專利名稱：核酸探針檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及核酸探針檢測方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
生物分子檢測在分子診斷、工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測以及生化防御等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。隨著應(yīng)用的進一步發(fā)展，開發(fā)快速、簡單和低成本的生物傳感器顯得非常重要。納米材料由于其獨特的光學(xué)、電學(xué)以及催化特性，能很好的解決其中部分問題。特別是近些年，很多 研究人員把目光投向基于納米材料的生物傳感器，這些生物傳感器利用了不同組分、尺寸、相貌的納米材料與生物分子間的相互作用。最具代表的是美國西北大學(xué)的Mirkin教授組開發(fā)的一系列基于納米金的高靈敏度的生物傳感器(N. L. Rosi, C. A. Mirkin, Chem.Rev. 2005，105，1547.)。核酸探針是以病原微生物DNA或RNA的特異性片段為模板，人工合成的帶有放射性或生物素標(biāo)記的單鏈DNA片段，可用來快速檢測病原體。核酸探針將一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或熒光染料等標(biāo)記后制成的探針?？膳c固定在硝酸纖維素膜的DNA或RNA進行互補結(jié)合，經(jīng)放射自顯影或其他檢測手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。利用熒光標(biāo)記的DNA探針均能檢測核酸，具有一些內(nèi)在的優(yōu)點，如操作方便、具有很快的雜交動力學(xué)以及能夠和實時定量PCR或者原位細(xì)胞成像兼容。一般此類探針都由熒光基團和淬滅基團組成，基于能量共振轉(zhuǎn)移原理。隨著DNA雜交發(fā)生，熒光基團和淬滅基團距離發(fā)生改變，導(dǎo)致熒光變化。近些年，為了增加此類探針的信噪比，傳統(tǒng)的有機熒光 基團和淬滅基團被量子點、納米金和單壁碳納米管取代。石墨烯(graphene)是由單層碳原子構(gòu)成的二維納米材料,該材料具有獨特的電學(xué)、熱學(xué)和力學(xué)性質(zhì)，并且氧化之后的石墨烯具有很好的水溶性，因此該材料在納米電子學(xué)和納米復(fù)合材料領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛。石墨烯和石墨一樣屬于復(fù)式六角晶格，在二維平面上每個碳原子以sp2雜化軌道相銜接，也就是每個碳原子與最近鄰的三個碳原子間形成三個O鍵。剩余的一個P電子軌道垂直于石墨烯平面，與周圍原子形成鍵，碳原子間相互圍成正六邊形平面蜂窩形結(jié)構(gòu)，這樣在同一原子面上只有兩種空間位置相異的原子。最近，一些研究人員通過理論模擬發(fā)現(xiàn)，石墨烯具有長程納米尺度上的能量轉(zhuǎn)移特性，因此可以作為一種超強淬滅劑(R. S. Swathi, K. L. Sebastian, J. Chem. Phys.2008， 129， 054703)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題在于提供一種具有更高靈敏度和信噪比的基于石墨烯的核酸探針檢測方法。本發(fā)明的所要解決的又一問題，在于提供上述的核酸探針檢測試劑盒。本發(fā)明的所要解決的又一問題，在于提供上述的核酸探針檢測試劑盒的應(yīng)用。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明第一方面提供的技術(shù)方案是核酸探針檢測方法，其特征在于，包括以下步驟，
(1)氧化石墨烯的制備，
(2)準(zhǔn)備熒光基團標(biāo)記的核酸探針，及準(zhǔn)備待檢測、鑒定和/或定量的樣品，
(3)將步驟(I)中的氧化石墨烯與步驟(2)中的熒光基團標(biāo)記的核酸探針、待檢測、鑒定和/或定量的樣品進行混合，
(4)將上述的混合產(chǎn)物進行分離，檢測分離產(chǎn)物的熒光量。優(yōu)選地，所述步驟(3)中，氧化石墨烯和熒光基團標(biāo)記的核酸探針進行混合，然后加入待檢測、鑒定和/或定量的樣品。優(yōu)選地，步驟(3)中反應(yīng)的溫度為20°C -37 °C，混合時間為1—30分鐘。
優(yōu)選地，步驟(3)中反應(yīng)的溫度為37 °C，混合時間為I分鐘。優(yōu)選地，所述的氧化石墨烯為片層結(jié)構(gòu)，每片面積大小在300-500平方納米范圍內(nèi)，片層厚度在0. 5 2nm范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述的熒光基團標(biāo)記的核酸探針為熒光標(biāo)記的適配體。優(yōu)選地，所述的熒光基團為FAM或ROX或CY5。優(yōu)選地，反應(yīng)體系為pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液，其具體配方為100 mM NaCl, 7.7mM Na2HPO4, 2. 3 mM NaH2PO4。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明第二方面提供的技術(shù)方案是一種核酸探針檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括熒光基團標(biāo)記的核酸探針、氧化石墨烯。優(yōu)選地，所述的氧化石墨烯為片層結(jié)構(gòu)，每片面積大小在300-500平方納米范圍內(nèi)，片層厚度在0. 5 2nm范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述的熒光基團標(biāo)記的核酸探針為熒光標(biāo)記的適配體。優(yōu)選地，試劑盒中采用pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液，其具體配方為100 mM NaCl,
7.7 mM Na2HPO4, 2. 3 mM NaH2PO4。優(yōu)選地，熒光標(biāo)記的適配體可以根據(jù)具體的檢測需要而選用相應(yīng)的適配體，且當(dāng)適配體種類為一種以上，其上各自的熒光基團的激發(fā)和發(fā)射波長不能有重疊。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明第三方面提供的技術(shù)方案是前述的試劑盒在制備用于核酸探針檢測方法的制品中的應(yīng)用。在本文中，術(shù)語“氧化石墨烯”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的含義，本發(fā)明的石墨烯(Graphene)是納米石墨烯納米材料。氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)具有與突光基團進行能量共振轉(zhuǎn)移，從而猝滅熒光的特性。GO與單鏈核酸之間存在較強的作用，熒光基團標(biāo)記的單鏈核酸被吸附到GO表面，則熒光基團靠近GO表面，被激發(fā)的能量轉(zhuǎn)移到GO表面，則檢測不到熒光。而GO對核酸雙鏈的作用很弱，雙鏈DNA遠(yuǎn)離G0，熒光基團標(biāo)記的核酸則在相應(yīng)波長激發(fā)下發(fā)出熒光。探針是以病原微生物DNA或RNA的特異性片段為模板，人工合成的帶有放射性或生物素標(biāo)記的單鏈DNA片段，可用來快速檢測病原體。核酸探針將一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或熒光染料等標(biāo)記后制成的探針?？膳cDNA或RNA進行互補結(jié)合，經(jīng)放射自顯影或其他檢測手段就可以判定是否有同源的核酸分子存在。本專利申請中的術(shù)語“適配體”是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，指的是能夠與特定的靶分子結(jié)合的單鏈核酸，包括DNA或RNA。本發(fā)明使用的核酸適配體5’端修飾有不同的熒光基團。本發(fā)明中，適配體aptamer鏈用不同的突光基團標(biāo)記， 氧化石墨烯(GO)和DNA之間的相互作用，當(dāng)存在待檢測的DNA時，熒光基團標(biāo)記的互補DNA與靶DNA相互雜交，由于GO對雙鏈的作用很弱，雙鏈DNA遠(yuǎn)離G0，熒光基團在相應(yīng)波長激發(fā)下發(fā)出熒光。而沒有靶DNA時，由于GO與單鏈DNA之間存在較強的作用，熒光基團標(biāo)記的DNA被吸附到GO表面，熒光基團靠近GO表面，被激發(fā)的能量轉(zhuǎn)移到GO表面，沒有熒光。通過熒光的數(shù)值我們可以判斷靶DNA的存在。本發(fā)明旨在建立一種用于DNA檢測的探針，該探針利用了 DNA/G0之間的相互作用。同時，該策略不限于DNA的檢測，還可以檢測腺嘌呤和重金屬離子等。
本專利申請中的術(shù)語“熒光基團”是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如常用的FAM、R0X、CY5。修飾好的熒光基團的核酸適配體可以從生物公司購買，但在熒光基團的選擇上要求各個核酸適配體熒光基團的激發(fā)和發(fā)射波長不能有重疊，因此也不宜采用磷光基團。相對于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點是
I.氧化石墨烯的易合成和探針DNA的單標(biāo)記特點使得該探針能夠成為低成本、快速檢測方法的首選之一。整個檢測過程耗時短，無需復(fù)雜儀器及特別技巧，尤其是該方法可以利用未經(jīng)精度提純的待測樣品直接檢測這樣極大地方便了檢測操作，節(jié)省了試劑使用并加快了檢測進程。相對較高的檢測靈敏度，特異性強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高。由于石墨烯表面積大以及其良好的淬滅效果，該探針能同時檢測多個不同待檢測物質(zhì)并且比傳統(tǒng)的分子信標(biāo)能提高至少一個數(shù)量級。不會出現(xiàn)適配體與靶分子(MAM mRNA)和其他非特異核酸序列互相干擾的情況。氧化石墨烯具有較高的淬滅能力，大大提高了核酸分子檢測的靈敏度和特異性。檢測分子種類多，本發(fā)明的采用的探針結(jié)合適配體技術(shù)，該探針將熒光基團標(biāo)記的適配體及其氧化石墨烯技術(shù)結(jié)合，可以在均相體系中檢測多種小分子以及DNA以外的分子，比如腺嘌呤、重金屬離子，該策略為快速檢測多種小分子提供一種潛在的方法。


下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述
圖I為一實施例合成的GO片層形貌、尺寸和高度信息。圖2為GO的核酸探針檢測DNA原理示意圖。圖3為設(shè)計的探針用于DNA檢測的結(jié)果。不同熒光基團(圖中選取了 FAM、ROX和CY5三種熒光基團，各自最佳激發(fā)波長為494納米、587納米和643納米)標(biāo)記的DNA混合后加入分別與FAM標(biāo)記DNA互補(3A)、CY5標(biāo)記DNA互補(3B)以及與ROX標(biāo)記DNA互補(3C)的靶DNA，然后用各自最佳激發(fā)波長激發(fā)。圖4為一實施例中核酸探針對腺嘌呤(ATP)的檢測結(jié)果。圖5為一實施例中核酸探針對汞離子(Hg2+)的檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。以下將以舉例形式進行說明，如有未詳盡之處，可以參見常用的實驗手冊，如《分子克隆實驗手冊》以及所用試劑和儀器的廠商說明書。腺嘌呤(ATP)、鳥嘌呤(GTP)、胞嘧啶(CTP)、胸腺嘧啶(TTP)、ATP特異性結(jié)合的FAM標(biāo)記的適配體DNA(aptamer)和汞離子(Hg2+)特異性結(jié)合的DNA購自上海生物工程有限公司，汞離子(Hg2+)以及其他金屬離子購自國藥集團，GO由本實驗室合成。實施例I氧化石墨烯的合成
GO 的合成主要參考相關(guān)文獻(W. Hummers, J. R. Offeman, J. Am. Chem. Soc.1958，80，1339)。通?；瘜W(xué)合成的GO片層都在幾百納米，大小尺寸主要分布在300-500納米，但大小不影響檢測結(jié)果。熒光標(biāo)記的DNA在50個堿基對時檢測效果比較好。利用GO和DNA的相互作用可以實現(xiàn)多種DNA或小分子的檢測。
的合成
合成基本步驟如下4克石墨粉加入到溫度為80°C的H2S04、K2S208、P205的混合液中，反應(yīng)6小時后將該混合液冷卻到室溫。然后，將該混合液用去離子水稀釋到300毫升，用0. 22微米的濾膜抽濾，放在60°C烘干，得到的樣品(2g)再用92毫升H2SO4和KMnO4 (12g)放在冰浴中攪拌，15分鐘后加入NaNO3 (2g)，放在35°C攪拌2小時后稀釋到200毫升，然后用30%的H2O2終止。終產(chǎn)物用1%的HCl洗3次，得到的溶液用300瓦超聲儀超聲I. 5小時，沒有剝離的石墨通過離心分離。片層的表征
用原子力顯微鏡(AFM)測量GO片層的形貌的厚度，在氣相中進行，采用接觸模式(Tapping-mode)，得到的GO片成大小在300-500納米，有少數(shù)微米級別的片層，其厚度在I納米左右，與文獻報道相符。采用透射電子顯微鏡(TEM)表征其精細(xì)結(jié)構(gòu)。圖I是原子力顯微鏡(AFM)對合成的氧化石墨烯(GO)的表征圖，從圖中可以得到GO的形貌(片層結(jié)構(gòu))、尺寸大小(平均值約為300納米X 500納米)，高度約為I納米，這些信息可以確定得到的是單片層的氧化石墨烯。實施例2核酸探針的檢測
2.I根據(jù)標(biāo)記的熒光基團的效率不同，將不同量的不同熒光基團標(biāo)記的DNA探針(FAM,ROX和CY5)三種熒光基團標(biāo)記的DNA探針的量分別為5 pmol, 10 pmol和20 pmol)和待檢測溶液混合，混合條件為37°C，30分鐘，混合溶液含有相應(yīng)的磷酸緩沖液(PBS)，其中PBS的濃度為0. I M0然后加入適量GO溶液。在上述熒光探針DNA的加入量時，通常氧化石墨烯的濃度為I 50 ii g/mL ;熒光濃度范圍為I 100pM。本實施例中，GO的最終濃度為5 u g/mL。DNA雜交液和GO混合的時間在I分鐘內(nèi)，這樣可以有效區(qū)分不同濃度靶DNA的熒光強度。待檢測溶液中的靶DNA與其互補的熒光探針雜交形成雙鏈，遠(yuǎn)離GO表面，發(fā)出熒光。采用不同的熒光染料基團的相應(yīng)激發(fā)波長激發(fā)，不同的波長激發(fā)時間間隔控制在15秒鐘內(nèi)。使用熒光光度計測量混合溶液的熒光強度，當(dāng)用熒光染料基團的相應(yīng)激發(fā)波長激發(fā)后，得到該染料基團的發(fā)射光譜，在相應(yīng)的發(fā)射峰出現(xiàn)最大信號值，而其他染料不會有信號產(chǎn)生，從而可以檢測靶DNA的存在。(附圖3A，3B，3C)
實施例33.I熒光基團FAM標(biāo)記的與ATP特異性結(jié)合的適配體aptamer與GO混合，不加入ATP時，F(xiàn)AM標(biāo)記的aptamer吸附到GO表面。用494納米激發(fā)，由于標(biāo)記的aptamer熒光大部分被GO淬滅，因此熒光信號很低。將突光基團FAM標(biāo)記的aptamer與ATP混合,aptamer與之形成三維剛性結(jié)構(gòu),GO基本不能淬滅該結(jié)構(gòu)的熒光，所以熒光信號很強。將熒光基團FAM標(biāo)記的aptamer與CTP、GTP或TTP混合，其熒光信號比加入ATP時低，說明該策略有很好的選擇性，見附圖4。
實施例4
4.I熒光基團FAM標(biāo)記的與Hg2+特異性結(jié)合的DNA片段與GO混合，不加入Hg2+。一定時間后用494納米激發(fā)，測得其熒光信號很低(附圖5，橫坐標(biāo)O)。熒光基團FAM標(biāo)記的與Hg2+特異性結(jié)合的DNA片段和Hg2+混合，反應(yīng)一段時間，DNA片段與Hg2+作用后形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，加入一定量GO溶液，用494納米激發(fā)測得其熒光信號很強(附圖5，橫坐標(biāo)Hg2+)。突光基團FAM標(biāo)記的DNA片段和其他不同金屬離子混合,反應(yīng)一段時間后加入一定量GO溶液，用494納米激發(fā)測得其熒光信號很弱，說明該策略有很好的選擇性，如附圖5所示其他金屬離子的反應(yīng)。上述實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種核酸探針檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (1)氧化石墨烯的制備， (2)準(zhǔn)備熒光基團標(biāo)記的核酸探針，及準(zhǔn)備待檢測、鑒定和/或定量的樣品， (3)將步驟(I)中的氧化石墨烯與步驟(2)中的熒光基團標(biāo)記的核酸探針、待檢測、鑒定和/或定量的樣品進行混合； (4)將上述的混合產(chǎn)物進行分離，檢測分離產(chǎn)物的熒光量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸探針檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中，氧化石墨烯和熒光基團標(biāo)記的核酸探針進行混合，然后加入待檢測、鑒定和/或定量的樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸探針檢測方法，其特征在于，步驟(3)中反應(yīng)的溫度為.20 0C -37 °C，混合時間為1—30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸探針檢測方法，其特征在于，步驟(3)中反應(yīng)的溫度為37°C，混合時間為I分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸探針檢測方法，其特征在于，所述的氧化石墨烯為片層結(jié)構(gòu)，每片面積大小在300-500平方納米范圍內(nèi)，片層厚度在0. 5 2nm范圍內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸探針檢測方法，其特征在于，所述的熒光基團標(biāo)記的核酸探針為熒光標(biāo)記的適配體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸探針檢測方法，其特征在于，所述的熒光基團為FAM或ROX 或 CY5。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸探針檢測方法，其特征在于，反應(yīng)體系為pH7. 4的磷酸鹽緩沖溶液。
9.一種核酸探針檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括熒光基團標(biāo)記的核酸探針、氧化石墨烯。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸探針檢測試劑盒，其特征在于，所述的氧化石墨烯為片層結(jié)構(gòu)，每片面積大小在300-500平方納米范圍內(nèi)，片層厚度在0. 5 2nm范圍內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸探針檢測試劑盒，其特征在于，所述的熒光基團標(biāo)記的核酸探針為熒光標(biāo)記的適配體。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA探針檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中采用pH7. 4的磷酸鹽緩沖溶液。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA探針檢測試劑盒，其特征在于，熒光標(biāo)記的適配體可以根據(jù)具體的檢測需要而選用相應(yīng)的適配體，且當(dāng)適配體種類為一種以上，其上各自的熒光基團的激發(fā)和發(fā)射波長不能有重疊。
14.根據(jù)權(quán)利要求9-13任一項所述的試劑盒在制備用于權(quán)利要求I所述方法的制品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明所要解決的問題在于提供一種具有更高靈敏度和信噪比的基于石墨烯的核酸探針檢測方法及其試劑盒和應(yīng)用。將氧化石墨烯與熒光基團標(biāo)記的核酸探針、待檢測、鑒定和/或定量的樣品進行混合，最后檢測分離產(chǎn)物的熒光量。氧化石墨烯的易合成和探針DNA的單標(biāo)記特點使得該探針成為低成本、快速檢測方法的首選之一。由于石墨烯表面積大以及其良好的淬滅效果，該探針能同時檢測多個不同待檢測物質(zhì)并且比傳統(tǒng)的分子信標(biāo)能提高至少一個數(shù)量級。不會出現(xiàn)適配體與靶分子(MAMmRNA)和其他非特異核酸序列互相干擾的情況。
文檔編號C12Q1/68GK102643916SQ20121011616
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月19日
發(fā)明者宋世平, 樊春海, 黃慶 申請人:華森新科(蘇州)納米技術(shù)有限公司