專利名稱：產(chǎn)琥珀酸放線桿菌菌株yh123及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌YH123及其應(yīng)用，具體是其在琥珀酸發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物及其發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
琥珀酸(又稱丁二酸(Succinic acid))是一種常見的天然有機酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中。作為一種重要的化工原料，它在醫(yī)藥、食品以及表面活性劑等行業(yè)也有著廣泛的用途。琥珀酸可作為合成復(fù)雜有機化合物的中間體，也可以作為C4平臺化合物用于合成大宗化學(xué)品以及生物可降解材料，因此丁二酸被認為是繼檸檬酸后最具市場潛力的發(fā)酵有機酸產(chǎn)品。傳統(tǒng)的琥珀酸化學(xué)合成法采用丁烷經(jīng)順丁烯二酸酐通過電解生產(chǎn)，存在成本高和環(huán)境污染等問題，限制了其作為基本化工原料的廣泛應(yīng)用。生物法生產(chǎn)丁二酸是以可再生碳源(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等)和CO2作為主要原料，通過菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，因此新工藝本身不僅擺脫了對石化原料的依賴，而且開辟了對溫室氣體CO2利用的新途徑。一旦實現(xiàn)了丁二酸發(fā)酵的大規(guī)模生產(chǎn)，就可以以丁二酸取代一些石油化工產(chǎn)品，而成本的降低更有利于該產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用，社會、環(huán)境效益更加顯著。天然菌株的產(chǎn)丁二酸能力比較低，發(fā)酵產(chǎn)物多種多樣，對糖或丁二酸的耐受性比較差而使其基本不具有使用價值。因此必須運用生物工程技術(shù)對現(xiàn)有的菌種進行誘變和改造，以期獲得能夠利用可再生碳源、廉價無機氮源、以培養(yǎng)、高轉(zhuǎn)化率、高生產(chǎn)強度的突變菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的之一是提供一株高產(chǎn)琥珀酸放線桿菌。本發(fā)明的技術(shù)目的之二是提供所述高產(chǎn)琥珀酸放線桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)。一、一種產(chǎn)琥拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes) YH123,保藏編號為CCTCC NO M2012072o本發(fā)明所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌YH123將產(chǎn)琥珀酸放線桿菌出發(fā)菌(.ActinobaciIlus succinogenes)NJ 113 CGMCC NO. 1716 經(jīng)等離子體誘變后,利用溴百里磨香酚藍得到變色圈較大的菌株，再經(jīng)厭氧瓶發(fā)酵篩選獲得丁二酸產(chǎn)量高的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌目標菌株。具體的篩選步驟如下
a)等離子誘變將產(chǎn)琥珀酸放線桿菌原始菌株活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35 37°C，IOOmL的厭氧瓶裝液量為40 60mL，充二氧化碳2 3min，培養(yǎng)時間8 10h，得到處于對數(shù)生長期的菌液，將培養(yǎng)的細胞稀釋至OD66tl=O. 2 I. 0，滴加在滅菌冷卻后的載片上，用無菌空氣吹干；以氦氣為放電氣體，射頻功率為80 120W，氣體流量10 30LM，輻照時間為IOs 300s。b)溴百里麝香酚藍平板初篩將誘變后的載片置于裝有0. 5 2mL生理鹽水的具塞試管中，充分震蕩，將載片上的菌體洗脫，稀釋成不同濃度涂布于含溴百里麝香酚藍(0. 10 0. 25g/L)的培養(yǎng)基平板上，35 37°C厭氧培養(yǎng)12 36h，挑選出變色圈明顯大于出發(fā)菌的菌落。c)溴百里麝香酚藍平板復(fù)篩將步驟b)篩選的菌株接種于IOOmL血清瓶，裝液量30 50mL，厭氧培養(yǎng)10 12h，無菌生理鹽水制成OD=O. I的菌懸液，吸取IOML涂布于含有溴百里麝香酚藍(0. 10 0. 25g/L)的常規(guī)固體培養(yǎng)基平板上，在35 37°C下厭氧培養(yǎng)12 36h，挑選出透明圈明顯大于出發(fā)菌的菌落。d)血清瓶發(fā)酵篩選將步驟c)篩出的菌落接入種子培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35 37°C，厭氧培養(yǎng)時間10 12h，然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，接種量6% 10% (V/V)，發(fā)酵溫度35 37°C，厭氧發(fā)酵時間24 48h ;考察步驟c)篩出的菌落發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的能力，同時選出丁二酸產(chǎn)量和產(chǎn)率最高的菌株。在上述篩選方法中步驟a)中所述的等離子誘變方法中，優(yōu)選100W作為射頻功率，10SLM作為氣體流量，60s作為輻照時間。在上述篩選方法中步驟b)和c)所采用的常規(guī)培養(yǎng)基配方為葡萄糖10 20g/L，酵母膏 5 10 g/L，NaH2PO4 2H20 9. 6 15. 5g/L, K2HPO4 3H20 15. 5 21. 4 g/L, NaHCO3 10 18 g/L,玉米衆(zhòng)5 10 g/L,溴百里磨香酌 藍0. 10 0. 25g/L, pH 6. 0 8.0。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂15 g/L。在上述篩選方法中步驟d)所采用的種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖10 20g/L，酵母膏 5 10 g/L，NaH2PO4 2H20 9. 6 15. 5g/L, K2HPO4 3H20 15. 5 21. 4 g/L,NaHCO3 10 18 g/L，玉米漿5 10 g/L, pH 6. 0 8. O。步驟d)所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 10 100 g/L,乙酸鈉 I. 36 2. 8 g/L, NaCl I 2. 2 g/L, CaCl2 0. 2 0. 4 g/L,MgCl2 0. 2 0. 5 g/L, Na2HPO4 0. 31 0. 65 g/L, NaH2PO4 I. 6 3. 5 g/L, K2HPO4 3 6. Ig/L，酵母膏 10 20g/L, pH6. 0 8. O。二、產(chǎn)玻拍酸放線桿菌iActinobacillus)YH123發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法包括如下步驟
1)種子培養(yǎng)將產(chǎn)玻拍酸放線桿菌iActinobacillussuccinogenes) YH123接種至種子培養(yǎng)基中，IOOmL血清瓶裝液量50mL，充CO2 2 3min，培養(yǎng)溫度35 37 °C，培養(yǎng)時間10 12h ；
2)發(fā)酵產(chǎn)丁二酸將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量6% 10%(V/V)，充CO2 2 3min，發(fā)酵溫度35 37°C，發(fā)酵時間為24 48h。上述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任何可以被產(chǎn)琥珀酸放線桿菌利用的培養(yǎng)基成分。在本發(fā)明的實施例中，所述種子培養(yǎng)基組分為葡萄糖10 20g/L，酵母膏 5 10 g/L，NaH2PO4 2H20 9. 6 15. 5g/L, K2HPO4 3H20 15. 5 21. 4 g/L,NaHCO3 10 18 g/L，玉米漿 5 10 g/L, pH 6. 0 8. O。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分為碳源10 100 g/L,乙酸鈉I. 36 2. 8 g/L, NaCl I 2. 2 g/L, CaCl2 0. 2 0. 4 g/L, MgCl2 0. 2 0. 5 g/L, Na2HPO4 0. 31 0. 65 g/L, NaH2PO4
I.6 3. 5 g/L, K2HPO4 3 6. I g/L,酵母膏10 20g/L,碳源為葡萄糖、鹿糖、果糖、木糖中的一種或多種，pH6. 0 8. O。采用上述技術(shù)方案的積極效果本發(fā)明采用等離子體誘變產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(ActinobaciIlus succinogenes) NJ113 CGMCC NO. 1716,利用漠百里磨香酌 藍篩選出高產(chǎn)丁二酸的菌株，較出發(fā)菌株，該菌株能高效地利用不同碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，糖的轉(zhuǎn)化率高、丁二酸的產(chǎn)量高；在3L發(fā)酵罐中，以葡萄糖為碳源，丁二酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率分別達到了33. 2g/L和66. 7%，分別比出發(fā)菌提高了 18. 2%和10. 3%，具有重大的社會意義和經(jīng)濟價值。



圖I是本發(fā)明中產(chǎn)琥珀酸放線桿菌YH123的等離子體存活率曲線。本發(fā)明的生物材料分類命名為產(chǎn)琥拍酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)保藏日期為2012年3月9日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保減中心，簡稱為CCTCC，保減單位地址中國.武漢.武漢大學(xué)；保減編號CCTCC NO M2012072。
具體實施例方式實施例I :將產(chǎn)玻拍酸放線桿菌sWcciflogefles )NJ113進行第一步等離子體誘變的方法
本發(fā)明所使用的出發(fā)菌株產(chǎn)琥拍酸放線桿菌iActinobacillus succinogenes) NJ113的來源在中國專利局或國際專利組織承認的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了專利程序保藏(保藏編號CGMCC No. 1716)的，并在本申請日之前已授權(quán)(專利號200610085415. 9，授權(quán)公告日2009年9月9日，授權(quán)公告號CN100537744C)的生物材料。將產(chǎn)琥拍酸放線桿菌iActinobacillus13原始菌株活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35 37°C，IOOmL血清瓶裝液量為40 60mL，充CO2 2 3min，培養(yǎng)時間8 10h，得到生長旺盛處于對數(shù)生長期的菌液；取新鮮培養(yǎng)的細胞稀釋至細胞濃度OD66tl=O. 2 1.0，滴加在滅菌冷卻后的載片上，用無菌空氣吹干；以氦氣為放電氣體，以100W作為射頻功率，以10SLM作為氣體流量，以10 300s作為輻照時間對菌體進行等離子誘變，誘變后，將載片上的菌膜洗脫下來，計算存活率。實驗結(jié)果如附圖I所示，其中，橫坐標為輻照時間，縱坐標為存活率。實施例2 :產(chǎn)琥拍酸放線桿菌succinogenes)YH123的篩選方法 篩選步驟
I、溴百里麝香酚藍平板初篩
將誘變后的載片置于裝有0. 5 2mL生理鹽水的具塞試管中，充分震蕩，將載片上的菌體洗脫，取適量涂布于含溴百里麝香酚藍(0. 10 0. 25g/L)的培養(yǎng)基平板上，35 37°C厭氧培養(yǎng)12 36h，挑選出變色圈明顯大于出發(fā)菌的菌落45株。2、溴百里麝香酚藍平板復(fù)篩
將篩選的菌株接種于IOOmL的血清瓶，裝液量50mL，充CO2 2min, 35 37°C，厭氧培養(yǎng)10 12h，無菌生理鹽水制成濃度OD=O. I的菌懸液，吸取IOML涂布到含有溴百里麝香酚藍的固體培養(yǎng)基上，35 37°C下厭氧培養(yǎng)12 36h，挑選出透明圈明顯大于出發(fā)菌的菌落；最終菌株YH104和YH123顯示了較強的產(chǎn)酸能力。3、搖瓶發(fā)酵篩選
將菌株YH104、YH123和出發(fā)菌株接入種子培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C，100mL血清瓶裝液量50mL，充CO2 2min，培養(yǎng)時間12h。然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，接種量6% (V/V)，37°C下發(fā)酵，IOOmL血清瓶厭氧發(fā)酵，裝液量30mL，發(fā)酵時間36h后檢測各菌株的產(chǎn)丁二酸量，如表I所示
經(jīng)過平板組合篩選獲得的兩株突變株在發(fā)酵過程中酸的總產(chǎn)量均明顯高于出發(fā)菌株，其中YH104的乙酸產(chǎn)量過高而丁二酸產(chǎn)量較低，而YH123具有較高的丁二酸收率。其中，培養(yǎng)基的配方為
選擇培養(yǎng)基葡萄糖10 20g/L，酵母膏5 10 g/L, NaH2PO4 2H20 9. 6 15. 5g/L, K2HPO4 3H20 15. 5 21. 4 g/L, NaHCO3 10 18 g/L，玉米漿 5 10 g/L，溴百里麝香酚藍0. 10 0. 25g/L，pH 6. 0 8. O。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂15 g/L。種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖10 20g/L，酵母膏5 10 g/L, NaH2PO4 *2H20 9. 6 15. 5g/L，K2HP04 *3H20 15. 5 21. 4 g/L, NaHCO3 10 18 g/L，玉米漿 5 10 g/L, pH
6.0 8. O。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10 100 g/L,乙酸鈉I. 36 2. 8 g/L, NaCl I 2. 2 g/L, CaCl2 0. 2 0. 4 g/L, MgCl2 0. 2 0. 5 g/L, Na2HPO4 0. 31 0. 65 g/L, NaH2PO4 I. 6
3.5 g/L, K2HPO4 3 6. I g/L，酵母膏 10 20g/L, pH6. 0 8. O。優(yōu)選配方為
(I)固體平板培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L，酵母膏5 g/L, K2HPO4 3H20 15. 5 g/L,NaH2PO4 2H20 9.6 g/L，NaHCO 310 g/L，NaCl I. 0 g/L，瓊脂 15 g/L, pH 7. 0 7.2。(2)選擇平板培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L，酵母膏5 g/L, K2HPO4 3H20 15. 5 g/L，NaH2PO4 2H20 9. 6 g/L, NaHCO 3 10 g/L, NaCl I. 0 g/L，溴百里香酚藍 0. I g/L，瓊脂 15g/L, pH 7. 0 7. 2。(3)種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L，酵母膏5 g/L, NaH2PO4 2H20 9.6 g/L,K2HPO4 3H20 15. 5 g/L, NaHCO3 10 g/L，玉米漿 5 g/L, pH 7. 0 7.2。(4)搖瓶發(fā)酵篩選培養(yǎng)基配方為葡萄糖50 g/L,乙酸鈉I. 36 g/L,NaCl I g/L,CaCl2 0. 2 g/L, MgCl2 0. 2 g/L, Na2HPO4 0. 31 g/L, NaH2PO4 I. 6 g/L, K2HPO4 3 g/L，酵母膏10 g/L, MgCO3 45 g/L，pH7. 0 7. 2。需要特別注意的是，上述范圍值是發(fā)明人每次實驗采用的基于上述范圍值端點值和中間值的所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，而最后得到的菌株是上述無數(shù)次采用不同范圍中各點數(shù)值后進行的實驗中篩選得到的其中的一只。實施例3 :產(chǎn)琥拍酸放線桿菌succinogenes)YH123的傳代穩(wěn)定性
在以葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測突變株YH123的傳代穩(wěn)定性，菌株YH123傳代發(fā)酵試驗結(jié)果如表2所示
表產(chǎn)琥拍驗線桿菌YHLH的傳代穩(wěn)定性擁試
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)琥拍酸放線桿菌iActinobacillus保藏編號為CCTCCNO M2012072o
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌YH123在發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌YH123在發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸中的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟 種子培養(yǎng)將產(chǎn)琥珀酸放線桿菌YH123接種至種子培養(yǎng)基中，充CO2 2 3min，培養(yǎng)溫度35 37°C，培養(yǎng)時間10 12h ； 發(fā)酵產(chǎn)丁二酸將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量體積比6% 10%，充CO2 2 3min，發(fā)酵溫度35 37°C，發(fā)酵時間為24 48h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)YH123，保藏號為CCTCC NOM2012072。本發(fā)明還涉及所述產(chǎn)琥珀酸放線桿菌YH123在發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸中的應(yīng)用。該菌株能高效地利用不同碳源發(fā)酵制備丁二酸，糖的轉(zhuǎn)化率高；葡萄糖為碳源時，在3L發(fā)酵罐中丁二酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率分別達到了33.2g/L和66.7%，分別比出發(fā)菌提高了18.2%和10.3%。
文檔編號C12R1/01GK102732449SQ20121012271
公開日2012年10月17日 申請日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者奚永蘭, 姜岷, 張九花, 徐蓉, 戴文宇, 陳可泉, 韋萍 申請人:南京工業(yè)大學(xué)