專利名稱：一株通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株內(nèi)生真菌。
背景技術(shù)：
甘草為豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza Linn)屬烏拉爾甘草(G. uralensis Fisch)，脹果甘草(G. inflate Bat)和光果甘草(G. glabra L)的干燥根和根莖，廣泛分布于我國(guó)東北、西北及華北等地。甘草性味甘平，為補(bǔ)氣類中藥，具有補(bǔ)中 益氣、清熱解毒、潤(rùn)肺止咳、緩急止痛、調(diào)和藥性等功效。中醫(yī)處方離不開(kāi)甘草，自古至今，廣為藥用，兼有“國(guó)老”的尊號(hào)。近年來(lái)，野生甘草因過(guò)度采挖強(qiáng)度而瀕臨滅絕，甘草已被列入《野生藥材資源保護(hù)條例》的國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。甘草的主要成分為甘草次酸，具有防癌、抑癌的作用，是醫(yī)藥、化妝品、食品的生產(chǎn)原料。甘草次酸的來(lái)源主要有兩個(gè)途徑一是化學(xué)合成，二是從甘草中提取。上述兩種途徑均需要利用甘草資源，因此如何高效利用甘草資源是人們的研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌。本發(fā)明通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌，它為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum) RElI,已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC No M2012047,保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日；它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，菌落直徑為6 8cm，菌落為綠色，基質(zhì)為黃色，菌絲較密集，菌落邊緣整齊，緊貼培養(yǎng)基，產(chǎn)分生孢子，分生孢子頭呈圓柱狀，分生孢子單生，單細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌，它為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum) RE 11,其ITS序列提交至NCBI網(wǎng)頁(yè)，通過(guò)Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過(guò)MEGA5. 03軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，REll菌株的ITS序列與青霉屬菌(Penicillium chrysogenum,編號(hào)GQ161752. I)菌株的相似性都達(dá)到了 99%以上，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，確定內(nèi)生真菌REll為產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)。本發(fā)明通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌，它為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum) RElI,已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC No M2012047,保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本發(fā)明利用微生物制藥手段提取分離甘草健康植株的內(nèi)生真菌RE11，以其發(fā)酵甘草，以HPLC法為分析手段測(cè)定經(jīng)甘草內(nèi)生真菌REll發(fā)酵甘草后甘草次酸的含量，結(jié)果甘草發(fā)酵后甘草次酸含量顯著高于生藥。將獲得的內(nèi)生真菌REll菌株通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和ISSrDNA序列分析鑒定其種屬。本發(fā)明通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌，它為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)RE11，能夠以甘草為底物對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵可使甘草中的甘草次酸含量顯著升高；甘草次酸是經(jīng)典的抗炎藥物目前在醫(yī)藥化妝品等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，還具有防癌和抗癌作用；本發(fā)明對(duì)采用甘草內(nèi)生真菌REll發(fā)酵甘草生產(chǎn)甘草次酸具有指導(dǎo)意義。


圖I為具體實(shí)施方式
一中產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)REll的孢子顯微結(jié)構(gòu)圖；圖2為具體實(shí)施方式
一中產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) RElI的PCR擴(kuò)增的電泳圖，其中M泳道表示Marker, I泳道表示REll ;圖3為具體實(shí)施方式
一中產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) REll的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖； 圖4為具體實(shí)施方式
一中甘草次酸對(duì)照品的HPLC色譜圖，其中I表示甘草次酸；圖5為具體實(shí)施方式
一中甘草的HPLC色譜圖，其中I表示甘草次酸；圖6為具體實(shí)施方式
一中甘草加入對(duì)照品后甘草次酸的HPLC色譜圖，其中I表示加對(duì)照品后甘早次Ife ；圖7為具體實(shí)施方式
一中REll發(fā)酵甘草后甘草次酸的HPLC色譜圖，其中I表示甘草次酸。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌，它為產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)REll，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC No M 2012047，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本實(shí)施方式中產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) RE 11,它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，菌落直徑為6 8cm，菌落為綠色，基質(zhì)為黃色，菌絲較密集，菌落邊緣整齊，緊貼培養(yǎng)基，產(chǎn)分生孢子，分生孢子頭呈圓柱狀，分生孢子單生，單細(xì)胞。本實(shí)施方式中產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,其生長(zhǎng)溫度為28°C,生長(zhǎng)pH值自然。本實(shí)施方式中通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌，它為產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) RE 11,該菌株分離自健康的野生甘草的根莖，采自大慶地區(qū)，植株年齡3年，植株健壯，無(wú)病蟲(chóng)害，其樣本現(xiàn)存于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥專業(yè)實(shí)驗(yàn)室；它按以下步驟進(jìn)行分離培養(yǎng)選取健康的野生甘草的根莖用自來(lái)水沖洗干凈后以無(wú)菌濾紙吸干水分，切成Icm小段于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)將甘草的根莖按下述方法進(jìn)行表面消毒75%酒精浸泡lmin-2%次氯酸鈉浸泡15min-無(wú)菌水沖洗3次；用無(wú)菌手術(shù)刀將野生甘草的根莖從中間切開(kāi)，分別置于5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基和5%甘草提取液馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基中，于28°C恒溫水浴搖床和恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 5d，待實(shí)驗(yàn)材料周圍長(zhǎng)出菌體，挑取菌體轉(zhuǎn)入平板(5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基)多次劃線分離純化，將純化后的菌株置于斜面固體培養(yǎng)基中，4°C保存?zhèn)溆?；其?%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖、20g的瓊脂和余量的5%甘草提取液組成，pH值為7. O 7. 2，121°C下高壓滅菌30min ；5%甘草提取液馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖和余量的5%甘草提取液組成，pH值為7. O 7. 2，121 °C下高壓滅菌30min ；斜面固體培養(yǎng)基為取5mL5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。結(jié)果從野生甘草的根莖中分離出內(nèi)生真菌RE11，并且陰性對(duì)照中對(duì)照平板和對(duì)照液體培養(yǎng)基內(nèi)均無(wú)任何菌長(zhǎng)出，多次重復(fù)均如此，證明所分到的菌是植物內(nèi)生真菌，而不是表面的附生菌。篩選出的內(nèi)生真菌RElI根據(jù)《真菌分類學(xué)》、《真菌鑒定手冊(cè)》和《半知菌屬圖解》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，其菌落特征和孢 子形態(tài)與青霉屬菌特征極為相近，孢子顯微結(jié)構(gòu)如圖I所示；分子鑒定內(nèi)生真菌REll發(fā)酵液抽濾得菌絲體用25%乙醇漂洗2次，滅菌的去離子水沖洗2次，離心去上清液，提取總DNA后進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增，將含有目標(biāo)條帶的PCR產(chǎn)物全部進(jìn)行再一次的點(diǎn)樣，用2 %的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下用解剖刀將目的條帶切下，用DNA膠回收試劑盒回收，制備感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接后，連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證；挑取單菌落進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)，證明目的片段已成功轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞中后，將克隆陽(yáng)性菌株送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序；所測(cè)定的核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中應(yīng)用BLAST分析進(jìn)行同源性比較，并根據(jù)分子生物學(xué)研究的基本原理選擇相應(yīng)種屬代表菌株的18S rDNA 序列應(yīng)用軟件 CLUSTALX I. 83 和 MEGA5. 03 以近鄰結(jié)合法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap檢驗(yàn)值> 50% (1000重復(fù))，確定目標(biāo)菌株的分類地位；內(nèi)生真菌REll基因組經(jīng)尿素法提取后，采用PCR擴(kuò)增后凝膠成像結(jié)果如圖2所示，在500bp附近得到一擴(kuò)增片段(堿基序列見(jiàn)SEQ ID N0:1))，證明已成功從內(nèi)生真菌REll菌株中提取出其基因組DNA ；根據(jù)內(nèi)生真菌REll的ITS序列提交至NCBI網(wǎng)頁(yè)，通過(guò)Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過(guò)MEGA5. 03軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖3)，REll菌株的ITS序列與青霉屬菌(Penicillium chrysogenum,編號(hào)GQ161752. I)菌株的相似性都達(dá)到了99%以上，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，確定篩選出的內(nèi)生真菌REll為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。本實(shí)施方式中產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,其發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示，甘草內(nèi)生真菌REll發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，REll能夠通過(guò)發(fā)酵甘草使其中的甘草次酸含量顯著升高。表I
組別KEll發(fā)酵的甘草樣甘草生藥空白對(duì)照 PUA對(duì)照
品
甘草次酸含量 O. 516±0.0025 Λ 0.128 土 0.223 土 - (mg/g)Δ0.00110.0008注同生藥組相比*Ρ< 0.05，#Ρ <0.01 ;同陰性對(duì)照組相比Λ P < O. 05，ΛΛ P
<0.01 ；PDA對(duì)照無(wú)甘草次酸產(chǎn)生。
本實(shí)施方式中產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,其發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的檢測(cè)如下取干燥甘草根，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩。精確稱取6g甘草粉，放入IOOmL三角瓶中，向其中加入30mL的蒸餾水，密封后，121°C高壓滅菌30min。取出，作為底物。向已活化的REll菌株試管中加入無(wú)菌水，制成I X 106CFU/mL的菌懸液，將此菌懸液5mL加入到底物中，另取甘草粉加等量的無(wú)菌水作為空白對(duì)照，將制備好的樣品于28°C，120r/min搖床培養(yǎng)14天。取出，凍干，即為甘草發(fā)酵樣品，備用。每個(gè)樣品做6個(gè)重復(fù)。精密稱取甘草發(fā)酵樣品lg，準(zhǔn)確加入IOmL的色譜甲醇，稱重，超聲提取2h，取出， 放冷，以色譜甲醇補(bǔ)足重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液4mL，于IOmL容量瓶中定容，待測(cè)。同時(shí)精密稱取甘草生藥Ig加入IOmL的色譜甲醇，稱重，超聲提取2h，取出，放冷，以色譜甲醇補(bǔ)足重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液4mL，于IOmL容量瓶中定容，作為生藥對(duì)照待測(cè)。甘草發(fā)酵前后甘草次酸含量的測(cè)定色譜條件色譜柱VenusiLXBP-C18 柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m)；流動(dòng)相甲醇-水-冰醋酸(82 17 I)；流速ImL· mirf1 ；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫25°C；進(jìn)樣量10μ L在色譜條件下，甘草內(nèi)生真菌REll發(fā)酵甘草所制備的供試品與甘草次酸對(duì)照品相應(yīng)位置的色譜峰一致，而且色譜峰經(jīng)過(guò)對(duì)照品加入法得到了較好的確認(rèn)，結(jié)果見(jiàn)圖4、5、6和7,結(jié)論內(nèi)生真菌REll為產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) RE 11,其以甘草為底物進(jìn)行發(fā)酵能夠使甘草中甘草次酸含量顯著升高，本實(shí)施方式對(duì)采用甘草內(nèi)生真菌REll生產(chǎn)甘草次酸具有指導(dǎo)意義。
權(quán)利要求
1. 一株通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌，其特征在于它為產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCCNo M 2012047，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。
全文摘要
一株通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌，它涉及一株內(nèi)生真菌。通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌，它為產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)RE11，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NoM 2012047，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本發(fā)明中通過(guò)發(fā)酵甘草提高甘草次酸含量的內(nèi)生真菌，能夠以甘草為底物對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵可使甘草中的甘草次酸含量顯著升高；甘草次酸是經(jīng)典的抗炎藥物目前在醫(yī)藥化妝品等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，還具有防癌和抗癌作用；本發(fā)明對(duì)采用甘草內(nèi)生真菌RE11發(fā)酵甘草生產(chǎn)甘草次酸具有指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102643755SQ20121012626
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者孔德崴, 孫雅北, 白長(zhǎng)勝, 譚佳音, 鄭春英 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)