專利名稱：用于聚合酶鏈反應(yīng)的微流系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)的微流系統(tǒng)以及用于實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
在分子診斷學(xué)中經(jīng)常實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR),從而繁殖DNA鏈。在PCR中向DNA附加PCR主混合物，PCR主混合物包含為了實(shí)施PCR所需的物質(zhì)。DNA和PCR主混合物形成了 PCR溶液。PCR溶液多次先后置于三個(gè)特定的溫度水平上。按標(biāo)準(zhǔn)為此使用所謂的溫度循環(huán)器。由文獻(xiàn)中公開(kāi)了 PCR在微流系統(tǒng)中流動(dòng)的系統(tǒng)。WO 2001/007159 A2描述了微流裝置，其中各個(gè)容器按順序地置于不同的溫度水平上。Yao 等人(et al.),生物醫(yī)學(xué)微型裝置(Biomedical Microdevices)2005，7，253，在微流系統(tǒng)中使用較長(zhǎng)的微流通道。在一次性流過(guò)通道時(shí)DNA溶液多次引導(dǎo)通過(guò)不同的溫度區(qū)域。在此使用外部的泵。Chung 等人(et al. ) , in IEEE MEMS 2011，865，Cancun，墨西哥(MEXICO)，一月(January) 23_27，2011，在微流系統(tǒng)中使用帶有三個(gè)溫度區(qū)域的圓形通道。不使用泵，而是利用浮力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了按權(quán)利要求I所述的微流系統(tǒng)。按本發(fā)明提供三個(gè)微流處理室，其中每個(gè)微流處理室處于特定的對(duì)于PCR的各個(gè)步驟所需的溫度水平上。PCR溶液通過(guò)泵入具有相應(yīng)溫度水平的處理室中而置于該溫度水平上。PCR溶液包含DNA以及PCR主混合物，其中PCR主混合物包含對(duì)于實(shí)施PCR所需的物質(zhì)。借助于腔室上的薄膜實(shí)現(xiàn)了 PCR溶液在處理室之間的泵送，該薄膜相應(yīng)受控地移動(dòng)到腔室中并且改變腔室體積。本發(fā)明同樣實(shí)現(xiàn)了按權(quán)利要求10所述的相應(yīng)的方法。本發(fā)明的其它有利的實(shí)施方式由從屬權(quán)利要求中獲得。根據(jù)本發(fā)明，微流腔室處于恒定的溫度水平上。僅加熱或者說(shuō)冷卻液體。由此強(qiáng)烈減少了系統(tǒng)的熱量并且可以比在具有溫度循環(huán)器的系統(tǒng)中快得多地運(yùn)行PCR。在常規(guī)的設(shè)備中要用顯著的開(kāi)銷得以實(shí)現(xiàn)快速冷卻，例如通過(guò)用帕爾貼元件進(jìn)行冷卻。與之相比，例如在使用電阻加熱元件時(shí)明顯更簡(jiǎn)單并且更便宜地構(gòu)造本發(fā)明的用于熱觸發(fā)的設(shè)備。通過(guò)在處理室上使用薄膜用于泵送，不需要額外的泵，空間需求更少了并且液體不會(huì)蒸發(fā)。


圖I示出了按本發(fā)明實(shí)施方式的帶有外泵操作的微流系統(tǒng)的截取部分的透視圖；圖2示意性示出了圖I中帶有流體元件的基層處于多個(gè)操作狀態(tài)A到D中；
圖3示出了按本發(fā)明另一集成的實(shí)施方式的帶有內(nèi)部泵操作的微流系統(tǒng)的截取部分的相互拉開(kāi)的透視 圖4示意性示出了按本發(fā)明另一實(shí)施方式的帶有循環(huán)填充處理室功能的微流系統(tǒng)的處理室裝置；
圖5示意性示出了按本發(fā)明另一實(shí)施方式的帶有通過(guò)往復(fù)泵填充處理室功能的微流系統(tǒng)的處理室裝置；
圖6示出了在按本發(fā)明實(shí)施方式的微流系統(tǒng)中實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)的方法的流程圖。
具體實(shí)施例方式在圖I中透視地示出了按本發(fā)明實(shí)施方式的微流系統(tǒng)10。這里是聚合物基底的基底11在上面12包含流體結(jié)構(gòu)13，其具有入口通道14、出口通道15以及三個(gè)在流體方面相互串聯(lián)的腔室、也就是第一腔室16、第二腔室17和第三腔室18。第一腔室16通過(guò)較短的連接通道20與第二腔室17連接，并且第二腔室17通過(guò)較短的連接通道21與第三腔室18連接。所述入口通道14具有進(jìn)入閥22并且出口通道15具有排出閥23。所述進(jìn)入閥22和排出閥23在與串聯(lián)腔室16、17和18的串聯(lián)接合處24的端部上形成了可控制的封閉點(diǎn)。所述微流系統(tǒng)10在基底11上具有彈性的薄膜25，例如由熱塑性彈性體TPE制成。該薄膜25在上面12與基底11連接并且封閉流體結(jié)構(gòu)13的空腔。在腔室16、17和18上面的彈性薄膜25可以運(yùn)動(dòng)到相應(yīng)的腔室中從而排空腔室。在所述實(shí)施方式中在外部借助于各個(gè)用于每個(gè)薄膜段的沖頭控制薄膜段在腔室16、17和18上的位置或者說(shuō)將薄膜段移動(dòng)到腔室中。所述沖頭例如借助于壓縮空氣進(jìn)行驅(qū)動(dòng)，然而也可以進(jìn)行熱磁性和/或磁性的驅(qū)動(dòng)。同樣從外面操作所述閥門22和23。在沒(méi)有示出的替代實(shí)施方式中，所述閥門沒(méi)有集成到系統(tǒng)中，而是作為外部的組件。在運(yùn)行中所述腔室16、17和18處于用于PCR的不同的溫度水平上并且保持在該溫度水平上。在此，在外部從下面進(jìn)行溫度處理，然而也可以在內(nèi)部例如用加熱元件、電阻元件、微波并且/或者通過(guò)熱輻射實(shí)現(xiàn)溫度處理。為了腔室16、17和18相互間的熱隔離，在連接通道20和21邊上分別在兩側(cè)將鉆孔26置于基底11中。圖2說(shuō)明了實(shí)施方式中微流系統(tǒng)10的運(yùn)行，其中為了實(shí)施PCR將PCR溶液往復(fù)泵入三個(gè)在流體方面相互串聯(lián)的腔室16、17和18中。為此示出了圖I中公開(kāi)的帶有流體元件的基層11在多個(gè)操作狀態(tài)A到D中的情況。各個(gè)反應(yīng)室處于一個(gè)溫度區(qū)域內(nèi)并且從下面和/或上面通過(guò)各自的加熱元件例如電阻加熱元件或帕爾貼元件進(jìn)行加熱。相鄰的腔室通過(guò)連接通道20和21連接。外面的腔室16、18通過(guò)入口通道14和出口通道15接觸，PCR溶液能夠通過(guò)入口通道和出口通道沖入或者說(shuō)沖出。入口和出口通道可以通過(guò)閥門22和23關(guān)閉。為了使溫度區(qū)域相互間更好地?zé)岣綦x，鉆孔26處于所述腔室之間。通過(guò)將彈性薄膜25移動(dòng)到各個(gè)腔室中可以改變腔室16、17和18的體積。沒(méi)有將薄膜移動(dòng)到腔室中的狀態(tài)在下面稱作“腔室敞開(kāi)”。最大限度將薄膜移動(dòng)到腔室中的狀態(tài)在下面稱作“腔室關(guān)閉”。在這種狀態(tài)下液體、在PCR中也就是PCR溶液基本上從腔室體積中擠出來(lái)，其中可能會(huì)殘留剩余液體。微流系統(tǒng)10的工作原理如下、操作狀態(tài)A用于準(zhǔn)備PCR。閥門22和23以及腔室16、17、18是敞開(kāi)的。PCR溶液通過(guò)入口通道14沖入第一腔室16中。其它兩個(gè)腔室17和18基本上保持空的。溫度區(qū)域置于目標(biāo)溫度上，示范值為第一腔室95°C，第二腔室72°C，第三腔室55°C?，F(xiàn)在先后關(guān)閉進(jìn)入閥22、第二腔室17、第三腔室18和排出閥23。在該操作狀態(tài)B下，PCR溶液現(xiàn)在基本上位于第一腔室16中并且在較短時(shí)間之后具有在那里存在的溫度。串聯(lián)腔室16、17和18的串聯(lián)結(jié)合處24基本上是沒(méi)有氣泡的。PCR溶液在第一腔室16中保持所希望的停留時(shí)間，例如10s。進(jìn)行DNA鏈的變性?，F(xiàn)在打開(kāi)第二腔室17、關(guān)閉第一腔室16并且實(shí)現(xiàn)操作狀態(tài)C。在該狀態(tài)中PCR溶液現(xiàn)在基本上處于第二腔室17中。隨后打開(kāi)第三腔室18并且關(guān)閉第二腔室17并且實(shí)現(xiàn)操作狀態(tài)D。通過(guò)該順序?qū)CR溶液擠入第三腔室18中并且在較短的時(shí)間之后具有在那里存在的溫度。例如體積大約 為1-10 ill的PCR溶液在大約IOOms內(nèi)具有腔室中的溫度。PCR溶液在第三腔室18中保持所希望的停留時(shí)間，例如10s，并且DNA鏈與引物雜交。隨后打開(kāi)第二腔室17并且關(guān)閉第三腔室18。由此將PCR溶液擠入第二腔室17中并且再實(shí)現(xiàn)操作狀態(tài)C。PCR溶液在較短的時(shí)間之后具有在那里存在的溫度。PCR溶液在第二腔室17中保持所希望的停留時(shí)間例如IOs并且進(jìn)行延長(zhǎng)。最后打開(kāi)第一腔室16并且關(guān)閉第二腔室17。由此將PCR溶液擠入第一腔室16中并且再實(shí)現(xiàn)操作狀態(tài)B。由此描繪了整個(gè)PCR循環(huán)?，F(xiàn)在根據(jù)所希望的PCR循環(huán)次數(shù)重復(fù)該P(yáng)CR循環(huán)，例如30次。在實(shí)現(xiàn)所希望的PCR循環(huán)次數(shù)之后打開(kāi)閥門22和23以及腔室16、17、18并且沖出PCR溶液。溫度區(qū)域也可以以其它順序進(jìn)行布置。在這種情況下相應(yīng)地改變觸發(fā)順序。然而上面所描述的布置具有溫度梯度最小化的優(yōu)點(diǎn)。圖3示出了按本發(fā)明另一集成的實(shí)施方式的微流系統(tǒng)30的截取部分的相互拉開(kāi)的透視圖，其中集成了泵操作。為了示出層結(jié)構(gòu)，相互拉開(kāi)地示出了各個(gè)層。微流系統(tǒng)30包含圖I中公開(kāi)的帶有相同附圖標(biāo)記的元件。所述元件是基底11連同其元件和彈性薄膜25。在薄膜25上布置了另一個(gè)帶有氣動(dòng)結(jié)構(gòu)32的基層31以及覆蓋層33。在該實(shí)施方式中不再?gòu)耐獠繉?shí)現(xiàn)閥門的操作以及薄膜在腔室上的移動(dòng)，而是在內(nèi)部借助于氣動(dòng)結(jié)構(gòu)32的元件實(shí)現(xiàn)。其它基層31包含氣動(dòng)結(jié)構(gòu)32朝基底11中的流體結(jié)構(gòu)13沖壓以及定向，其中基底11中可操作的元件具有其它基層31中相應(yīng)的元件?；?1中可操作的元件與相應(yīng)的元件上下布置，中間具有彈性薄膜25。如此，所述閥門22、23相應(yīng)于氣動(dòng)的閥門腔室34、35并且腔室16、17、18相應(yīng)于氣動(dòng)的腔室36、37、38。氣動(dòng)地加載所述腔室36、37、38分別使得彈性薄膜25移動(dòng)到基底11中可操作的元件上并且由此操作所述元件。每個(gè)氣動(dòng)的閥門腔室34、35都與配屬的氣動(dòng)通道40、41連接并且每個(gè)氣動(dòng)的腔室36、37、38都與配屬的氣動(dòng)通道42、43、44連接。經(jīng)由所述通道氣動(dòng)地操作所述氣動(dòng)的閥門腔室34、35以及氣動(dòng)的腔室36、37、38。其它基層31還包括鉆孔45，所述鉆孔對(duì)置于鉆孔26并且通過(guò)薄膜25與之隔開(kāi)。
所述覆蓋層33氣動(dòng)地密封氣動(dòng)結(jié)構(gòu)32并且在機(jī)械方面保護(hù)微流系統(tǒng)30。代替氣動(dòng)結(jié)構(gòu)的氣動(dòng)運(yùn)行，也可以用相同的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)液壓運(yùn)行。圖4示意性示出了按本發(fā)明另一實(shí)施方式帶有通過(guò)往復(fù)泵填充處理室功能的微流系統(tǒng)的處理室裝置50。該處理室裝置50相應(yīng)于圖I中腔室的布置以及腔室的在圖2中描述的運(yùn)行。所述腔室51、52、53在流體方面串聯(lián)，其中入口通道54具有進(jìn)入閥55并且出口通道56具有排出閥57。所述腔室51、52、53在各個(gè)所屬的溫度水平上。PCR溶液在PCR之前以及之后在閥門55、57打開(kāi)時(shí)經(jīng)由通道54、56導(dǎo)入或者說(shuō)導(dǎo)出。PCR溶液在PCR期間為了 PCR循環(huán)在所述腔室51、52、53之間往復(fù)泵送。PCR溶液的流動(dòng)方向通過(guò)箭頭表示。圖5示意性地示出了按本發(fā)明另一實(shí)施方式的帶有循環(huán)填充處理室功能的微流系統(tǒng)的處理室裝置60。腔室61、62、63在流體方面串聯(lián)，其中入口通道64具有進(jìn)入閥65并且出口通道66具有排出閥67。該處理室裝置60額外地具有連接通道68，該連接通道直接將外面的腔室61、63相互連接。所述腔室61、62、63在相應(yīng)所屬的溫度水平上。PCR溶液在PCR之前和之后在閥門65、67打開(kāi)時(shí)經(jīng)由通道64、66導(dǎo)入或者說(shuō)導(dǎo)出。PCR溶液在PCR期 間為了 PCR循環(huán)在所述腔室61、62、63之間循環(huán)地泵送。PCR溶液的流動(dòng)方向通過(guò)箭頭表示。在為腔室分配溫度水平時(shí)要注意PCR溶液流過(guò)腔室的順序。圖6示出了在按本發(fā)明實(shí)施方式的微流系統(tǒng)中實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)的方法的流程圖70。該微流系統(tǒng)具有在流體方面相互串聯(lián)的第一、第二以及第三腔室，例如腔室51、52、53或腔室61、62、63。所述方法以方法步驟a)開(kāi)始，即在各個(gè)預(yù)先給出的溫度上溫度處理所述腔室。在方法步驟b)中規(guī)定PCR循環(huán)的次數(shù)。方法步驟c)到h)實(shí)現(xiàn)了所述次數(shù)的PCR循環(huán)。在各個(gè)PCR循環(huán)中一開(kāi)始在方法步驟c)中將PCR溶液泵入第一腔室中。在那里根據(jù)方法步驟d)將PCR溶液保持第一時(shí)間間隔。隨后在方法步驟e)中將PCR溶液泵入第二腔室中。在那里根據(jù)方法步驟f)將PCR溶液保持第二時(shí)間間隔?，F(xiàn)在在方法步驟g)中將PCR溶液泵入第三腔室中。在那里根據(jù)方法步驟h)將PCR溶液保持第三時(shí)間間隔?，F(xiàn)在完成了單個(gè)PCR循環(huán)。在方法步驟i)中將所實(shí)施的PCR循環(huán)的次數(shù)與預(yù)先給出的循環(huán)的次數(shù)進(jìn)行比較，并且如果還沒(méi)有達(dá)到規(guī)定的次數(shù)就返回到C)。否則就結(jié)束PCR并且在方法步驟j)中泵出PCR溶液。方法步驟a)、b)以及方法步驟c)的第一次實(shí)施可以以任意順序進(jìn)行。借助于輸出腔室上的薄膜受控地移入輸出腔室中實(shí)現(xiàn)了從輸出腔室到目標(biāo)腔室的泵送。在此，通過(guò)關(guān)閉所填充的敞開(kāi)的腔室從中擠出PCR溶液并且PCR溶液逃入相鄰的空的敞開(kāi)腔室，如參照?qǐng)DI中的微流系統(tǒng)10結(jié)合圖2所描述的，其中描述了所述方法的其它細(xì)節(jié)。由于關(guān)閉的閥門22、23以及不參與當(dāng)前泵送過(guò)程的關(guān)閉的腔室，PCR溶液不會(huì)不同于進(jìn)入空的敞開(kāi)腔室漏出。
權(quán)利要求
1.用于聚合酶鏈反應(yīng)的微流系統(tǒng)(10、30)，其具有基底(11)并且在基底(11)上具有彈性薄膜(25)，該基底具有三個(gè)在流體方面相互串聯(lián)的用于不同溫度水平的腔室(16、17、18)，所述薄膜封閉腔室(16、17、18)，其中相互串聯(lián)的腔室(16、17、18)能夠在串聯(lián)結(jié)合處(24)的端部上在流體方面封閉，其特征在于，腔室(16、17、18)上的薄膜(25)能夠分別運(yùn)動(dòng)到腔室(16、17、18)中以用于排空腔室(16、17、18)。
2.按權(quán)利要求I所述的微流系統(tǒng)，其特征在于，所述微流系統(tǒng)(30)具有驅(qū)動(dòng)裝置用于使每個(gè)腔室(16、17、18)上的薄膜(25)運(yùn)動(dòng)。
3.按權(quán)利要求2所述的微流系統(tǒng)，其特征在于，微流系統(tǒng)(30)在每個(gè)腔室(16、17、18)上具有鄰靠薄膜(25)的泵室(36、37、38)。
4.按權(quán)利要求3所述的微流系統(tǒng)，其特征在于，氣動(dòng)地加載所述泵室(36、37、38)。
5.按權(quán)利要求3所述的微流系統(tǒng)，其特征在于，液壓地加載所述泵室(36、37、38)。
6.按權(quán)利要求2所述的微流系統(tǒng)，其特征在于，所述微流系統(tǒng)(10)被設(shè)計(jì)用于與外部的驅(qū)動(dòng)裝置共同作用以使每個(gè)腔室(16、17、18)上的薄膜(25)運(yùn)動(dòng)。
7.按權(quán)利要求6所述的微流系統(tǒng)，其特征在于，所述外部的驅(qū)動(dòng)裝置具有推進(jìn)器。
8.按權(quán)利要求I到7中任一項(xiàng)所述的微流系統(tǒng)，其特征在于，所述微流系統(tǒng)(10、30)在串聯(lián)結(jié)合處(24)的端部上具有閥門(22、23)。
9.按權(quán)利要求I到8中任一項(xiàng)所述的微流系統(tǒng)，其特征在于，所述微流系統(tǒng)在外部的腔室(61、63)之間具有直接的連接通道(68)。
10.在微流系統(tǒng)中實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)的方法，該微流系統(tǒng)具有在流體方面相互串聯(lián)的第一、第二以及第三腔室(16、17、18)，所述方法具有以下方法步驟 a)將所述腔室調(diào)溫到各個(gè)預(yù)先給定的溫度上； b)預(yù)先給定PCR循環(huán)次數(shù)； 為PCR循環(huán)次數(shù) c)將PCR溶液泵入第一腔室(16)中； d)將PCR溶液在第一腔室(16)中保持第一時(shí)間間隔； e)將PCR溶液泵入第二腔室(17)中； f)將PCR溶液在第二腔室(17)中保持第二時(shí)間間隔； g)將PCR溶液泵入第三腔室(18)； h)將PCR溶液在第三腔室(18)中保持第三時(shí)間間隔； 其中方法步驟a)、b)以及方法步驟c)的第一次實(shí)施能夠以任意順序進(jìn)行，其中借助于輸出腔室上的薄膜(25)受控地移入輸出腔室中實(shí)現(xiàn)從輸出腔室到目標(biāo)腔室的泵送。
11.按權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，用于移動(dòng)薄膜(25)的驅(qū)動(dòng)裝置在微流系統(tǒng)(10)中。
12.按權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，每個(gè)腔室(16、17、18)上的驅(qū)動(dòng)裝置具有鄰靠薄膜(25)的泵腔(36、37、38)。
13.按權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，氣動(dòng)地加載泵腔(36、37、38)。
14.按權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，液壓地加載泵腔(36、37、38)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于聚合酶鏈反應(yīng)的微流系統(tǒng)和方法。微流系統(tǒng)具有基底并且在基底上具有彈性薄膜，該基底具有三個(gè)在流體方面相互串聯(lián)的用于不同溫度水平的腔室，薄膜封閉腔室，其中相互串聯(lián)的腔室可以在串聯(lián)結(jié)合處的端部上在流體方面封閉，其中腔室上的薄膜能夠分別運(yùn)動(dòng)到腔室中從而排空腔室。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102757887SQ20121012552
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者C.多勒, J.施泰格特, J.魯普, M.道布 申請(qǐng)人:羅伯特·博世有限公司