專利名稱：一種鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒與疫苗毒的pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)的科研和生產(chǎn)領(lǐng)域，特別涉及基于鴨瘟病毒強(qiáng)毒株與弱毒疫苗株UL2基因差異的PCR檢測方法
背景技術(shù)：
由鴨痕病毒(Duckplague virus, DPV)感染所致的鴨痕(Duck plague, DP),又稱鴨病毒性腸炎(Duck viral enteritis, DVE),是鴨、鵝、天鵝等雁形目動(dòng)物的ー種急性接觸 性傳染病，其致病特征是血管損傷、組織出血、消化道和淋巴器官損傷。該病可導(dǎo)致商品水禽的產(chǎn)蛋量下降和死亡，在世界各養(yǎng)鴨地區(qū)都有分布，其預(yù)防和控制已直接關(guān)系到水禽養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。我國鴨瘟的預(yù)防主要采用接種弱毒疫苗，而準(zhǔn)確的診斷、監(jiān)測是有效預(yù)防和控制該病的基礎(chǔ)和前提。目前，報(bào)道的DPV的診斷和監(jiān)測方法有多種，如免疫熒光、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等，但卻未見任何方法可將生產(chǎn)養(yǎng)殖中的鴨是因感染強(qiáng)毒鴨瘟病毒還是因已注射鴨瘟疫苗而呈現(xiàn)的陽性區(qū)分開。因此若已進(jìn)行了鴨瘟病毒免疫的某養(yǎng)殖場出現(xiàn)鴨瘟病毒的診斷和監(jiān)測出現(xiàn)陽性時(shí)，現(xiàn)在的檢測方法無法判斷該鴨場是因感染強(qiáng)毒鴨瘟病毒還是因已注射鴨瘟疫苗而呈現(xiàn)的陽性。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種可鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒與疫苗弱毒的PCR檢測方法。所用鴨瘟病毒模板是各種疑鴨瘟病毒感染的組織病料或已經(jīng)在鴨胚成纖維細(xì)胞DEF上增殖后細(xì)胞病變(CPE)達(dá)60% 70%的DEF中提取，同時(shí)設(shè)立未接毒的DEF或其它相應(yīng)組織材料的陰性對照。所獲得的DNA模板作10倍濃度梯度稀釋以檢測該方法靈敏性，同時(shí)對鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、馬立克氏病毒(MDV)、番鴨細(xì)小病毒(MDPV)、鴨腫頭敗血癥病毒(DSHSV)、鵝細(xì)小病毒(GPV)、禽流感病毒(AIV)、鴨疫里默氏菌(RA)、鴨沙門氏菌(Sal. A)、巴氏桿菌(PM)和鴨大腸桿菌(E. coli)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢測該方法特異性，并設(shè)立空白対照。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為ー種鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒與疫苗弱毒的PCR檢測方法，具體步驟為a利用Primer Premier5. 0軟件，參考強(qiáng)弱韋株UL2基因序列(GenBank登錄號(hào)強(qiáng)毒 JQ647509，EU885419, JQ043216, JQ 248596，JQ 248597，JQ248598 ;弱毒 JQ347517，JQ347518，EF449516，EU082088)設(shè)計(jì)引物，由寶生物生物技術(shù)有限公司合成。上游引物PI : 5 ’ -ACGAGGGAGACCCAAATGAC-3 ’下游引物P2 :5 ’ -TTTATACTGTTCCACAAGGAAGTTG-3 ’b模板DNA的提取(I)材料的預(yù)處理感染DPV的單層細(xì)胞(如鴨胚原代成纖維細(xì)胞或CCL-141等)，當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)達(dá)60% 70%時(shí)，反復(fù)凍融3次，8000r/min 30min，取上清液備用。接種DPV的雞胚或鴨胚，胚死亡后按常規(guī)收取尿囊液，6000r/min IOmin,取上清備用。鴨組織樣品，取鴨組織器官樣品(心、肝、脾、肺、腎、腦、十二指腸、空腸或直腸等)約0. lg，加入滅菌純水I. Oml,使用勻衆(zhòng)器研磨，反復(fù)凍融3次,6000r/min IOmin,取上清備用。血液樣品取200ul全血與I. Oml滅菌純水混合,反復(fù)凍融3次,6000r/min IOmin,取上清備用。(2)DNA 的提?、?890 ill 上清液，加入 IOOiU 10 % SDS，10 yl (10mg/ml)蛋白酶K，混勻；56°C水浴lh，沸水浴lOmin，室溫冷卻加入400^1 Tris飽和酚，混勻，40C 10000r/min 5min 取上清，加入200 U I飽和酚和200 U I氯仿/異戊醇(24/1)，混勻，4°C 10000r/min 5min ;④取上清，加入 400 氯仿 / 異戊醇(24/1)，混勻，4°C IOOOOr/min5min !⑤取上清，加入1/10體積的3mol/L NaAC,2倍體積的冷無水こ醇，混勻，存放于-20°C至少40min ; 4°C 12000r/min 20min，棄上清加入200^1 75%凍こ醇洗滌沉淀，4°C 12000r/min 20min,棄上清，離心真空干燥，加入20 u ITE溶解沉淀，4°C 6000r/min30soc PCR擴(kuò)增DPV UL2基因，同時(shí)設(shè)立陰性及空白對照，反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1. ー種鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒與疫苗毒的PCR檢測方法，其特征是具體步驟為a設(shè)計(jì)擴(kuò)增鴨瘟病毒UL2基因的特異性引物，引物序列為上游引物Pl :5’ -ACGAGGGAGACCCAAATGAC-3’，下游引物 P2 :5’ -TTTATACTGTTCCACAAGGAAGTTG-3’ ；b按常規(guī)方法提取樣品中的核酸； c. PCR檢測，同時(shí)設(shè)立陰性對照；PCR檢測體系具體為2X傻瓜PCR Mixtrue 12. 5 u L,Pl (20pmol/u L) lul, P2 (20pmol/u L) lul，模板溶液 I u L，最后用超純水補(bǔ)至 25 u L ；PCR檢測體系擴(kuò)增參數(shù)具體為95°C預(yù)變性5min，95°C變性lmin，58. 3°C退火lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)40次，最后72°C延伸IOmin ； d瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈照射觀察擴(kuò)增片段的長度，若PCR擴(kuò)增條帶為1018bp，則待測樣品含有鴨瘟病毒強(qiáng)毒，若PCR擴(kuò)增條帶為490bp，則待測樣品含有鴨瘟病毒弱毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)毒與疫苗毒的PCR檢測方法。所述方法為根據(jù)鴨瘟病毒強(qiáng)毒株與弱毒疫苗株UL2基因差異設(shè)計(jì)特異性的引物序列，提取待測樣品的DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)；對PCR結(jié)果進(jìn)行分析，若PCR擴(kuò)增條帶為1018bp，則待測樣品含有鴨瘟病毒強(qiáng)毒，若PCR擴(kuò)增條帶為490bp，則待測樣品含有鴨瘟病毒疫苗弱毒。本發(fā)明提供的針對鴨瘟病毒強(qiáng)毒與疫苗弱毒鑒定的檢測方法，具有簡便、快速、特異、靈敏和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果判斷方法簡便，適合于科研、臨床和基層實(shí)驗(yàn)室使用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102643932SQ201210116719
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者尹雪琴, 汪銘書, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)