專利名稱：一種預(yù)防雞疾病的疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種禽疫苗，尤其是涉及ー種雞疾病的疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
長期以來，雞群由于群居，容易爆發(fā)疾病，特別是傳染性疾病，比如雞傳染性支氣管炎、肝炎病菌引起的疾病。雞群常見的傳染性疾病對養(yǎng)殖的影響非常大，如果不預(yù)防，將給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。所以傳染性疾病的預(yù)防性疫苗就凸現(xiàn)出了重要性。目前還 沒有特別有針對性的預(yù)防傳染性支氣管炎、肝炎病菌引起的疾病的疫苗。另外菌種的分離方法多種多樣，根據(jù)菌的不同來源和其本身的特點分離方法也各不相同，正確的分離培養(yǎng)有助于很快得到可疑的致病菌，對疫病的診斷是至關(guān)重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種預(yù)防傳染性支氣管炎、肝炎病菌引起的疾病的疫苗。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供ー種雞病原黃桿菌菌株，屬黃桿菌科，學(xué)名為雞黃桿菌 001 Flavobacterium sp. 001，保藏號為 CCTCC NO: M 2012100，于 2012 年 4 月 8 日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。為得到本發(fā)明所述的雞病原黃桿菌菌株，本發(fā)明還提供了一種分離方法，其步驟為
菌種的分離
取發(fā)生傳染性肝炎的病雞肝部組織ー小塊(約50mg)放于裝有300ul 1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎后，各取IOOul于分別含有氨芐，卡納和氯霉素的LB平板涂布，37°C培養(yǎng)24h ;結(jié)果只有在含有氨芐和卡納的平板上有菌落生長；
菌種擴(kuò)大培養(yǎng)
從上述長菌的平板中挑單菌落到抗生素的250ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)24-30小時，測0D600約為2. 0 ;其抗生素為同時含有氨芐和卡納；
菌種鑒定
取上述擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液測序，得出所測的菌種是黃桿菌；具體為取上述擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液30ul送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，測序引物為16s引物，其序列為27F AGAGTTTGATCCTGGCTCA (SEQ ID NO: 1)；1492R GGTTACCTTGTTACGACTT (SEQ ID N0:2);將測序所得序列在 NCBI (http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/BlastAlign. cgi)上比對，或者將所得序列翻譯為蛋白序列后在 NCBI (http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/BlastAlign. cgi)上比對，最后得出所測的菌種是黃桿菌；
菌種的保存
將上述擴(kuò)大培養(yǎng)所得菌液進(jìn)行20%甘油保菌法-80度保藏即可。即將滅菌后的甘油20ul中加80ul的菌液，充分混勻后即可。
本發(fā)明還提供了ー種雞病原黃桿菌菌株的疫苗，可以是滅活疫苗。本發(fā)明所述疫苗的制備方法是
接種將權(quán)利要求I所述雞病原黃桿菌菌株用滅菌生理鹽水稀釋后注射接種7日齡易感雛雞；取病雞肝部組織ー小塊放于裝有1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎，制成生產(chǎn)用菌種；
滅活病菌液將上述制成的生產(chǎn)用菌種中加入甲醛溶液，邊加邊充分搖勻，置搖床滅活，作為制苗用抗原液；
乳化制備疫苗油相注射用花生油占10%，水相淀粉占2%和87ml的PBS混合后滅菌，之后將滅菌的吐溫-80加到水相之中，占1%，將上述佐劑加上同樣體積的制苗用抗原液后進(jìn)行乳化，充分振搖使吐溫完全溶解；在乳化終止前加入防腐劑；防腐劑為I %硫柳汞，加入量占疫苗總體積的1%，最終濃度為萬分之一；
分裝將乳化得到的疫苗分裝于滅菌疫苗瓶內(nèi)，密封，4°C保存即可。制備方法還包括檢測是否完全滅活的步驟。在確保完全滅活病菌的同時盡量減少甲醛使用量，對病菌抗原液在不同甲醛滅活終濃度(0.1^.0.2^.0.3^^0 0.4%)及滅活時間(3h、6h、12h、24h和48h)進(jìn)行了多次交叉重復(fù)實驗。研究結(jié)果表明甲醛終濃度為
0.4%，滅活時間為48h，滅活效果最佳。檢測是否完全滅活的方法可為取滅活的菌液于同時含有氨芐和卡納的LB平板涂布，37°C培養(yǎng)72小時，平板上是否長菌；同時取滅活菌液于同時含有氨芐和卡納的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)72小時，液體培養(yǎng)基是否長菌；以上兩點均沒有長菌，則說明菌液已經(jīng)完全滅活。本發(fā)明還提供按照上述制備方法制備所得的疫苗。本發(fā)明的制備方法具有如下優(yōu)點方法簡單，效果良好，經(jīng)過多批次的動物實驗和田間試驗，結(jié)果表明疫苗對雞群無不良反應(yīng)，雞群在免疫后I個月測HI抗體水平，幾何平均滴度ND為9. 8 10. 51og2。雞群生長狀況良好，開產(chǎn)后產(chǎn)蛋性能良好，產(chǎn)蛋量與蛋殼質(zhì)量正常，在6個月觀察期內(nèi)，免疫組死淘率較同群未免疫對照組降低0. 6% 2. 5%。上述制備方法制備的滅活疫苗質(zhì)量確實、可靠，符合要求。本發(fā)明制備的疫苗可用于預(yù)防雞傳染性支氣管炎、肝炎病菌引起的疾病，達(dá)到預(yù)防疾病的效果。臨床實驗的結(jié)果表明本發(fā)明的疫苗對雞群無不良反應(yīng)，雞群在免疫后I個月測HI抗體水平，幾何平均滴度黃桿菌為9. 8 10. 51og2。雞群開產(chǎn)后產(chǎn)蛋性能良好，產(chǎn)蛋量與蛋殼質(zhì)量正常，在6個月觀察期內(nèi)，免疫組死淘率較同群未免疫四聯(lián)苗對照組降低0. 6% 2. 5%，平均每只雞多產(chǎn)蛋2 6枚。免疫后雞群可產(chǎn)生較高的抗體水平，維持期較長，對強(qiáng)菌攻擊具有較好的保護(hù)效果。本發(fā)明通過小試、實驗室工作、エ藝探索等具體工作，結(jié)合實驗室研究多批次試制產(chǎn)品和5個批次的エ業(yè)化流水生產(chǎn)線中試生產(chǎn)，經(jīng)過多批次的動物實驗和田間試驗，獲得了大量的實驗數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果的符合對比均證實，研制的“雞黃桿菌滅活疫苗”質(zhì)量確實、可靠，符合要求。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實施例I :菌種分離方法和標(biāo)準(zhǔn)
I、囷種制備
(1)菌種的分離
取發(fā)生傳染性肝炎的病雞(福建廈門翔安內(nèi)盾養(yǎng)雞場)肝部組織ー小塊(約50mg)放于裝有300ul 1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎后，各取IOOul于分別含有氨芐，卡納和氯霉素的LB平板涂布(氨芐0. 05mg/ml;卡納0. 04mg/ml)，37°C培養(yǎng)24h ;結(jié)果只有在含有氨芐和卡納的平板上有菌落生長；
(2)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)
從上述長菌的平板中挑單菌落到同時含有氨芐和卡納的250ml LB液體培養(yǎng)基中(氨芐:0. 05mg/ml;卡納0. 04mg/ml )，37°C搖床培養(yǎng) 24-30 小時，測 OD600 約為 2. 0;
(3)菌種鑒定
取上述擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液30ul送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，測序引物為16s引物，其序列為 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCA (SEQ ID NO: I) ；1492R :GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO: I);將測序所得序列在 NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi)上比對,或者將所得序列翻譯為蛋白序列后在NCBI (http://blast. ncbi. nlm. nih.gov/BlastAlign. cgi)上比對,最后得出所測的菌種是黃桿菌；
(4)菌種的保存和保藏
采用20%甘油保菌法，即將滅菌后的甘油20ul中加80ul的菌液，充分混勻后，-80度保藏(注意甘油要慢慢吸)。保存的菌種送到CCTCC，進(jìn)行保藏，保藏號為CCTCC NO M2012100，(2012年4月8日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC));
2、菌種標(biāo)準(zhǔn)(雞黃桿菌應(yīng)符合下列標(biāo)準(zhǔn))
2. I對雞肝內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)按《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2001年版)(以下簡稱“標(biāo)準(zhǔn)”)附錄316頁進(jìn)行，應(yīng)為0. I 0. 4;
2.2對雛雞最小致死量的平均死亡時間(MDT/MLD)按“標(biāo)準(zhǔn)”附錄316頁進(jìn)行，應(yīng)為103 119小時;
2.3紅細(xì)胞凝集價按“中華人民共和國獸藥典”(2005年版)(以下簡稱“中國獸藥典”)附錄28頁進(jìn)行，含菌雞胚液對紅細(xì)胞凝集價應(yīng)> 91og2 (微量法)；
2. 4安全性用2 7日齡雛雞20只，分成兩組，第I組10只，每只注射接種5倍稀釋的含菌液0. 05ml，第2組10只，不接種作為對照，兩組在同樣條件下分別飼養(yǎng)管理，觀察10天，應(yīng)無不正常反應(yīng)。如有非特異性死亡，免疫組與對照組均不應(yīng)超過I只；
2. 5免疫原性對I月齡雞注射接種，最小免疫量應(yīng)< 5000EID5Q;
2.6純凈應(yīng)無細(xì)菌、霉菌(按“中國獸藥典”附錄15頁)、支原體(按“中國獸藥典”附錄19頁)及外源病菌(按“中國獸藥典”附錄20頁)污染；
2. 7特異性；
2.8基礎(chǔ)種子代數(shù)E2 E5代；2.9菌種保存_20°C以下保存，凍干菌種保存期為72個月。實施例2 :制備生產(chǎn)用菌種
將實施例I所得雞黃桿菌菌種用滅菌生理鹽水稀釋后注射接種2 7日齡易感雛雞，取病雞肝部組織ー小塊(約50mg)放于裝有300ull% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎，制成生產(chǎn)用菌種。實施例3 :疫苗制造生產(chǎn)エ藝 1、甲醛滅活劑的使用濃度和滅活時間
在確保完全滅活病菌的同時盡量減少甲醛使用量，對病菌抗原液在不同甲醛滅活終濃度(0. 1%、0. 2%、0. 3%和0. 4% )及滅活時間(3h、6h、12h、24h和48h)進(jìn)行了多次交叉重復(fù)實驗。研究結(jié)果表明甲醛終濃度為0.4%，滅活時間為48h，滅活效果最佳；
2、滅活疫苗的生產(chǎn)エ藝
為完善生產(chǎn)エ藝，經(jīng)對不同生產(chǎn)過程進(jìn)行了多次重復(fù)比較后，建立了相應(yīng)的規(guī)范；
抗原制備采用黃桿菌菌株，接種2 7日齡易感雞胚生產(chǎn)病菌抗原液，收獲的病菌抗原液病菌含量彡108 0EID50/0. Iml ；
乳化制備疫苗油相注射用花生油占10%，水相淀粉占2%和87ml的PBS混合后滅菌，之后將滅菌的吐溫-80加到水相之中，占1%，將上述佐劑加上同樣體積的制苗用抗原液后進(jìn)行乳化，充分振搖使吐溫完全溶解；在乳化終止前加入防腐劑；乳化工藝油乳劑滅活疫苗穩(wěn)定性較好，粘度適中；
在多次重復(fù)エ藝性探索基礎(chǔ)之上，并結(jié)合實驗室研制和エ廠化生產(chǎn)，經(jīng)過一系列的檢測驗證，證實該エ藝技術(shù)穩(wěn)定，成熟度高，各項指標(biāo)均符合“生物制品規(guī)程”和“進(jìn)ロ獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”中單價疫苗標(biāo)準(zhǔn)。實施例4:成品檢驗
1、物理性狀 外觀為乳白色乳剤。劑型呈油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴外，應(yīng)呈油滴狀，不擴(kuò)散；
穩(wěn)定性取IOml疫苗于離心管中，經(jīng)3000r/m離心15min,應(yīng)不出現(xiàn)分層現(xiàn)象；37°C條件下放置21日，應(yīng)不破乳；
粘度用Iml吸管(下口內(nèi)徑為I. 2mm，上口內(nèi)徑為2. 7mm)，吸取25°C左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，記錄流出0. 4ml所需的時間，在8秒以內(nèi)判為合格；
2、無菌檢驗按“中國獸藥典”附錄15頁進(jìn)行，應(yīng)無菌生長；
3、安全檢驗取3 7周齡雛雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗0.4ml (2羽份)，觀察14日，應(yīng)不發(fā)生因注射疫苗而出現(xiàn)的任何局部及全身反應(yīng)；
4、效カ檢驗
采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢驗，結(jié)果不符合規(guī)定時，可采用免疫攻菌法進(jìn)行效力檢驗；血清學(xué)方法用3 7周齡雛雞15只，10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗2ml (10羽份)，另5只作對照。接種后21 28日，每只雞分別采血，分離血清，按“中國獸藥典”進(jìn)行HI抗體效價測定。免疫組HI抗體效價的幾何平均值應(yīng)> 41og2，未免疫對照組HI抗體效價的幾何平均值應(yīng)< 21og2 ；免疫攻菌法用3 7周齡雛雞15只，10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗2ml (10羽份)，另5只作對照。接種后21 28日，每只雞各肌肉注射雞黃桿菌1ml，觀察14日，對照組全部死亡，免疫組至少保護(hù)7只；
5、甲醛含量測定分別按“中國獸藥典”附錄24、25頁進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定；
6、作用與用途用于預(yù)防雞傳染性肝炎，免疫期為6個月；
7、用法與用量皮下或肌肉注射，用于七日齡雛雞接種，每只0.2ml;用于開產(chǎn)前 (110 140日齡)蛋雞及種雞的免疫接種，每只Iml ；
8、注意事項
8. I非健康雞切忌注射本品；
8. 2所要預(yù)防的禽病菌亞型一定要與本品標(biāo)示的亞型相一致，否則無效；
8. 3本品嚴(yán)禁凍結(jié)，應(yīng)保存在2 8°C恒溫條件下；
8. 4本品如出現(xiàn)破損、異物或破乳分層等異?，F(xiàn)象切勿使用；
8. 5注射前應(yīng)將疫苗恢復(fù)至室溫；
8、6建議在當(dāng)?shù)孬F醫(yī)正確指導(dǎo)下正確使用；
9、貯藏2 8°C保存，有效期為18個月；
10、規(guī)格IOOml/瓶，250ml/瓶，500ml/瓶。實施例5 :滅活疫苗的對比試驗
滅活疫苗采取注射免疫法與混飼免疫法兩種方式
1、注射免疫法是將滅活疫苗用注射器直接注入到雞的頸部皮下。注射接種方法用手輕輕地提起雞的頸部皮膚，從頸部中段以下身體方向刺入；
保存在4°C的滅活菌液使用前時與等量完全佐劑充分混勻；使用注射方法，10日齡德化黑雞0. 2mL/羽，德化黑雞成雞(3月齡)=ImL/羽。對照組使用生理鹽水與等量完全佐齊U。每組20只，注射免疫15天后進(jìn)行活菌感染實驗。將離心沉淀的處于對數(shù)生長期的黃桿菌均勻地混入飼料中，按照黃桿菌濕重50克對I公斤飼料的比例均勻混合，混勻的飼料在2小時內(nèi)喂完。所有用具及時收集消毒滅菌。以正常飼料喂養(yǎng)做對照。從注射日起共觀察45天。結(jié)果見表I和表2 ;
表I :10日齡雞存活率_
組另Il_0天15天20天30天45天
正常飼料喂養(yǎng)；未注射100% 95% 95% 95% 95%
正常飼料喂養(yǎng)；注射生理鹽水對照100% 100% 95% 95% 95%
正常飼料喂養(yǎng)；注射黃桿菌滅活疫苗100% 100% 100% 100% 100%
活菌飼料喂養(yǎng)；未注射100% 100% 65% 30% 25%
活菌飼料喂養(yǎng)；注射生理鹽水對照100% 100% 70% 40% 30%
活菌詞料喂養(yǎng)；注射黃桿菌滅活疫苗ll00%l[00%〔95% >5% 195%
表2 :成雞存活率(3月齡)
組另Il_0天15天20天30天45天
正常飼料喂養(yǎng)；未注射100% 100% 100% 100% 100%
正常飼料喂養(yǎng)；注射生理鹽水對照100% 100% 100% 100% 100%
正常飼料喂養(yǎng)；注射黃桿菌滅活疫苗100% 100% 100% 100% 100%
活菌飼料喂養(yǎng)；未注射100% 100% 75% 60% 45%
活菌飼料喂養(yǎng)；注射生理鹽水對照100% 100% 85% 70% 50%
活菌詞料喂養(yǎng)；注射黃桿菌滅活疫苗00% [100% 100% [100% 100%
2.混飼免疫法是通過消化道的ロ服免疫方法。每組20只雞，將離心沉淀的滅活黃桿菌均勻地混入飼料中，讓德化黑雞(10日齡雞和3月齡成雞)在吃食時同時將滅活疫苗吃進(jìn)去。按照滅活黃桿菌濕重50克對I公斤飼料的比例均勻混合，混勻的飼料在2小時內(nèi)喂完；在這之后15天進(jìn)行活菌感染實驗。將離心沉淀的處于對數(shù)生長期的黃桿菌均勻地混入飼料中，按照黃桿菌濕重50克對I公斤飼料的比例均勻混合，混勻的飼料在2小時內(nèi)喂完。所有用具及時收集消毒滅菌。以正常飼料喂養(yǎng)做對照。從飼喂日起共觀察45天，結(jié)果見表3和表4 ；
表:3 :10日齡雞存活率_
權(quán)利要求
1.ー種雞病原黃桿菌菌株，保藏號為CCTCC M 2012100。
2.—種制備權(quán)利要求I所述的雞病原黃桿菌菌株的方法，其特征在于， 菌種的分離取發(fā)生傳染性肝炎的病雞肝部組織ー小塊放于裝有1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎后，各取一定量于分別含有不同抗生素氨芐，卡納和氯霉素的LB平板涂布，37°C培養(yǎng)24h ;結(jié)果只有在含有氨芐和卡納的平板上有菌落生長； 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)從上述長菌的平板中挑單菌落到含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)24-30小時； 菌種鑒定取上述擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液測序，得出所測的菌種是黃桿菌； 所述菌種擴(kuò)大培養(yǎng)中所述的抗生素為同時含有氨芐和卡納，測序所用引物為16s引物，序列分別為AGAGITTGATCCTGGCTCA 和 GGTTACCTTGTTACGACTT。
3.ー種含有權(quán)利要求I所述雞病原黃桿菌菌株的疫苗。
4.權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗是滅活疫苗。
5.權(quán)利要求3所述的疫苗用于預(yù)防雞傳染性支氣管炎、肝炎病菌引起的疾病的用途。
6.ー種利用權(quán)利要求I所述的菌株制備權(quán)利要求4所述滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟接種將權(quán)利要求I所述雞病原黃桿菌菌株用滅菌生理鹽水稀釋后注射接種7日齡易感雛雞；取病雞肝部組織ー小塊放于裝有1% TritonX-IOO的EP管中，用研磨棒研碎，制成生產(chǎn)用菌種； 滅活病菌液將上述制成的生產(chǎn)用菌種中加入甲醛溶液，邊加邊充分搖勻，置搖床滅活，作為制苗用抗原液； 乳化制備疫苗油相注射用花生油占10%，水相淀粉占2%和87ml的PBS混合后滅菌，之后將滅菌的吐溫-80加到水相之中，將上述佐劑加上同樣體積的制苗用抗原液后進(jìn)行乳化，充分振搖使吐溫完全溶解；在乳化終止前加入防腐劑； 分裝將乳化得到的疫苗分裝于滅菌疫苗瓶內(nèi)，密封，4°C保存即可。
7.權(quán)利要求4的滅活疫苗的制備方法，其特征在于，還包括檢測是否完全滅活的步驟。
8.權(quán)利要求4的滅活疫苗的制備方法，其特征在于，滅活病菌液吋，甲醛的終濃度約為0.4%，37°C搖床滅活48小時。
9.權(quán)利要求4的滅活疫苗的制備方法，其特征在干，乳化制備疫苗吋，吐溫-80加入量占水相體積的1%，防腐劑為I %硫柳汞，加入量占疫苗總體積的1%，最終濃度為萬分之o
10.ー種按照權(quán)利要求6 — 9任一方法制備的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防雞疾病方法的疫苗及其制備方法。保藏號為CCTCCM2012100的雞病原黃桿菌菌株，和含有該菌的疫苗，該疫苗的制備方法為接種將雞病原黃桿菌菌株用滅菌生理鹽水稀釋后注射接種7日齡易感雛雞；取病雞肝部組織一小塊放于裝有1%TritonX-100的EP管中，用研磨棒研碎，制成生產(chǎn)用菌種；滅活后乳化分裝即可。本發(fā)明的疫苗可用于預(yù)防雞傳染性支氣管炎、肝炎病菌引起的疾病。制備的滅活疫苗質(zhì)量確實、可靠，符合要求，安全性高，對雞群的免疫效果好，抗體水平高，維持期較長，對強(qiáng)菌攻擊具有較好的保護(hù)效果，同時不影響雞產(chǎn)蛋。
文檔編號C12R1/20GK102643768SQ201210124689
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者楊慧, 翁勤, 胡彬, 陳建明, 陳敏 申請人:廈門安特奧生物工程有限公司