專利名稱：一種新型耐高溫脂肪酶基因及其編碼產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種新型脂肪酶基因及其編碼產(chǎn)物，尤其是一種來自紅樹林土壤微生物的新型脂肪酶 基因及其編碼產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
脂肪酶是廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中的ー種酶，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯鍵水解，釋放含更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸。除此之外，還有多種酶活性，如催化多種酯的水解、合成及外消旋混合物的拆分。月旨肪酶反應(yīng)條件溫和，具有優(yōu)良的立體選擇性，并且不會(huì)造成環(huán)境污染，因此，在食品、皮革、醫(yī)藥、飼料和洗滌劑等許多エ業(yè)領(lǐng)域中均有廣泛的應(yīng)用。自然界中存在的微生物99%是不能培養(yǎng)的，因此從用傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)分離到的微生物中篩選新的生物催化劑的方法是非常有局限性的。利用免培技術(shù)，直接從環(huán)境微生物中提取基因組DNA，將其克隆到不同的細(xì)菌載體中，構(gòu)建“metagenome文庫”，再從中進(jìn)行篩選，是如景廣_的篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種能夠編碼高催化效率、聞穩(wěn)定性和聞抗逆性的脂肪酶的基因。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為ー種新型耐高溫脂肪酶基因，所述脂肪酶基因命名為lip34，所述脂肪酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。上述所述的耐高溫脂肪酶基因通過以下方法制備所得從紅樹林土壤宏基因組文庫中隨機(jī)挑選4個(gè)陽性克隆子，測序，然后運(yùn)用軟件對(duì)所得序列進(jìn)行分析，即可獲得所述耐高溫脂肪酶基因。所述脂肪酶基因lip34通過隨機(jī)篩選的方法從紅樹林宏基因組文庫中獲得，I Ρ34為ー個(gè)825bp大小的完整脂肪酶基因，利用BLAST在線比對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行同源性捜索分析表明，所述耐高溫脂肪酶基因lip34與已知基因不存在相似性。本發(fā)明的另ー個(gè)目的在于提供ー種含有如上所述新型耐高溫脂肪酶基因的重組質(zhì)粒pET32a-lip34，根據(jù)脂肪酶基因lip34的序列設(shè)計(jì)引物，以提取的質(zhì)粒pUC18-lip34為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳并回收產(chǎn)物1，凝膠回收產(chǎn)物I經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI與XhoI雙酶切并回收產(chǎn)物2，質(zhì)粒pET32a經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切后與回收產(chǎn)物2連接，獲得連接產(chǎn)物，即重組質(zhì)粒pET32a-lip34。另外，本發(fā)明還提供ー種含有上述所述新型耐高溫脂肪酶基因的表達(dá)載體，采用如下方法構(gòu)建所得采用電轉(zhuǎn)法，將上述所得的重組質(zhì)粒PET32a-lip34轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，將細(xì)菌懸浮液恢復(fù)培養(yǎng)并稀釋涂布于氨芐青霉素抗性培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，即得新型耐高溫脂肪酶基因的表達(dá)載體大腸埃希氏菌BL21-pET32a-lip34。所述大腸埃希氏菌BL21-pET32a_lip34現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli,保藏日期為2012年01月16日，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 5736。本發(fā)明的再ー個(gè)目的是提供ー種耐高溫重組脂肪酶的制備方法，包括以下步驟(I)重組質(zhì)粒pET32a-lip34的構(gòu)建根據(jù)脂肪酶基因lip34的序列設(shè)計(jì)引物，以提取的質(zhì)粒pUC18-lip34為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳并回收產(chǎn)物1，凝膠回收產(chǎn)物I經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI與XhoI雙酶切并回收產(chǎn)物2，質(zhì)粒pET32a經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切后與回收產(chǎn)物2連接，獲得連接產(chǎn)物，即重組質(zhì)粒pET32a-lip34 ；(2)脂肪酶基因lip34表達(dá)載體的構(gòu)建采用電轉(zhuǎn)法，將重組質(zhì)粒pET32a_lip34轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，將細(xì)菌懸浮液恢復(fù)培養(yǎng)并稀釋涂布于氨芐青霉素抗性培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子；(3)目的蛋白Lip34的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于含氨芐青霉 素抗性的平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按體積比I : 100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基，于37°C、200rpm培養(yǎng)至0D_ = O. 6 O. 8 ;加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)后經(jīng)鎳柱親和層析純化，即得重組脂肪酶 Lip34。作為本發(fā)明ー種耐高溫重組脂肪酶的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(3)中的LB液體培養(yǎng)基含有100 μ g/mL氨卞青霉素。作為本發(fā)明ー種耐高溫重組脂肪酶的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(3)中加入的IPTG的濃度為O. 2mmol/L，誘導(dǎo)溫度為30°C，誘導(dǎo)時(shí)間為5h。作為本發(fā)明ー種耐高溫重組脂肪酶的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述制備方法還包括步驟(4):目的蛋白Lip34的檢測取I. 5mL誘導(dǎo)后的菌液，12000 Xg離心lmin，棄上清，用 50 μ L50mmol/L 的 Tris-HCl (pH 8. O)重懸沉淀,加入等體積 4X Loading buffer,于沸水中煮10min，13000Xg離心IOmin ;取10 μ L上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度5%。其中，Lip34預(yù)測相對(duì)分子量約為31. 6kDa。由于pET32a(+)載體編碼硫氧還蛋白和六聯(lián)組氨酸標(biāo)簽等與目的的蛋白融合表達(dá)，因此Lip34重組脂肪酶的相對(duì)分子量約為46kDa。同時(shí)，本發(fā)明還提供一種采用如上所述方法制備得到的耐高溫重組脂肪酶Lip34。所述Lip34的脂肪酶水解活性為O. 34U/mg, Lip34最適溫度為85°C，最適pH為11. O。所述重組脂肪酶Lip34是lip34在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)后經(jīng)鎳柱親和層析的方法純化得到，所述Lip34具有脂肪酶保守序列，即位于氨基酸序列82-83位的HG ニ肽的氧陰離子洞和120-125位的五肽GASSGG(GA-X-S-X-G)。本發(fā)明提供ー種新型的耐高溫脂肪酶基因，將該基因構(gòu)建到質(zhì)粒pET32a中，再將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)并純化。經(jīng)生物信息學(xué)分析表明，該基因表達(dá)的產(chǎn)物具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，具有較大的エ業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力。


圖I為本發(fā)明所述含有脂肪酶基因lip34的表達(dá)載體的構(gòu)建全過程的瓊脂糖凝膠電泳的圖譜；
圖I 中，a :lip34PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠回收 M :lkb ladderl lip34 ；b :lip34DNA 酶切回收 M:lkb ladder I :lip34 ;c :pET32a 質(zhì)粒酶切回收 M :lkb ladderl :pET32a ;d :重組質(zhì)粒酶切 M:lkb ladderl :pET32_lip34。圖2為為脂肪酶基因lip34的表達(dá)檢測圖譜；圖2中，M為Marker，I為正對(duì)照，2為負(fù)對(duì)照，3為誘導(dǎo)表達(dá)的Lip34。圖3為誘導(dǎo)溫度對(duì)重組脂肪酶Lip34表達(dá)水平的影響；圖3中，M為Marker ;1_4為不同溫度誘導(dǎo)后Lip34的表達(dá)(1_4的溫度分別為18°C，25°C，30°C，37°C )。圖4為IPTG濃度對(duì)重組脂肪酶Lip34表達(dá)水平的影響；圖4中，M為Marker，I為對(duì)照，2_8為不同IPTG濃度誘導(dǎo)后Lip34的表達(dá)(2_8中 IPTG 濃度分別為 0mmol/L,0. OSmmoI /I,, O. Immol /I,, O. 2mmol/L, O. 4mmol/L, O. 6mmol/L,0. 8mmol/L, I. OmmoI/L)。圖5為誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組脂肪酶Lip34表達(dá)水平的影響；圖5 中，M為Marker，I 為對(duì)照，2-9 分別為誘導(dǎo) Oh，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h后 Lip34的表達(dá)。
圖6為重組脂肪酶Lip34純化過程各組分的SDS-PAGE分析；圖6中，I為層析后的流液體，2為洗滌一次緩沖液，3為洗滌兩次緩沖液，4為一次洗脫液，5為二次洗脫液,6為三次洗脫液，7為四次洗脫液,8為沉淀。圖7為溫度對(duì)重組脂肪酶Lip34活性的影響。圖8為pH對(duì)重組脂肪酶Lip34活性的影響。
具體實(shí)施例方式為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步描述。實(shí)施例II、新型脂肪酶基因lip34的獲得采用隨機(jī)克隆子測序分析篩選方法，隨機(jī)選取4個(gè)陽性克隆子測序，測序由上海英駿生物技術(shù)公司完成，然后運(yùn)用軟件對(duì)所得序列進(jìn)行分析。僅有34號(hào)質(zhì)粒存在ー個(gè)825bp大小的完整脂肪酶基因，命名為lip34。2、根據(jù)脂肪酶基因lip34的序列設(shè)計(jì)引物如下Iip34-F:5， -CGCGGATCCATGAGACAATTGAC-3， Iip34-R 5，-CCGCTCGAGTTAATTGTTAGTGTCCC-3，3、PCR 擴(kuò)增
反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種新型耐高溫脂肪酶基因，其特征在于，所述脂肪酶基因命名為lip34，所述脂肪酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
2.一種如權(quán)利要求I所述耐高溫脂肪酶基因的制備方法，其特征在于，包括以下步驟從紅樹林土壤宏基因組文庫中隨機(jī)挑選4個(gè)陽性克隆子，測序，然后運(yùn)用軟件對(duì)所得序列進(jìn)行分析，即可獲得所述耐高溫脂肪酶基因。
3.一種含有如權(quán)利要求I所述新型耐高溫脂肪酶基因的重組質(zhì)粒pET32a-lip34，根據(jù)脂肪酶基因lip34的序列設(shè)計(jì)引物，以提取的質(zhì)粒pUC18-lip34為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳并回收產(chǎn)物1，凝膠回收產(chǎn)物I經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI與XhoI雙酶切并回收產(chǎn)物2，質(zhì)粒pET32a經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切后與回收產(chǎn)物2連接，獲得連接產(chǎn)物，即重組質(zhì)粒 pET32a-lip34。
4.一種含有如權(quán)利要求I所述的新型耐高溫脂肪酶基因的表達(dá)載體，其特征在于， 采用如下方法構(gòu)建所得采用電轉(zhuǎn)法，將權(quán)利要求3所得的重組質(zhì)粒pET32a-lip34轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，將細(xì)菌懸浮液恢復(fù)培養(yǎng)并稀釋涂布于氨芐青霉素抗 性培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，即得耐高溫脂肪酶基因的表達(dá)載體大腸埃希氏菌BL21-pET32a-lip34。
5.一種耐高溫重組脂肪酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)重組質(zhì)粒pET32a-lip34的構(gòu)建根據(jù)脂肪酶基因lip34的序列設(shè)計(jì)引物，以提取的質(zhì)粒PUC18-1 ip34為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳并回收產(chǎn)物I，凝膠回收產(chǎn)物I經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI與XhoI雙酶切并回收產(chǎn)物2，質(zhì)粒pET32a經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切后與回收產(chǎn)物2連接，獲得連接產(chǎn)物，即重組質(zhì)粒pET32a-lip34 ； (2)脂肪酶基因lip34表達(dá)載體的構(gòu)建采用電轉(zhuǎn)法，將重組質(zhì)粒pET32a-lip34轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，將細(xì)菌懸浮液恢復(fù)培養(yǎng)并稀釋涂布于氨芐青霉素抗性培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子； (3)目的蛋白Lip34的誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于含氨芐青霉素抗性的平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按體積比I : 100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)基，于37°C、200rpm培養(yǎng)至0D_ = 0. 6 0. 8 ;加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)；培養(yǎng)后經(jīng)鎳柱親和層析純化，即得重組脂肪酶Lip34。
6.如權(quán)利要求5所述的耐高溫重組脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的LB液體培養(yǎng)基含有100 U g/mL氨卞青霉素。
7.如權(quán)利要求5所述的耐高溫重組脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中加入的IPTG的濃度為0. 2mmol/L，誘導(dǎo)溫度為30°C，誘導(dǎo)時(shí)間為5h。
8.如權(quán)利要求5所述的耐高溫重組脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括步驟(4):目的蛋白Lip34的檢測取I. 5mL誘導(dǎo)后的菌液，12000 Xg離心lmin，棄上清，用 50 V- L50mmol/L 的 Tris-HCl (pH 8. 0)重懸沉淀,加入等體積 4 X Loading buffer,于沸水中煮10min，13000Xg離心IOmin ;取10 y L上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度5%。
9.一種采用如權(quán)利要求5所述方法制備得到的耐高溫重組脂肪酶Lip34。
10.如權(quán)利要求9所述的耐高溫重組脂肪酶Lip34，其特征在于，所述Lip34的脂肪酶水解活性為0. 34U/mg, Lip34最適溫度為85°C， 最適pH為11. O。
全文摘要
本發(fā)明公開一種新型耐高溫脂肪酶基因，所述脂肪酶基因命名為lip34，所述脂肪酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；同時(shí)，本發(fā)明還公開了所述新型耐高溫脂肪酶基因的制備方法以及含有所述新型耐高溫脂肪酶基因的重組質(zhì)粒pET32a-lip34和表達(dá)載體。另外，本發(fā)明還公開了一種耐高溫重組脂肪酶及其制備方法，將所述新型耐高溫脂肪酶基因lip34在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中過量表達(dá)，大大縮短了脂肪酶的生產(chǎn)周期，同時(shí)，采用所述方法得到的重組脂肪酶，具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有很大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102732538SQ20121012723
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者何磊, 龐柳, 陸勇軍, 龍思梅 申請(qǐng)人:中山大學(xué)