專利名稱：一種功能性結(jié)核分枝桿菌抗原多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種功能性結(jié)核分枝桿菌抗原多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)WHO統(tǒng)計，世界上近1/3的人口感染有結(jié)核分枝桿菌(M. tb)，且隨著耐藥結(jié)核病和結(jié)核病與艾滋病混合感染患者的增多，結(jié)核病已經(jīng)嚴(yán)重危害人民健康，據(jù)統(tǒng)計近幾年在我國傳染病發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)中肺結(jié)核的排名一直位居前兩位。結(jié)核病已是一種嚴(yán)重危害人民健康和國民經(jīng)濟(jì)的傳染病，而中國是結(jié)核病的高負(fù)擔(dān)國，那么對于結(jié)核病防控策略的制定就成為了關(guān)系我國國計民生的重大問題。結(jié)核病的治療目前應(yīng)用最多的當(dāng)屬“化療”，化學(xué)藥物的治療對結(jié)核病有明顯的效果，但隨著“耐多藥結(jié)核”(MDR-TB)和“嚴(yán)重耐藥結(jié)核”(XDR-TB)發(fā)病率的升高，化療顯現(xiàn)出了局限性。那么，新的防治方法就成為了亟待解決的問題。一直以來，利用免疫學(xué)方法尋找新的有效預(yù)防和治療結(jié)核病的手段都是該領(lǐng)域研 究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。運(yùn)用疫苗預(yù)防和治療結(jié)核病是最有效的結(jié)核病防控策略之一，但是現(xiàn)階段研究進(jìn)展緩慢。目前，唯一可用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗——卡介苗(BCG)僅對兒童播散性結(jié)核有一定的保護(hù)效果，但一般認(rèn)為對成人結(jié)核保護(hù)效果比較弱。雖然一些新型的抗結(jié)核病疫苗相繼被開發(fā)，但大多仍處于探索階段，效果不甚理想。其中重要原因除了結(jié)核病免疫保護(hù)機(jī)理不清楚，就是在不同感染時期引起免疫保護(hù)反應(yīng)的結(jié)核分枝桿菌有效抗原仍然不明確，這就成為了疫苗設(shè)計以及免疫策略制定的障礙。抗原關(guān)系到疫苗的成敗，那么篩選出與發(fā)病密切相關(guān)的功能性抗原以及更好地了解其免疫應(yīng)答機(jī)制就可以為研制不同臨床需求的疫苗、制定免疫策略提供更多實(shí)際應(yīng)用選擇。在腫瘤研究領(lǐng)域有研究表明，利用含有Hsp70、Gp96(腫瘤細(xì)胞表達(dá)的分子伴侶蛋白)等蛋白的疫苗免疫小鼠后可引起針對腫瘤抗原的特異性免疫反應(yīng)，推測分子伴侶攜帶有腫瘤特異性抗原肽；在感染性疾病研究領(lǐng)域，有研究從乙肝病灶組織中提取的Gp96蛋白帶有一段HBV特異性抗原。對于肺結(jié)核病研究領(lǐng)域，目前還沒有直接從肺組織內(nèi)篩選結(jié)核桿菌抗原的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖功能的多肽。本發(fā)明所提供的多肽，名稱為Pep2，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。其中，序列表中的序列2由16個氨基酸殘基組成。編碼PeP2的基因、以及含有該基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。P印2是本發(fā)明的發(fā)明人將Rotofor技術(shù)整合液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，直接從病人病變肺組織篩選出的結(jié)核分枝桿菌抗原多肽。實(shí)驗(yàn)證明，P印2可以特異性刺激H37Rv感染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞和淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞顯著增殖，可以用于制備淋巴細(xì)胞增殖劑和研制結(jié)核病疫苗。


圖I為P印I和P印2刺激小鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。右上圖為小鼠脾臟細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。右下圖為小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、功能性結(jié)核分枝桿菌抗原多肽刺激小鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞增殖
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本實(shí)施例采用的功能性結(jié)核分枝桿菌抗原多肽是P印I (fadB5-l)和P印2 (fadB5-2),Pepl的氨基酸序列如序列表中序列I所示；P^)2的氨基酸序列如序列表中序列2所示。UPepl和P印2的制備Pep I和Pep2采用固相多肽合成法(Fmoc法)由羧基端向氨基端方向合成。其中，所采用的樹脂是取代度為O. 5的2-CL-Trt。合成的多肽采用高效液相色譜進(jìn)行純化得到純度為98%的P印I和P印2。純化的P印I和P印2經(jīng)質(zhì)譜鑒定，Pepl的氨基酸序列如序列表中序列I所示；Pep2的氨基酸序列如序列表中序列2所示。2、刺激小鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)流程如圖I所示，包括以下步驟2. I結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染小鼠模型的制備結(jié)核分枝桿菌H37Rv (結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)株，ATCC，25618)解凍后在7H9液體培養(yǎng)基復(fù)蘇一周后檢測液體培養(yǎng)基OD值，當(dāng)細(xì)菌增長處于對數(shù)增長期時OD58tl = O. 5-0. 8 (10. D=IO8CFU),用無菌O. 9%生理鹽水(含O. 05% Tween-80)稀釋細(xì)菌菌體制備成5 X IO5CFU/mL的接種液。每只小鼠(C57Black/B6，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所)尾靜脈注射細(xì)菌I X 105CFU。小鼠感染H37Rv 8周后處死，分離組織細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2. 2刺激小鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)處死的小鼠(同齡的健康C57Black/B6對照小鼠和感染H37Rv的C57Black/B6小鼠)75%乙醇浸泡消毒后用眼科剪剪開腹腔和胸腔無菌分離脾臟和淋巴結(jié)，浸泡在IOml預(yù)冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，取出組織用注射器的活塞研磨組織，尼龍網(wǎng)過濾掉脂肪組織和結(jié)締組織制備成單細(xì)胞勻衆(zhòng)，該操作在低溫下完成。單細(xì)胞懸液4°C 1500rpm, 5min離心，棄上清，無菌I XPBS重懸細(xì)胞后再次離心。加入500 μ L體積的紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后加入IOml預(yù)冷的無菌IXPBS終止反應(yīng)，再次離心，得到小鼠脾臟淋巴細(xì)胞和淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞。棄上清后加入2mL含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染料對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，同時觀察細(xì)胞的存活率。共設(shè)以下四個實(shí)驗(yàn)組和培養(yǎng)基本底對照組健康C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞組，健康C57Black/B6小鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞組，H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞組，H37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞組。前四組每組均設(shè)如下四個處理反應(yīng)體系中加入鼠抗人CD3⑶28抗體至終濃度為lug/ml，反應(yīng)體系中分別將P印I和P印2加入10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液至終濃度為10ug/ml。同時，反應(yīng)體系中僅含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液的細(xì)胞作為陰性對照。用無抗體及多肽的含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度到I X IO6細(xì)胞/ml，上述四個實(shí)驗(yàn)組中每組細(xì)胞懸液各分4份加入平底96孔板中，每孔細(xì)胞總數(shù)為2 X IO5個。其中一份加入10 μ L鼠抗人⑶30)28抗體溶液(mouse anti-human Q)3:BD, Cat.No. 555336 ；mouse ant i-human CD28 :BD，Cat. No. 555725))至鼠抗人 CD3CD28 抗體終濃度為I μ g/ml (表I中陽性對照)，一份加入10 μ L Pepl溶液至P印I終濃度為10ug/ml (表I中Pepl), 一份加入10 μ L Pep2溶液至Pep2終濃度為10ug/ml (表I中Pep2), 一份加入10 μ L的無抗體及多肽的含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液(表I中陰性對照)。上述四個實(shí)驗(yàn)組的每個處理各設(shè)3個復(fù)孔。37°C 5% CO2溫箱孵育72小時；向培養(yǎng)板每孔中加入IOyL CCK-8 (Cell Counting Kit-8)溶液，37°C 5% CO2溫箱孵育4小時；用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。計算刺激指數(shù)Stimulation Index =(刺激孔OD值-培養(yǎng)基本底OD值)/ (未刺激孔OD值-培養(yǎng)基本底OD值)。其中，刺激孔OD值是指加入鼠抗人CD3CD28抗體、P印I或P印2刺激細(xì)胞讀取的OD值；未刺激孔OD值是指加入無抗體及多肽的含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液細(xì)胞讀取的OD值。 實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果如表I所示，鼠抗人⑶3⑶28抗體對健康C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是I. 21，鼠抗人⑶3⑶28抗體對H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是6. 43 ；Pepl對健康C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是0. 94，Pep I對H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是2. 71 ；Pep2對健康C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是0. 90，P印2對H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是3. 24。鼠抗人⑶3⑶28抗體對健康C57Black/B6小鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是I. 75，鼠抗人⑶3⑶28抗體對H37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是3. 74 ；Pepl對健康C57Black/B6小鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是0. 13,Pepl對H37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是I. 04 ；P印2對健康C57Black/B6小鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是0. 73，P印2對H37RvH37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)是I. 34(圖I)。說明P印I和P印2可以特異性刺激H37Rv感染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞和淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞，兩組多肽刺激的細(xì)胞顯著增殖。其中，P印I溶液和P印2溶液的溶劑均為溶劑為PBS(TAKARA公司，貨號T900。)表I.各處理復(fù)孔的450nm平均吸光度
權(quán)利要求
1.一種多肽，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.權(quán)利要求I所述多肽的編碼基因。
3.含有權(quán)利要求2所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
4.權(quán)利要求I所述的多肽在制備淋巴細(xì)胞增殖劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的編碼基因在制備淋巴細(xì)胞增殖劑中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述淋巴細(xì)胞為被H37Rv結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。
7.權(quán)利要求I所述的多肽或權(quán)利要求2所述的編碼基因在制備抗結(jié)核病疫苗中的應(yīng)用。
8.一種抗結(jié)核病疫苗，其活性成分為權(quán)利要求I所述的多肽或/和權(quán)利要求2所述的編碼基因。
9.一種淋巴細(xì)胞增殖劑，其活性成分為權(quán)利要求I所述的多肽或/和權(quán)利要求2所述的編碼基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了功能性結(jié)核分枝桿菌抗原多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的多肽，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。該多肽可刺激H37Rv感染小鼠脾臟細(xì)胞和淋巴細(xì)胞顯著增殖，并可以與感染小鼠血清發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，說明此多肽具有抗原性，可用于開發(fā)新型結(jié)核病預(yù)防性和治療性疫苗。
文檔編號C12N5/078GK102675425SQ20121011486
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者于楊, 劉海鷹, 張艷, 金奇 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所