專(zhuān)利名稱(chēng)：兔源性纖維成分熒光定量pcr定性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，是一種兔源性纖維成分熒光定量PCR定性檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
兔毛、狐貍皮草是秋冬市場(chǎng)上的寵兒。皮草以其保暖、舒適、美觀在國(guó)際市場(chǎng)上長(zhǎng)盛不衰。除此以外，市場(chǎng)上還存在兔絨、狐絨織物制品。一般情況下，狐貍毛要比兔毛長(zhǎng)密而柔軟，加之飼養(yǎng)成本也較高，狐貍皮草的價(jià)格要遠(yuǎn)高于兔毛制品。近年隨著品種的改良，兔毛也逐漸具備細(xì)長(zhǎng)柔軟的特性，比如安哥拉兔、獺兔等，給皮草的鑒別增加了難度。兔毛狐貍毛都有髓質(zhì)層，極少數(shù)部分的細(xì)毛無(wú)毛髓，顯微鏡下呈現(xiàn)出小格狀空腔。我國(guó)現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)FZ/T01057-2007中對(duì)兔毛纖維的縱面形態(tài)描述為“鱗片較小與纖維縱向呈傾斜狀，髓腔有單列、雙列、多列”，有經(jīng)驗(yàn)的人根據(jù)髓腔的排列和形狀可以對(duì)纖維的種屬進(jìn)行判別。一般檢測(cè)機(jī)構(gòu)主要根據(jù)顯微鏡下的纖維形態(tài)特征來(lái)判斷纖維的種屬，見(jiàn)圖I。圖I為顯微鏡下的兔毛(左)和狐貍毛(右)。而在一般的光學(xué)顯微鏡下，鱗片并不是很清晰，檢測(cè)起來(lái)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是一種基于物種自帶的DNA序列來(lái)定性判別兔毛狐貍毛的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺點(diǎn)和不足。本發(fā)明的目的在于，提供一種兔源性纖維成分熒光定量PCR的定性檢測(cè)方法。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種兔源性纖維成分的檢測(cè)試劑盒，以及試劑盒的用途。本發(fā)明的再一目的在于，提供一種兔源性纖維成分熒光定量PCR的引物和探針。本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問(wèn)題，可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)作為本發(fā)明的第一方面，一種兔源性纖維成分熒光定量PCR的定性檢測(cè)方法，包括以下步驟步驟一、兔毛的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟二、檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)；其特征在于，用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增兔源性纖維成分特異性引物對(duì)和兔源性纖維成分特異性探針。其中，所述擴(kuò)增兔源性纖維成分特異性引物對(duì)的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示。其中，所述兔源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述方法還包括步驟在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中或之后，檢測(cè)兔源性纖維成分特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。所述PCR擴(kuò)增的條件如下
反應(yīng)體系A(chǔ)BITaqman universal PCR master mix (2X) 10 μ I,DNA模板2 μ I,弓I物 I. 2 μ I (10 μ Μ)，probe 2 μ I (2 μ Μ)，ddH20 4. 8 μ I ；反應(yīng)的條件為:95。〇，51^11;951，158，611，458，40個(gè)循環(huán)。作為本發(fā)明的第二方面，一種兔源性纖維成分的檢測(cè)試劑盒，含有以下試劑(a)擴(kuò)增兔源性纖維成分特異性引物對(duì)；(b)兔源性纖維成分特異性探針。進(jìn)一步，所述試劑盒還包括(c)標(biāo)準(zhǔn)參照物。 其中，所述標(biāo)準(zhǔn)參照物是兔源性纖維成分DNA，或含有兔源性纖維成分?jǐn)U增目的片段的質(zhì)粒DNA，或兔毛。其中，所述擴(kuò)增兔源性纖維成分特異性引物對(duì)的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示。其中，所述兔源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述兔源性纖維成分特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。作為本發(fā)明的第三方面，一種兔源性纖維成分的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，用于檢測(cè)在皮草中是否存在兔源性纖維成分。作為本發(fā)明的第四方面，一種如權(quán)利要求I所述的兔源性纖維成分熒光定量PCR的特異性引物和特異性探針，其特征在于，所述兔源性纖維成分特異性引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2所示；所述兔源性纖維成分特異性探針的序列如SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明的有益效果I、可簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)和鑒定皮草中是否存在兔源性、狐源性纖維成分。2、本發(fā)明基于牦牛線粒體12SrRNA基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物和特異性探針的特異性好。3、檢測(cè)方法靈敏度假，可檢測(cè)到配比為1% (wt)的兔毛、狐貍毛。


圖I :顯微鏡下的兔毛(左)和狐貍毛(右)。圖2 :兔源性引物探針序列與相對(duì)應(yīng)的狐序列的blast結(jié)果。圖3 :狐源性引物探針序列與相應(yīng)的兔序列的blast結(jié)果。圖4 :兔源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果。圖5 :狐源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果。圖6 :兔源性成分10倍梯度稀釋實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)情況。圖7 :兔源性成分不同配比實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)情況。圖8 :狐源性成分10倍梯度稀釋實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)情況圖9 :狐源性成分不同配比實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)情況。圖10 :被檢測(cè)樣品外形及常規(guī)方法檢測(cè)結(jié)果。圖11 :兔源性成分驗(yàn)證及檢測(cè)結(jié)果。圖12 :被檢測(cè)產(chǎn)品外形其常規(guī)方法檢測(cè)結(jié)果。
圖13 :微量兔源性成分驗(yàn)證及檢測(cè)結(jié)果。圖14 :被檢測(cè)產(chǎn)品外觀。圖15 :狐源性纖維成分驗(yàn)證及檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或廠商提供的條件進(jìn)行。以下實(shí)施例中所涉及的“％”，除特別說(shuō)明外，均為重量百分比。實(shí)施例II、探針和引物的設(shè)計(jì)市場(chǎng)上常見(jiàn)的毛用狐貍品種有北極狐、紅狐，兼顧兩者線粒體基因12srRNA序列的相同部分，與兔的序列進(jìn)行比較，選取合適的序列進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)。針對(duì)兔源性成分的產(chǎn)物大小為68bp。引物和探針序列如下RabF :5，-CGAACCCTAAAAAGGAGCAAAA-3，(SEQ ID NO 1)RabR :5’ -GGGCTACACCTTGACCTAACGT-3’ (SEQ ID NO 2)Prab :FAM-AAGCTCAATTACCACCGTAA-MGB(SEQ ID NO 3)針對(duì)狐源性成分的產(chǎn)物大小為70bp。引物和探針序列如下FoxF :5，-ACAAAACAATTCGCCAGAGAACT-3’ (SEQ ID NO 4)FoxR :5，-GGATATAAAGCACCGCCAAGTC-3’ (SEQ ID NO 5)Pfox FAM-TAGCAACAGCTTAAAACT-MGB (SEQ ID NO :6)針對(duì)羊源性成分的產(chǎn)物大小為61bp。引物和探針序列如下YangF :5，-GCCAGAGTACTACCGGCAACA-3’ (SEQ ID NO 7)YangR :5，-GGCTCCTCTAGAAGGGTATAAAGCA-3’ (SEQ ID NO 8)Pyang :FAM-CGAAACTCAAAGGACTTGG-MGB (SEQ ID NO 9)其中，F(xiàn)AM表示熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB表示淬滅基團(tuán)。本發(fā)明采用熒光探針?lè)?，其檢測(cè)原理是利用熒光標(biāo)記特異性探針來(lái)識(shí)別模板。與現(xiàn)有技術(shù)中SYBR染料法相比，本發(fā)明熒光標(biāo)記特異性探針的特異性更強(qiáng)。2、反應(yīng)體系的優(yōu)化分別取家兔毛、北極狐毛511^,剪碎,用？1'0〖61]^毛發(fā)抽提試劑盒抽提0嫩,5(^ I洗脫液洗脫DNA。反應(yīng)體系除ABI Taqman universal PCR master mix (2X) 10 μ I,DNA 模板 2 μ I以外，其他成分如表1、2所示。引物的濃度為10 μ Μ，探針的濃度為2 μ Μ。反應(yīng)條件反應(yīng)的條件為95°〇，51^11;951，158，611，458，40個(gè)循環(huán)。表I、兔源性成分測(cè)定優(yōu)化反應(yīng)體系中其他成分的用量(單位μ I)
權(quán)利要求
1.一種兔源性纖維成分熒光定量PCR的定性檢測(cè)方法，包括以下步驟 步驟一、以兔毛的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟ニ、檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)； 其特征在于，用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增兔源性纖維成分特異性引物對(duì)和兔源性纖維成分特異性探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增兔源性纖維成分特異性引物對(duì)的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述兔源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件如下 反應(yīng)體系A(chǔ)BI Taqman universal PCR master mix(2X) 10 μ I, DNA 模板 2 μ I,引物I. 2 μ I (10 μ Μ)，probe 2 μ I (2 μ Μ)，ddH20 4. 8 μ I ； 反應(yīng)的條件為95°C,5min ;95°C，15s，61°C，45s，40 個(gè)循環(huán)。
5.一種兔源性纖維成分的檢測(cè)試劑盒，含有以下試劑 (a)擴(kuò)增兔源性纖維成分特異性引物對(duì)； (b)兔源性纖維成分特異性探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括 (C)標(biāo)準(zhǔn)參照物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增兔源性纖維成分特異性引物對(duì)的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述兔源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。
9.如權(quán)利要求5 8中任ー項(xiàng)的試劑盒的應(yīng)用，用于檢測(cè)在皮草中是否存在兔源性纖維成分。
10.一種如權(quán)利要求I所述的兔源性纖維成分熒光定量PCR的特異性引物和特異性探針，其特征在干， 所述兔源性纖維成分特異性引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2所示； 所述兔源性纖維成分特異性探針的序列如SEQ ID N0:3所示。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種兔源性纖維成分熒光定量PCR的定性檢測(cè)方法，包括步驟一、兔毛的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟二、檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)；其中，用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增兔源性纖維成分特異性引物對(duì)和兔源性纖維成分特異性探針。本發(fā)明的方法可簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)和鑒定紡織品中是否存在兔源性纖維成分，設(shè)計(jì)的特異性引物和特異性探針的特異性好，靈敏度佳，可檢測(cè)到配比為1％(wt)的狐貍毛。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102634584SQ201210114158
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者劉錦瑞, 葉尚華, 唐敏峰, 楊娟, 王小平, 費(fèi)靜, 陸維明, 高友軍 申請(qǐng)人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)品與原材料檢測(cè)技術(shù)中心, 中華人民共和國(guó)新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局, 河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心