專利名稱：油棕猝倒病菌的lamp檢測試劑及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及油棕猝倒病菌的檢測技術(shù)，具體涉及油棕猝倒病菌的LAMP檢測試劑及試劑盒。
背景技術(shù)：
油棕猝倒病是油棕上的ー種重要病害，由華麗腐霉(Pythium splendens、油棕猝倒病菌)引起的，該病菌寄主范圍很廣，除侵染油棕(Elaeis guineensis)以外,還能夠侵染玉米(Zea mays)、向日葵krielianthus annuus)、大麥(Hordeum vulgare)、黃瓜(Cucumissativus)、番暮(Ipomoea batatas)、小麥(Triticum aestivumノ、査丑(Vicia faoa)、Si豆(Vigna sinensis)、辣椒屬(Capsicum spp.)、煙草(Nautilocaly x Iynchei)、天竺葵屬(Pelargonium spp.)、秋海棠屬(Begonia spp.)等250余種植物，引起寄主幼苗整株失水萎蔫及根部、莖基部、切ロ變褐腐爛與皮層脫落等癥狀。目前油棕猝倒病菌的檢測方法主要包括傳統(tǒng)的形態(tài)學特征結(jié)合生理生化性狀的生物學鑒定、核糖體DNA序列分析、特異性引物PCR和RFLP等。生物學鑒定方法耗エ費吋，而且某些形態(tài)特征不穩(wěn)定，可能退化或消失，并且油棕猝倒病菌為異宗配合型，単性培養(yǎng)不能產(chǎn)生有性器官，更增加了其鑒定難度；核糖體DNA序列分析，雖然獲得生物信息量大，但是實驗操作繁瑣，檢測周期長;Wang等研制的特異性引物PCR靈敏度不是很高，無法檢測較低含量的DNA樣品；RFLP可省去序列分析中許多繁瑣エ序，但是需要進行多種酶切也費時費エ，并且以上的分子檢測方法都要進行電泳等PCR后處理，接觸有毒試劑溴化こ錠，還易發(fā)生交叉污染而造成假陽性結(jié)果。環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)是日本學者 Notomi 在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的ー種新型體外核酸擴增方法，該技術(shù)依賴能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件下高效、快捷、特異擴增靶序列。LAMP產(chǎn)物的檢測一般采用瓊脂糖凝膠電泳、濁度觀察、熒光染料目測觀察等方法。LAMP檢測無需特殊的設備，并且不需EB等有毒試劑，操作簡便且更安全。檢測結(jié)果可以直接用肉眼觀察，LAMP方法安全、快捷、高效、高靈敏度且無設備及技術(shù)限制，具有其他技術(shù)所無法替代的優(yōu)勢。目前，該技術(shù)已廣泛應用于細菌或病毒的定性定量檢測、臨床疾病的診斷、動植物中致病微生物的檢測等相關(guān)領(lǐng)域。對油棕猝倒病菌的檢測未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了應用環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)檢測油棕猝倒病菌的試劑及試劑盒，可以實現(xiàn)對油棕猝倒病菌進行快速、安全、特異、靈敏、簡便的現(xiàn)場檢測，克服已有用PCR檢測油棕猝倒病菌不能在生產(chǎn)中應用的問題。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為油棕猝倒病菌的LAMP檢測試劑及試劑盒，主要包括三個部分
I、根據(jù)GenBank中已登錄的/7. splendensYl^區(qū)序列，采用Blast程序進行同源性比較，在序列的保守區(qū)，使用PrimerExploer V4(http://primerexlorer. jp),設計提供3對用于檢測油棕猝倒病菌的LAMP引物序列，依次命名為F3、B3、FIP、BIP、LoopU Loop2，其核苷酸序列分別如下
F3 引物 5’ -TGCAGATGTGAAGTGTCTCG-3’，
B3 引物 5’ -ACAAACGGATTCCACACTCA-3’，
FIP 引物 5，-GCACCACACTTCACACAGACCATTTTCATGGTTGCGTTTTCGGAC-3，，
BIP 引物 5，-GGCTTTTGGCGACTTCGGCAITTTCGAAGCCTAACATACCGCG-3’，
Loopl 引物 5，-CCCTGTCCAT TTAAAAGGAC TCG-3’，
Loop2 引物 5’ -TGAACATATG GAGACTACCT CGG-3’ 。
2、配制LAMP反應體系；25 mL反應體系的組份包括I X ThermoPol緩沖液(NEWENGLAND Biolabs 公司)2. 5 μ L，濃度 5mM 的 dNTP 液 2 μ L (TAKARA 公司公司)，濃度 50mM的MgCl2液(TAKARA公司公司)2 μ L，濃度10 M的甜菜堿液(Betaine) 2 μ L，濃度8 U /μ L的Bst DNA聚合酶液(NEW ENGLAND Biolabs公司)I μ L，濃度都為10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ L，濃度都為10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各3. 5 μ L，濃度都為10 μ M的Loopl引物溶液和Loop2引物溶液各I μ L ;由該25 mL反應體系的組份組成100 X 25 μ L試劑盒；25 mL反應體系還包括DNA模板lmL，用ddH20補足25mL。3、通過LAMP反應程序?qū)悠纺０暹M行擴增,確定了最佳的反應體系和反應條件擴增反應溫度為63°C，擴增反應時間為60 min。本發(fā)明所提供的油棕猝倒病菌的LAMP檢測試劑及試劑盒具有如下優(yōu)點
一、靈敏度高，對油棕猝倒病菌的檢測靈敏度為O. 12 ng/mL，對油棕猝倒病菌的檢測靈敏度比常規(guī)PCR高100倍；
ニ、特異性強，所用的特異引物根據(jù)油棕猝倒病菌的ITS區(qū)中的六個不同區(qū)域設計，特異性比常規(guī)PCR要強；
三、該試劑檢測時間短，Ih左右可獲得檢測結(jié)果，比常規(guī)PCR檢測節(jié)省2- 4 h;
四、該試劑對儀器設備要求低，不需要普通PCR所用的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)，只需要ー個水浴鍋就可以完成檢測，適合基層檢驗部門及小型實驗室與現(xiàn)場監(jiān)測等使用；
五、應用該試劑檢測操作簡單、結(jié)果明顯，整個檢測過程不涉及復雜儀器和設備，稍具分子生物學基礎(chǔ)的人員即可完成操作；檢測結(jié)果清晰明顯，直接用眼睛觀察就可以判斷；
六、該試劑對人和環(huán)境較安全，檢測過程中不使用EB等有毒試劑，對人和環(huán)境非常安全。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進ー步詳細描述。實施例I、引物設計、篩選和合成根據(jù)GenBank中已登錄的/7·區(qū)序列，采用Blast程序進行同源性比較，根據(jù)華麗腐霉ITS區(qū)的保守片段，使用PrimerExploerV4 (http://primerexlorer. jp)設計和篩選出下述LAMP的3對引物，引物的序列如下所示
F3 引物TGCAGATGTGAAGTGTCTCG、B3 引物ACAAACGGATTCCACACTCA、
FIP 引物GCACCACACTTCACACAGACCATTTTCATGGTTGCGTTTTCGGAC、BIP 引物GGCTTTTGGCGACTTCGGCATTTTCGAAGCCTAACATACCGCG、Loopl 引物CCCTGTCCATTTAAAAGGACTCG，Loop2引物TGAACATATGGAGACTACCTCGG，引物 FIP (Flc+TTTT+F2)、引物 BIP (Blc+TTTT+B2)的序列與油棕猝倒病菌的ITS區(qū)上相應位置核苷酸序列相同或者互補，引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司。實施例2、LAMP檢測試劑及試劑盒以上述F3引物、B3引物、BIP引物、FIP引物、Loopl引物和Loop2引物分別配制成引物濃度都為IOyM的F3引物溶液、Β3引物溶液、BIP引物溶液、FIP引物溶液、Loopl引物溶液和Loop2引物溶液，并與I XThermoPol緩沖液、dNTP、MgCl2、甜菜堿、Bst DNA聚合酶一起組成LAMP檢測油棕猝倒病菌的試劑；該試劑組成的100X 25 μ L反應體系的試劑盒，25 μ L反應體系:1 XThermoPol緩沖液2.5 μ L，濃度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液I μ L，濃度5mM的dNTP液2 μ L，濃度10 M的甜菜堿液(Betaine) 2yL，濃度50mM的MgCl2液2 μ L，濃度都 為10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ L，濃度都為10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各3. 5 μ L，濃度都為10 μ M的Loopl引物溶液和Loop2引物溶液各I μ L，這樣就25 mL反應體系中dNTP終濃度為O. 4mM，MgCl2終濃度為4 mM，甜菜堿終濃度為O. 8 M，外引物F3和B3終濃度都為O. 2 mM，內(nèi)引物FIP和BIP終濃度都為I. 4 mM，環(huán)引物Loopl及Loop2終濃度都為O. 4 mM, Bst DNA聚合酶終濃度為O. 32 U/mL。實施例3、特異性試驗收集了不同相關(guān)度的菌株18株，華麗腐霉2株(ATCC96757、ATCC32229)，刺腐霉，寬雄腐霉，異宗腐霉，鐘器腐霉，畸雌腐霉，終極腐霉，側(cè)雄腐霉，瓜果腐霉，A syIvaticum, P. takayamanum , P. attrantheridi酬，佩尊、疫霉,棕櫚疫霉，根鏈格孢，灰葡萄孢，枯草芽孢桿菌各一株，分別提取基因組DNA，DNA模板可以用常規(guī)的組織核酸提取方法制備，也可以用商品化的組織DNA提取試劑盒(如PlantGenomic DNA Kit、TIANGEN公司提供)制備，在此不作詳述，得到DNA模板溶液，用實施例2LAMP檢測試劑及試劑盒對上述18種菌株DNA模板溶液進行LAMP檢測，25 μ L反應體系IXThermoPol 緩沖液(Reaction) 2.5yL，濃度 8 U /μ L 的 Bst DNA 聚合酶液 lyL，濃度5mM 的 dNTP 液 2 μ L，濃度 10 M 的甜菜堿液(Betaine) 2 μ L，濃度 50mM 的 MgCl2 液 2 μ L，濃度都為10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ L，濃度都為10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各3. 5 μ L，濃度都為10 μ M的Loopl引物溶液和Loop2引物溶液各I μ L，DNA模板lmL，用ddH20補足25mL，可以用雙蒸水作為陰性對照。在63で水浴恒溫擴增反應60 min，擴增結(jié)束后擴增產(chǎn)物中加入IyL SYBR Green I觀察顏色變化，結(jié)果2株華麗腐霉(ATCC96757、ATCC32229 )的擴增產(chǎn)物呈綠色熒光，其它菌株呈橙紅色及無熒光，說明本發(fā)明的LAMP檢測試劑及試劑盒對華麗腐霉特異性高。實施例4、靈敏性試驗對實施例3的華麗腐霉ATCC96757菌株DNA模板溶液經(jīng)紫外分光光度計測定DNA濃度后，做10倍系列稀釋(I(T1-KTs),用實施例2 LAMP檢測試劑及試劑盒進行LAMP敏感性檢測(在63で水浴恒溫擴增反應60 min)，同時用25 μ L反應體系PCR檢測為10 X PCR緩沖液 2. 5 μ L,25 mmol/L MgCl2 4 μ L, 5 U/μ L Taq聚合酶O. 25 μ L，10 mmol/L dNTP 0. 5 μ L，10 μ mol/L引物(可以用Wang等研制引物或上述F3、B3引物對或FIP BIP引物對)各O. 5 μ L，DNA模板5 μ L，カロ ddH20補充至25 μしPCR反應條件為94°C5 min ；94°C 30 s，62°C 30 s，72°C 30 s，35 個循環(huán)；72°C 10 min, 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測；結(jié)果LAMP檢測方法對油棕猝倒病菌的檢測極限可達10_3，PCR檢測極限為10，LAMP檢測比PCR檢測靈敏度高I OO倍。實施例5、反應體系的優(yōu)化與實施例3基本相同，只是25 μ L反應體系中，分別對濃度50mM的MgCl2用0、l、2、3、4、5yL擴增反應試驗，對濃度10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液用O. I、O. 2、O. 3、O. 4、O. 5 μ L擴增反應試驗，對濃度10 μ M的BIP引物溶液和FIP弓I物溶液用I、2、2. 5、3、3. 5、4、4. 5、5、6 μ L擴增反應試驗，對濃度為10 μ M的Loop I弓I物溶液和Loop2引物溶液各O. 2,0. 5,0. 8、I、I. 5、2、2· 5、3μ L，對濃度10 M的甜菜堿用0、1、2、
3、4、5 μ L擴增反應試驗，對濃度5mM的dNTP用O、1、2、3、4、5 μ L擴增反應試驗，對反應溫度進行61、62、63、64、65°C擴增反應試驗，結(jié)果MgCl2用2 μ L，F(xiàn)3引物溶液和Β3引物溶液都用O. 5μ L，BIP引物溶液和FIP引物溶液用3. 5μ L，Loopl引物溶液和Loop2引物溶液
Iμ L，甜菜堿用2 μ L，dNTP用2 μ L，反應溫度為63°C為優(yōu)，所以建立I X ThermoPol緩沖液
2.5 μ L，濃度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液I μ L,濃度5mM的dNTP液2 μ L，濃度10 M的甜菜堿液(Betaine) 2 μ L ,濃度50mM的MgCl2液2 μ L,濃度都為10 μ M的F3引物溶液和 Β3引物溶液各O. 5 μ L，濃度都為10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各3. 5 μ L，濃度都為10 μ M的Loopl引物溶液和Loop2引物溶液各I μ L的25反應體系的試劑盒；該試劑盒也可以是100X25yL ,200Χ25μ L、300Χ25μ L反應體系，或100Χ20μ L反應體系等，在此不一一舉例。實施例6、應用收集送檢苗木3份，接種華麗腐霉后，取待檢植物組織O. 5g，采用Plant Genomic DNA Kit進行DNA的提取純化，制備成用于LAMP反應的DNA樣品模板，進行實施例2 LAMP檢測試劑及試劑盒進行LAMP敏感性檢測(在63で水浴恒溫擴增反應60 min),結(jié)果3份均呈綠色熒光反應。
權(quán)利要求
1.油棕猝倒病菌的LAMP檢測試劑，包括IX ThermoPol緩沖液、dNTP、MgCl2、甜菜堿、Bst DNA聚合酶、外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP和環(huán)引物Loopl和Loop2，其特征在于所述外引物F3的核苷酸序列為TGCAGATGTG AAGTGTCTCG，所述外引物B3的核苷酸序列為ACAAACGGATTCCACACTCA，所述內(nèi)引物FIP的核苷酸序列為GCACCACACT TCACACAGACCATTTTCATGGTTGCGTTTTCGGAC,所述內(nèi)引物 BIP 的核苷酸序列為GGCTTTTGGCGACTTCGGCATTTTCGAAGC CTAACATACCGCG,所述環(huán)引物 Loopl 的核苷酸序列為CCCTGTCCAT TTAAAAGGACTCG,所述環(huán)引物Loop2的核苷酸序列為TGAACATATGGAGACTACCTCGG。
2.權(quán)利要求I所述的油棕猝倒病菌的LAMP檢測試劑組成的試劑盒，為100X25μ L反應體系的試劑盒，其特征在于該2 5 μ L反應體系的組份包括I X Th e r mo P ο I緩沖液.2. 5 μ L，濃度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液I μ L,濃度5mM的dNTP液2 μ L，濃度10 M的甜菜堿液2 μ L，濃度50mM的MgCl2液2 μ L，濃度都為10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ L，濃度都為10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各3. 5 μ L，濃度都為10 μ M的Loopl引物溶液和Loop2引物溶液各I μし
全文摘要
本發(fā)明公開了油棕猝倒病菌的LAMP檢測試劑及試劑盒，包括由1×ThermoPol緩沖液、dNTP、MgCl2、甜菜堿、BstDNA聚合酶、外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP和環(huán)引物Loop1和Loop2，外引物F3的核苷酸序列為TGCAGATGTGAAGTGTCTCG，外引物B3的核苷酸序列為ACAAACGGATTCCACACTCA，內(nèi)引物FIP的核苷酸序列為GCACCACACTTCACACAGACCATTTTCATGGTTGCGTTTTCGGAC，內(nèi)引物BIP的核苷酸序列為GGCTTTTGGCGACTTCGGCATTTTCGAAGCCTAACATACCGCG，環(huán)引物Loop1的核苷酸序列為CCCTGTCCATTTAAAAGGACTCG，環(huán)引物Loop2的核苷酸序列為TGAACATATGGAGACTACCTCGG；對華麗腐霉特異性強、靈敏度高，具有檢測時間短、儀器設備要求低、操作簡單和結(jié)果明顯優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/04GK102676659SQ20121011651
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者張慧麗, 徐瑛, 王建峰, 陳先鋒 申請人:寧波檢驗檢疫科學技術(shù)研究院