取代在由SEQ ID No: I表示的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應(yīng)位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ ID No:l中的第46位，和/或第224位；其在有機溶劑中穩(wěn)定性比原出發(fā)蛋白酶大大提高。其中，所述的SEQ IDNo: I是在先授權(quán)專利CN 101240254 B中所述的銅綠假單胞菌aeruginosa)PT121所產(chǎn)的蛋白酶的成熟肽部分，編碼301個氨基酸。進ー步地，所述的蛋白酶突變體是通過用另ー種氨基酸殘基取代在由SEQ IDNo: I表示的氨基酸序列表現(xiàn)出至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應(yīng)位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ ID No: I中的 第46位，和/或第224位；其在有機溶劑中穩(wěn)定性比原出發(fā)蛋白酶大大提高。更進一歩地，所述的蛋白酶突變體是通過用另ー種氨基酸殘基取代在由SEQ IDNo: I表示的氨基酸序列表現(xiàn)出至少99%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應(yīng)位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ ID No: I中的第46位，和/或第224位；其在有機溶劑中穩(wěn)定性比原出發(fā)蛋白酶大大提高。更進一歩地，所述的另一種氨基酸殘基優(yōu)選自下述的氨基酸 第46位酪氨酸(氨基酸縮寫名稱為Y);第224位苯丙氨酸(氨基酸縮寫名稱為F)或酪氨酸(氨基酸縮寫名稱為Y)。ニ、編碼本發(fā)明所述的蛋白酶突變體的基因。其出發(fā)蛋白酶的基因序列參見在先授權(quán)中國專利CN 101240254 B所對應(yīng)的蛋白酶成熟肽段編碼的核苷酸序列。在該蛋白酶的第46位和第224位突變點對應(yīng)的編碼的核苷酸編碼，另理解為本發(fā)明所述的“另ー種氨基酸殘基”所編碼的核苷酸編碼。三、包含本發(fā)明第二點所述基因的重組載體，以及包含所述重組載體的轉(zhuǎn)化體(例如本發(fā)明所述的微生物)。本發(fā)明所述的重組載體，應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任意的基因的重組載體，例如各種質(zhì)粒，即將蛋白酶突變體的突變基因?qū)肽苁乖摰鞍酌竿蛔凅w穩(wěn)定的表達DNA載體質(zhì)粒。
而所述的重組載體的轉(zhuǎn)化體，即指重組載體的宿主細胞，例如，本發(fā)明實施例2所述的微生物^: coli BL21的宿主細胞；當然，現(xiàn)有技術(shù)常用的宿主細胞的微生物包括革蘭氏陽性細菌如枯草芽孢桿菌，革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌，放線菌如鏈霉菌，酵母如釀酒酵母，真菌如曲霉菌，它們的細胞均是常用的重組載體的宿主細胞。四、利用本發(fā)明所述的蛋白酶突變體在非水體系中催化小肽合成反應(yīng)的應(yīng)用以Cbz-Gly-OH和L-Phe-NH2為底物，本發(fā)明所述的蛋白酶突變體溶解在pH8. 0的Tris-HCl中，與等體積的有機溶劑混合，在30°C保溫反應(yīng)。本發(fā)明所述的蛋白酶突變體在50% (v/v)こ腈體系中催化ニ肽Cbz-Gly-Phe-NH2合成的效率比野生型提高了 29. 9 106. 7%，在50% (v/v) DMF、甲醇、こ醇體系中的合成效率也有顯著的提高，以上結(jié)果進一步提高了蛋白酶PT121エ業(yè)化應(yīng)用的可行性。


圖I制備的蛋白酶突變體的SDS-PAGE電泳分析。圖2蛋白酶PT121及其突變體在こ腈中的穩(wěn)定性曲線。圖3蛋白酶PT121及其突變體在丙酮中的穩(wěn)定性曲線。
具體實施例方式本發(fā)明所述的生物材料的來源的一般性說明
I、由SEQ ID No: I表示的氨基酸序列的蛋白酶授權(quán)中國申請，授權(quán)公告號CN101240254 B。2、引物設(shè)計及制備本發(fā)明中所使用的引物均由上海Invitrogen公司合成制備。3、實驗中所使用的pET22b(+)質(zhì)粒購自于Novagen公司，而所使用的LA Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS高保真酶、限制性內(nèi)切酶及T4連接酶等均購自于TaKaRa公司，使用的DNA膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒均購自于Axygen公司。實施例I :含蛋白酶PT121編碼序列的重組質(zhì)粒PPT121的構(gòu)建
采用酹-氯仿法抽提aeruginosa PT121菌株的總DNA。根據(jù)其所分泌的 耐有機溶劑的蛋白酶PT121的基因序列，在去除信號肽的剩下的基因(編碼前肽及成熟肽)的兩端設(shè)計引物，擴增耐有機溶劑蛋白酶PT121的編碼基因。設(shè)計的引物為
PTl 21—F: GCGGCCATGGTAGACCTGATCGACGTGTCCAAACT (SEQ ID No:2)
NcoI
PT121_R: AATGGATCCTTACAACGCGCTCGGGCAGGTC (SEQ ID No:3)
BamxH PCR反應(yīng)體系如下
LA Taq DNA 聚合酶 0.5A
2X GC buffer I25[lL
dNTP (2.5mM)
DNA2[iL
PT121_F (IOpmolZtLL) 2[iL PT121_R (IOpmolZtIL) 2^L ddH2010.5nX.
PCR程序設(shè)定
95 °C預(yù)變性Imin ；
95 °C, 30s ；60°C,30s ；72 °C, I. 5 min 30 個循環(huán)；
72 °C 5min。PCR產(chǎn)物和pET22b(+)質(zhì)粒(Novagen公司)分別進行限制性內(nèi)切酶Ncol、BamHI雙酶切反應(yīng)后，用DNA膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，在T4 DNA連接酶的作用下進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a菌株，涂布到含有100 u g/mL氨芐青霉素LB瓊脂平板上，篩選陽性克隆(攜帶有含蛋白酶PT 121編碼序列的重組質(zhì)粒pPT 121)，可培養(yǎng)陽性克隆后，運用質(zhì)粒小提試劑盒從中提取重組質(zhì)粒PPT121，作為實施例2中的模板。實施例2 :通過易錯PCR反應(yīng)在蛋白酶PT121基因中引入隨機突變
采用普通Taq DNA聚合酶，以含有蛋白酶PT121編碼序列的重組質(zhì)粒pPT121為模板進行易錯PCR反應(yīng)。在PCR反應(yīng)體系中添加Mn2+，提高Mg2+濃度以及改變dNTP混合物中各組分的比例等，使擴增的基因出現(xiàn)少量堿基錯配，從而導(dǎo)致目的基因的隨機突變。PCR 反應(yīng)體系如下其中 10XPCR buffer 內(nèi)含 70mM MgCl2, 500mM KCl, IOOmMTris-HCl pH8. 3,0. l%(w/v)明膠；dNTP 內(nèi)含 2mM dGTP, 2mM dATP, IOmM dCTP, IOmM dTTP。
Taq 酶0,SjiL；
IOXPCR buffer
dNTP5[iLi
T7_F2[iU
T7_R2tiL；
Te mplate 截板)2 |iL;
MbC I2 (5 mM)5(ji；
ddHaO18.5tiLo兩條PCR引物如下
T7_F TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID No:4)；
T7_R GCTAGTTATTGCTCAGCGG (SEQ ID No:5)。PCR程序設(shè)定
95 °C預(yù)變性5min ；
95 °C, Imin ；55°C, Imin ；72 °C,2 min 45 個循環(huán)；
72 °C 5min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA回收試劑盒進行膠回收，得到大約
I.5kb的片段。將易錯PCR膠回收產(chǎn)物與表達載體pET22b(+)分別進行限制性內(nèi)切酶Nde I/HindIII雙酶切，酶切條件如下
PCR片段酶切體系(20必)
PCR 片段 lO^Li IOxBuffer 2|xL；
INdeIQ..5[i-L；
Hmd III 0 5nL； ddHsO 7pX 質(zhì)粒10必；
IOxBuffer2\.lL；
Nde I0.5ttLi
Hmd III0.5tiLs
ddHaO [jio
37°C酶切7小吋，電泳后分別回收兩個酶切產(chǎn)物片段，再用T4 DNA連接酶連接，連接體系如下
PCR 片段5 ^iL5 質(zhì)粒ItiLi
T4DNA 酶0.5成.；
IOxBufferI^X;
ddHaO2.5|iL;
TotalI OuXo
16°C連接過夜，電泳檢測結(jié)果顯示有一條大約7000bp的片段，說明連接成功。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至萬.coli BL21，涂布到含有100 ii g/mL氨芐青霉素LB瓊脂平板上，37°C過夜培養(yǎng)。將所有的轉(zhuǎn)化克隆子轉(zhuǎn)接至奶粉瓊脂平板上，具體配方為胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，脫脂奶粉10g/L，瓊脂18g/L。在37°C培養(yǎng)24h后根據(jù)菌落是否產(chǎn)生水解圈，初步篩選獲得帶有蛋白酶PT121突變基因的重組菌，能產(chǎn)生水解圈的菌落即為陽性重組子。實施例3 :突變體蛋白酶的表達與制備
將陽性重組子接入種子培養(yǎng)基，具體配方為胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉IOg/L，葡萄糖10g/L，氨芐青霉素100 u g/mL。在96孔板中37°C，180rpm培養(yǎng)過夜作為種子液。在12孔培養(yǎng)板每孔中加入3mL LB氨芐培養(yǎng)基，按接種量1%接入種子液，搖床37°C，120rpm培養(yǎng)3-3. 5h。當OD達到0. 6-0. 8時加入IPTG至終濃度為ImM，然后30°C，120rpm,誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3h。離心收集菌體，用Tris-HCl緩沖(lOOmM，pH 8. 0)洗滌菌體兩次，最后用Tris-HCl緩沖(lOOmM，pH8. 0，含0. 25mg/mL溶菌酶)混懸菌體，在37°C下水浴2h后離心去除菌體，取上清酶液保存，上清液為電泳純的酶液(如圖I所示)，可直接用于后續(xù)篩選及性質(zhì)研究。實施例4 :在有機溶劑中具有更高穩(wěn)定性的突變基因的篩選
Folin-酚法測定蛋白酶活力取若干I. 5mL離心管編號，分別加入酶液200 y L及200 u L酪蛋白底物溶液(2%，w/v)，放入40°C恒溫水浴保溫IOmin后立即加入400 u L TCA反應(yīng)終止液(0.4M三氯こ酸)。每個樣品做空白對照，即先加入終止液使酶失活后再加入底物溶液。反應(yīng)液室溫，15000rpm離心15min，然后取各離心管上清液40 u L，分別移入96微孔板中，再加入0. 4M碳酸鈉溶液200 u L和福林-酚試劑(上海生エ生物工程有限公司)40yL，混勻，40°C下保溫顯色20min后，進行比色測定(波長660nm)。蛋白酶活力定義在一定PH值(pH8. 0)和40°C條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生I y g酪氨酸所需的酶量為ー個蛋白酶活力単位(U)。將制備的突變體酶液加入到25%(v/v)こ腈體系中，在30°C下保溫5h，考察Oh時的酶活力Atl和5h時的酶活力A5，穩(wěn)定性定義為S=A5/Aq。以未突變蛋白酶PT121為對照，篩選有機溶劑穩(wěn)定性顯著提高的突變體。篩選獲得了三個穩(wěn)定性提高的突變體，經(jīng)基因序列測定(由上海Invitrogen公司完成)分析后發(fā)現(xiàn)，兩個位點的氨基酸參加發(fā)生了突變，見表1，分別命名為T46Y、H224F及H224Y，其與原出發(fā)蛋白酶的同源性均為99%。它們對應(yīng)的穩(wěn)定性分別為115. 8%，107. 2%及108. 4%，而野生型的蛋白酶PT121的穩(wěn)定性為82. 6%。這三個突變體即為優(yōu)勢突變體。本實 驗中這三個突變體是通過隨機突變及篩選的方法獲得，而本領(lǐng)域公知常識可知，而用定點突變的方法也能獲得這三個突變體，這對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是公知可以實現(xiàn)的實驗技木。
權(quán)利要求
1.一種蛋白酶突變體，是通過用另一種氨基酸殘基取代在由SEQ ID No: I表示的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應(yīng)位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ ID No: I中的第46位，和/或第224位；其在有機溶劑中穩(wěn)定性提聞。
2.一種蛋白酶突變體，是通過用另一種氨基酸殘基取代在由SEQ ID No: I表示的氨基酸序列表現(xiàn)出至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應(yīng)位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ ID No:l中的第46位，和/或第224位；其在有機溶劑中穩(wěn)定性提高。
3.一種蛋白酶突變體，是通過用另一種氨基酸殘基取代在由SEQ ID No: I表示的氨基酸序列表現(xiàn)出至少99%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相應(yīng)位置上的氨基酸殘基而獲得的蛋白酶突變體，且所述的氨基酸殘基位置為SEQ ID No:l中的第46位，和/或第224位；其在有機溶劑中穩(wěn)定性提高。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3之一所述的蛋白酶突變體，其特征在于所述的另一種氨基酸殘基選自下述的氨基酸第46位酪氨酸；第224位苯丙氨酸或酪氨酸。
5.編碼權(quán)利要求I至3之一所述的蛋白酶突變體的基因。
6.包含權(quán)利要求5所述基因的重組載體。
7.包含權(quán)利要求6所述重組載體的轉(zhuǎn)化體。
8.利用權(quán)利要求I至3之一所述的蛋白酶突變體在非水體系中催化小肽合成反應(yīng)的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于以Cbz-Gly-OH和L-Phe-NH2為底物，本發(fā)明所述的蛋白酶突變體溶解在PH8. 0的Tris-HCl中，與等體積的有機溶劑混合，在30°C保溫反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程研究領(lǐng)域，涉及一種耐有機溶劑蛋白酶的突變體。本發(fā)明所述的五個突變改造的蛋白酶是由具有氨基酸序列為SEQIDNo.1的來源于銅綠假單胞菌的蛋白酶中氨基酸殘基取代而產(chǎn)生的，所述的氨基酸突變包括第46、224位的取代。本發(fā)明公開了優(yōu)選的分子改造的耐有機溶劑性能增強的蛋白酶、相應(yīng)的氨基酸序列及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的五個突變體蛋白酶在有機溶劑中的穩(wěn)定性方面更加優(yōu)良，在多種有機溶劑體系中催化二肽合成的效率比野生型的顯著提高。
文檔編號C12N9/52GK102660521SQ20121011398
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者何冰芳, 吳斌, 莊宇, 朱富成 申請人:南京工業(yè)大學