專利名稱：一種發(fā)酵乳飲料制造方法及其所應(yīng)用的干酪乳桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵乳飲料制造方法及其所應(yīng)用的干酪乳桿菌。
背景技術(shù)：
目前一般采用的發(fā)酵乳飲料的制作方法是將乳酸菌接種到牛奶或其他獸乳或植物乳中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中添加適量的甜味料、香料和果汁，然后再經(jīng)過稀釋和均質(zhì)處理后制得，其中有活菌型和培養(yǎng)后進(jìn)行殺菌的滅菌型乳酸菌飲料兩種，目前活性乳酸菌乳飲料商品中所使用的菌株均以一般益生菌所固有的改善腸內(nèi)菌群和提高免疫力為主，但是這種乳飲料存在的缺點(diǎn)是(I)對于牛奶蛋白過敏者無法使用，(2)且由于生產(chǎn)活性乳酸菌乳飲品需要很高的無菌操作技術(shù)，致使大部分國內(nèi)企業(yè)還停留在生產(chǎn)非活性產(chǎn)品的地步。目前在活性乳酸菌乳飲料商品中，主要是以單一菌株或以數(shù)株乳桿菌發(fā)酵為主，還未見同時(shí)使用乳桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行發(fā)酵的產(chǎn)品。目前的活性乳酸菌乳飲料中均以一般益生菌所固有的改善腸內(nèi)菌群和提高免疫力為主要健康訴求點(diǎn)，還未見尤其是對牛奶蛋白過敏兒童也可以放心飲用的商品。另外活性乳酸菌乳飲料中均以砂糖為主要糖份原料，含熱量高。目前國內(nèi)市場上銷售的活性乳酸菌乳飲料商品中活菌含量太低，再加上含乳飲料國家標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的下限值較低，一般均在IO5個(gè)/毫升以下。(I)至今在酸奶等乳制品和乳飲料中一般均使用保加利亞菌和嗜熱鏈球菌，但該菌株不耐受胃酸和膽汁酸而不能活著到達(dá)腸道，因此也就起不到有效作用。(2)目前生產(chǎn)廠家所使用菌株的功能性，均以一般益生菌所固有的改善腸內(nèi)菌群和提高免疫力為主要健康聲稱。在國內(nèi)還未見降低牛奶蛋白抗原性的菌株。由于生產(chǎn)發(fā)酵型乳酸菌乳飲料需要很高的無菌操作技術(shù)，致使大部分國內(nèi)企業(yè)還停留在生產(chǎn)發(fā)酵后滅菌型(非活性)產(chǎn)品的地步。一般降低了熱量的 產(chǎn)品其口感上很難達(dá)到消費(fèi)者的要求。由于發(fā)酵工藝的差異，目前對發(fā)酵乳飲料在保質(zhì)期內(nèi)很難保持IO6個(gè)/毫升以上活菌數(shù)量級。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種發(fā)酵乳飲料制造方法及其所應(yīng)用的干酪乳桿菌，它不但可以存活狀態(tài)到達(dá)小腸，這樣可以改善腸內(nèi)菌群和提高免疫力的功效，能夠降解牛奶中抗原性以及蛋白質(zhì)的抗原性，減少牛奶中容易引起過敏性抗原蛋白質(zhì)含量。本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種干酪乳桿菌Lactobacillus caseiJY68,其保藏號為 CGMCC No :3567。本發(fā)明還公開了一種發(fā)酵乳飲料制造方法，它包括以下步驟步驟一，準(zhǔn)備干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養(yǎng)液和雙歧桿菌的菌株培養(yǎng)液進(jìn)行活化，將活化后的干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養(yǎng)液和雙歧桿菌的菌株培養(yǎng)液分別接種到滅菌后的質(zhì)量濃度為10-20% w/v的脫脂奶粉中進(jìn)行培養(yǎng)；步驟二，制備原料乳在質(zhì)量濃度為10-20% w/v的脫脂乳粉中添加質(zhì)量濃度為2-4% w/v葡萄糖進(jìn)行攪拌形成原料乳，然后對原料乳進(jìn)行殺菌冷卻；步驟三，將干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養(yǎng)液添加到殺菌后的原料乳中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后的細(xì)菌、酵母和霉菌為零，大腸菌群為陰性；步驟四，制備調(diào)配液將發(fā)酵后的原料乳和無菌水按照1:1的比例混合加入
0.2-0. 4% w/v的食品香料中，攪拌均勻制備成調(diào)配液；步驟五，將步驟三中培養(yǎng)后的原料乳和步驟四中的調(diào)配液與干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養(yǎng)液進(jìn)行混合攪拌后制得發(fā)酵乳制品，然后將成品進(jìn)行冷藏保存。步驟一中的Lactobacillus casei JY68的菌株培養(yǎng)液包含有干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68 或包含有干釀乳桿菌 Lactobacillus caseiJY68、嗜熱鏈球菌 Streptococcus thermophilus 和保加利亞乳桿菌 Lactobacillus bulgaricus,步驟一種的雙歧桿菌的菌株培養(yǎng)液為短雙歧桿菌Bifidobacterium breve、長雙歧桿菌Bifidobacterium Iongum或者短雙歧桿菌Bifidobacterium breve和長雙歧桿菌Bifidobacterium Iongum的混合,脫脂奶粉含22-30% w/v的葡萄糖,步驟一種干酪乳桿菌Lactobacillus caseiJY68的菌株培養(yǎng)液接種到脫脂奶粉中培養(yǎng)的溫度在37°C，培養(yǎng)的時(shí)間為24-48小時(shí)，雙歧桿菌的菌株培養(yǎng)液接種到脫脂奶粉中培養(yǎng)的溫度在24°C，培養(yǎng)的時(shí)間為24-48小時(shí)。步驟三中培養(yǎng)的溫度為35-37°C，培養(yǎng)的時(shí)間為7天。步驟五中冷藏保存的溫度為2-7 °C。本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明的發(fā)酵乳制品中含有干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68和短雙歧桿菌,干釀乳桿菌LactobaciIIus casei JY68不但可以存活狀態(tài)到達(dá)小腸，這樣可以改善腸內(nèi)菌群和提高免疫力的功效，而且可以具有高耐酸性，強(qiáng)繁殖性，并且能夠降解牛奶中抗原性以及蛋白質(zhì)的抗原性，減少牛奶中容易引起過敏性抗原蛋白質(zhì)含量，另外熱量降低一半，保持爽口不膩的口感，滿足了糖尿病患者或渴望低熱量食品的消費(fèi)者的需求 ，在保質(zhì)期內(nèi)的活菌數(shù)能維持在108CFU/毫升以上，大大高于現(xiàn)在市場上的商品含量。為使益生菌在保質(zhì)期內(nèi)能保持活菌數(shù)在108CFU/毫升以上的高數(shù)量級并且能以存活狀態(tài)到達(dá)腸內(nèi)，本發(fā)明中采用三段式發(fā)酵技術(shù)，其中大型發(fā)酵時(shí)間也從168小時(shí)發(fā)酵。同時(shí)在生產(chǎn)線上設(shè)定多個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)，生產(chǎn)前后都對每個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行細(xì)致的人工洗凈和酸堿殺菌，使用高度的無菌操作技術(shù)進(jìn)而預(yù)防了二次污染的發(fā)生。該專利產(chǎn)品屬于低熱量商品，使用甘素等零熱量糖類代替部分白砂糖和葡萄糖。使對攝取砂糖有抵觸感的人群也能放心飲用。


圖1為本發(fā)明的利用MEGA3.1生物學(xué)軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹
具體實(shí)施例方式本發(fā)明為一種干酪乳桿菌,分類名稱為干酪乳桿菌Lactobacillus casei,參據(jù)的生物材料(株)JY68，該菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，其保藏編號為CGMCC No. 3567，保藏日期為2010年I月12日，結(jié)果是存活。干酪乳桿菌Lactobacillus caseiJY68的菌株發(fā)酵后的產(chǎn)品其抗原價(jià)能減低到發(fā)酵前的1/1000,它是通過以下實(shí)驗(yàn)制得的一、乳酸菌株蛋白酶活性和肽酶活性試驗(yàn)首先從日本購買4個(gè)菌株lactobacillus casei subsp.casei L—14,Streptococcus lactis subsp. cremoris H—61,Streptococcus lactis subsp. lactis 527 !Streptococcus thermophilus 510 ；又從Hansen 公司購買的 4 個(gè)菌株lactobacillus bulgaricus C2, lactobacillus helveticusCl, lactobacillus lactis Cl, Streptococcus thermophilus Cl;以及分離自新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳的 2 個(gè)菌株Lactobacillus casei JY68, Streptococcus diacetylactis Fl 菌株的蛋白酶活性和肽酶活性使用Forin法進(jìn)行了測定。以對Glu-pNA等8種合成基質(zhì)及酪蛋白的分解程度作為活性判斷指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus casei JY68和Streptococcusdiacetylactis Fl菌株有較大的蛋白酶活性和肽酶活性。二、降低0乳球蛋白抗原性試驗(yàn)接著將蛋白酶活性和肽酶活性較高的兩個(gè)菌株接種至10%的滅菌脫脂乳中，對培養(yǎng)液中P乳球蛋白的抗原性利用ELISA法進(jìn)行測試。酵液脫苦效果的感官評價(jià)試驗(yàn)。三、然后將具有P乳球蛋白抗原性低減效果的2個(gè)菌株Lactobacillus caseiJY68, Streptococcus diacetylactis Fl添加到10%脫脂乳蛋白酶水解液中，以0. 04%咖啡因的苦度為對照，對其脫苦效果進(jìn)行了感官評價(jià)試驗(yàn)。通過以上試驗(yàn)，優(yōu)選出不但具有較強(qiáng)的蛋白酶和肽酶活性，而且可以降低P乳球蛋白抗原性以及其發(fā)酵液不呈現(xiàn)苦味的干釀乳桿菌 Lactobacillus caseiJY68 菌株。干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的分離方法以新疆采取的傳統(tǒng)發(fā)酵乳分離樣品，取ImL上述樣品放入滅菌小試管中，接種于IOmL石蕊牛乳培養(yǎng)基中，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中增菌培養(yǎng)至酸化凝固并呈現(xiàn)粉紅色時(shí)取出，用滅菌接種環(huán)挑取劃線接種于含有IOppm放線菌酮和IOppm硫酸粘菌素的BL瓊脂培養(yǎng)基中，將其放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐中，置于37°C條件下培養(yǎng)48小時(shí)，形成菌落后，用接種環(huán)挑取菌落，接種于MRS培養(yǎng)液中，置于37°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，待菌株生長好后，再次劃線接種于BL瓊脂培養(yǎng)集中，37°C下厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，記錄觀察菌 落形態(tài)和革蘭氏染色細(xì)胞形態(tài)特征，并進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)，分離出在所述試驗(yàn)中呈陰性的桿菌，所述桿菌為乳桿菌。將所述乳桿菌進(jìn)一步純化培養(yǎng)，并進(jìn)行低溫保存。干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的鑒定方法一、生理生化鑒定參照伯爵氏細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，對被試菌體的形態(tài)以及生理生化特性進(jìn)行鑒定，采用梅里埃API 50CHL鑒定試劑盒對其生理生化特性進(jìn)行鑒定。二、16S rRNA 序列鑒定1、采用的試劑Taq酶、dNTP、DNAmarker、溶菌酶、蛋白酶K、CTAB, SDS(購自北京寶杰羅生物科技有限公司)GoldVieW(購自北京塞百盛基因技術(shù)有限公司)。2、PCR引物16S rRNA序列擴(kuò)增引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下L1:5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’L2 :5’ -CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’3、菌體培養(yǎng)將送檢樣品在平板上劃線分離，培養(yǎng)24_30h后挑取單菌落接種到20ml液體培養(yǎng)基中，30°C 200rpm培養(yǎng)20_24h。4、基因組DNA提取基因組DNA提取參照文獻(xiàn)。
用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀細(xì)胞碎片和多糖，再用異丙醇沉淀來提取總DNA(Wilson，1987)。(I)取單菌落接種于5ml相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)24h ； (2)取1. Oml菌液于1. 5ml離心管中，13, OOOrpm離心2min,棄上清；
(3)沉淀重懸于1. Oml 0. 85% NaCl中。(4)室溫13, OOOrpm離心2min,棄上清；(5)沉淀重懸于 550iillXTE 中；(6)加 17iil 溶菌酶(35mg/ml)，37°C 溫育 30min ； (7)加 3 yl 蛋白酶 K(20mg/ml)，37°C 溫育 30min ； (8)加 30 yl 10% SDS，37°C 溫育 30min ； (9)加 IOOu I5M NaCl充分混勻；(10)加80 ill CTAB/NaCl溶液，混勻，65°C水浴IOmin ； (11)加等體積(0. 7-0. 8ml)氯仿/異戊醇(24 I)，輕輕振蕩混勻；(12)室溫，13，OOOrpm離心IOmin ；
(13)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 :1)輕輕振蕩混勻；(14)重復(fù)第12)步；(15)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1. 5ml離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24 I)輕輕振蕩混勻；(16)重復(fù)第12)步；(17)將上清液轉(zhuǎn)移到一新1. 5ml離心管中，加入0. 6體積異丙醇，混勻后4°C靜置30min ； (18) 20°C 13，OOOrpm離心7min ；
(19)棄上清，加500 ill 70%乙醇，輕輕顛倒數(shù)次(洗鹽)；(20) 4 0C 15，OOOrpm離心7min ;
(21)重復(fù)洗鹽兩次；(22)倒置離心管，干燥DNA沉淀7min。DNA沉淀溶于lOOyl I X TE緩沖液，_20°C保存?zhèn)溆谩?、PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為100 ii1:Taq (5U/ U 1)0. 8u I ；10XPCR Buffer (Mg2+Plus) 10 U I ；dNTP Mixture (2. 5mM/each)8u I ；模板 DNA 2. 5ng ；引物 27F(10mol/L) 2 y 1，引物1541R(10umol/L)2u I ;ddH20 補(bǔ)足到 IOOu I0
PCR 反應(yīng)條件94°C for4min ;94°C for lmin, 58°C for lmin,72°C forlmin30sec,30cycles ；72°C for 5min ；4°C save, end。6、電泳檢測用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。顯色劑為GoldView。7、序列測定純化后的PCR產(chǎn)物采用ABI3730基因測序儀測序。測序工作由上海生工技術(shù)有限公司完成。8、序列分析與系統(tǒng)樹的構(gòu)建采用序列圖譜軟件Chromas ,參照正、反向序列圖譜,對序列人工校對。從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中下載戈登氏菌屬相關(guān)模式菌株的16S rRNA基因序列，與所測的RR和RY菌株序列一起，用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(alignment);然后利用MEGA3.1生物學(xué)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并進(jìn)行1000次重復(fù)的Bootstraps統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。三結(jié)果與分析1、生理生化鑒定結(jié)果經(jīng)生理生化試驗(yàn)初步鑒定，JY68細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色陽性，接觸酶陰性能在15°C和45°C條件下生長，能利用葡萄糖和果糖，初步鑒定為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)其生理生化特性見表I。表I生理生化特征
權(quán)利要求
1.一種干酪乳桿菌 Lactobacillus casei JY68，其保藏號為 CGMCCNo :3567。
2.一種發(fā)酵乳飲料制造方法，它包括以下步驟 步驟一,準(zhǔn)備干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養(yǎng)液和雙歧桿菌的菌株培養(yǎng)液進(jìn)行活化，將活化后的干酪乳桿菌Lactobacillus caseiJY68的菌株培養(yǎng)液和雙歧桿菌的菌株培養(yǎng)液分別接種到滅菌后的質(zhì)量濃度為10-20% w/v的脫脂奶粉中進(jìn)行培養(yǎng)； 步驟二，制備原料乳在質(zhì)量濃度為10-20% w/v的脫脂乳粉中添加質(zhì)量濃度為2-4%w/v葡萄糖進(jìn)行攪拌形成原料乳，然后對原料乳進(jìn)行殺菌冷卻； 步驟三,將干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養(yǎng)液添加到殺菌后的原料乳中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后的細(xì)菌、酵母和霉菌為零，大腸菌群為陰性； 步驟四，制備調(diào)配液將發(fā)酵后的原料乳和無菌水按照1:1的比例混合加入0. 2-0. 4% w/v的食品香料中，攪拌均勻制備成調(diào)配液； 步驟五，將步驟三中培養(yǎng)后的原料乳和步驟四中的調(diào)配液與干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養(yǎng)液進(jìn)行混合攪拌后制得發(fā)酵乳制品,然后將成品進(jìn)行冷藏保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵乳飲料制造方法,其特征是步驟一中的Lactobacilluscasei JY68的菌株培養(yǎng)液包含有干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68或包含有干酪乳桿菌 Lactobacillus casei JY68、嗜熱鏈球菌 Streptococcus thermophilus 和保加利亞乳桿菌Lactobacillus bulgaricus,步驟一種的雙歧桿菌的菌株培養(yǎng)液為短雙歧桿菌Bifidobacterium breve、長雙歧桿菌Bifidobacterium Iongum或者短雙歧桿菌Bifidobacterium breve和長雙歧桿菌Bifidobacterium Iongum的混合,脫脂奶粉含22-30% w/v的葡萄糖,步驟一種干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養(yǎng)液接種到脫脂奶粉中培養(yǎng)的溫度在37°C，培養(yǎng)的時(shí)間為24-48小時(shí)，雙歧桿菌的菌株培養(yǎng)液接種到脫脂奶粉中培養(yǎng)的溫度在24°C，培養(yǎng)的時(shí)間為24-48小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵乳飲料制造方法，其特征是步驟三中培養(yǎng)的溫度為35-37°C，培養(yǎng)的時(shí)間為7天。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵乳飲料制造方法，其特征是步驟五中冷藏保存的溫度為2-7。。。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種干酪乳桿菌Lc JY68，其保藏號為CGMCC No3567。本發(fā)明還公開一種發(fā)酵乳制品的制造方法，一，準(zhǔn)備干酪乳桿菌Lc JY68的菌株培養(yǎng)液和雙歧桿菌的菌株培養(yǎng)液進(jìn)行活化、培養(yǎng)；二，制備原料乳；三，將干酪乳桿菌Lc JY68的菌株培養(yǎng)液添加到殺菌后的原料乳中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后的細(xì)菌、酵母和霉菌為零，大腸菌群為陰性；四，制備調(diào)配液；五，將步驟三中培養(yǎng)后的原料乳和步驟四中的調(diào)配液與干酪乳桿菌Lc JY68的菌株培養(yǎng)液進(jìn)行混合攪拌后制得發(fā)酵乳制品，然后將成品進(jìn)行冷藏保存。
文檔編號A23C9/127GK103060219SQ201210124099
公開日2013年4月24日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者趙景陽 申請人:常州康樂優(yōu)生物技術(shù)有限公司