專利名稱：沙門氏菌內(nèi)標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量快速檢測的方法和試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域的核酸檢測方法。具體而言，本發(fā)明涉及沙門氏菌SigD/SigE基因帶內(nèi)標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量快速檢測的方法和試劑盒以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
沙門氏菌(Salmonella spp.)是重要的食源性致病菌之一，主要通過肉類、奶類、蛋類等食品傳播、感染人體，引發(fā)傷寒、敗血癥、急性胃腸炎等病癥。在世界各國細(xì)菌性食物中毒病例中，沙門氏菌引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。建立一種行之有效的食源性沙門氏菌的定量檢測方法，以提高對(duì)該菌的檢測速度和準(zhǔn)確性，使受污染的食品得到及時(shí)處理，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生和口岸檢疫等中都有重要意義。
然而，傳統(tǒng)的檢測方法耗時(shí)、操作繁瑣，而基于免疫學(xué)原理的產(chǎn)品存在檢測限高、特異性不強(qiáng)等問題。尤其是常規(guī)的分子生物學(xué)檢測方法大多以細(xì)菌的DNA為模板，無法區(qū)分死菌和活菌。而很多研究又表明，細(xì)菌中的rRNA和tRNA分子是相當(dāng)穩(wěn)定的，與細(xì)菌的活性沒有直接關(guān)系。只有mRNA是微生物在存活狀態(tài)下產(chǎn)生的一類核酸大分子物質(zhì)，其表達(dá)量的多少和質(zhì)量的高低(完整性)與細(xì)胞的狀態(tài)密切相關(guān)，從mRNA的檢測結(jié)果中就可以直接獲得食品中存活微生物的信息。且mRNA的豐度和活性又與所選擇的基因及其在基因內(nèi)擴(kuò)增的位置及檢測的難易度相關(guān)。傳統(tǒng)生化檢測方法可以區(qū)分死菌和活菌，但其耗費(fèi)時(shí)間長；而運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR，簡稱RT-PCR)方法，目前還沒有有效的方法能消除抑制劑引起的假陰性問題，因此開發(fā)有效監(jiān)測假陰性現(xiàn)象以避免漏檢的產(chǎn)品顯得十分必要。為此，本發(fā)明人經(jīng)過長期研究，令人意外地研究出了一種沙門氏菌pipC/sigD/E內(nèi)標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄快速檢測的方法，不但能避免假陰性漏檢的現(xiàn)象以有效監(jiān)控PCR擴(kuò)增，而且沙門氏菌屬的檢測特異性強(qiáng)，可有效區(qū)分死細(xì)菌和活細(xì)菌，快速，檢測靈敏度高，并可以應(yīng)用于食品中沙門氏菌的高通量篩檢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一在于提供一種沙門氏菌內(nèi)標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量快速檢測的方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二在于提供一種沙門氏菌內(nèi)標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量快速檢測試劑盒。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三在于提供上述試劑盒在制備用于檢測樣品中活的沙門氏菌的檢測試劑產(chǎn)品中的應(yīng)用。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了一種沙門氏菌內(nèi)標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量快速檢測的方法，其包括如下步驟(I)提取樣品中的RNA ；
(2)制備內(nèi)標(biāo)，包括如下步驟A.以原殼小球藻的cDNA或GenBank登錄號(hào)⑶269622. I所示的核酸為模板，用引物 zds-F :5’ -GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. I)和 zds_R :5’ -AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 2)進(jìn)行第一次 PCR 擴(kuò)增，得到初始 PCR 產(chǎn)物；B.以初始 PCR 產(chǎn)物為模板，用引物 s45-F/zds-F :5’ -TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCG TGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. 3)和 s45-R/zds_R :5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGC GGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 4)進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到第二次PCR產(chǎn)物；C.以第二次PCR產(chǎn)物為模板，用引物T7/s45-F :5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGC ATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 5)和 S45-R :5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ ID NO. 6)，進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增，得到第三次PCR產(chǎn)物；D.將第三次PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成RNA，作為內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)RNA序列如SEQ ID NO. 9所示；(3)將步驟(I)獲得的RNA與步驟(2)獲得的內(nèi)標(biāo)RNA混合，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(reverse-transcriptase real-time PCR)檢測。在本發(fā)明中，步驟(I)所述的樣品是潛在含有活的沙門氏菌的離體樣品，如食品、血液、血液制品、唾液、醫(yī)療用品或藥品等。由于沙門氏菌是食源性致病菌，因此優(yōu)選樣品來自于食品，如樣品是食品，或者樣品是食品的細(xì)菌平板培養(yǎng)物等。需要指出的是，檢測來自于食品的樣品，屬于食品安全檢測領(lǐng)域。提取RNA以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(即RT-PCR)檢測中所用的試劑和儀器已經(jīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握，而且目前有大量商品化的試劑和儀器可供選用。例如，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，可以使用RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒來提取RNA，可以使用Premix Ex Taq 試劑以及ABI7500熒光定量PCR儀來進(jìn)行RT-PCR檢測。但是，這些試劑不提供RT-PCR的引物。優(yōu)選在本發(fā)明中，RT-PCR的引物為S45-F和S45-R，S45-F 的序列為 5’ -TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’(SEQ ID NO. 7)，S45-R 的序列為5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ ID NO. 8)。PCR和RT-PCR的反應(yīng)過程是本領(lǐng)域技術(shù)人員所能掌握的，每個(gè)循環(huán)一般包括在92-96°C的變性、低溫退火和72°C左右的延伸過程，其中最多變的是退火的溫度。根據(jù)本發(fā)明人研究，最優(yōu)選的RT-PCR的過程為40個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)為95°C /45s, 58°C /45s，72°C /45s。另外，根據(jù)本發(fā)明人研究，在步驟(2)制備內(nèi)標(biāo)中，最優(yōu)選的第一次、第二次和第三次PCR的退火溫度均為60°C，如也可以進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)為95°C /45s，60°C /45s, 72°C /45s。內(nèi)標(biāo)在RT-PCR的反應(yīng)體系中的含量對(duì)RT-PCR檢測的結(jié)果有一定的影響。根據(jù)本發(fā)明人研究，最優(yōu)選的內(nèi)標(biāo)在RT-PCR的反應(yīng)體系中的含量為3fg/l·! I。在第二方面，本發(fā)明提供了檢測試劑盒，其包括由如下方法制成的內(nèi)標(biāo)序列及制成該內(nèi)標(biāo)的引物序列 以原殼小球藻的cDNA或GenBank登錄號(hào)⑶269622. I所示的核酸為模板，用引物zds-F5’-GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. I)和 zds_R 5’-MGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’ (SEQID NO. 2)進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到初始PCR產(chǎn)物；以初始 PCR 產(chǎn)物為模板，用引物 s45-F/zds-F 5’-TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCG TGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. 3)和 s45-R/zds_R 5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 4)進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到第二次PCR產(chǎn)物。以第二次PCR 產(chǎn)物為模板，用引物 T7/s45-F 5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGC ATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 5)和 S45-R 5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ IDNO. 6)，進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增，得到第三次PCR產(chǎn)物，以及將第三次PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成RNA，作為內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)RNA序列如SEQ ID NO. 9所示。然而，RNA不容易保存，因此優(yōu)選檢測試劑盒包括制成上述內(nèi)標(biāo)的原料，即包括原殼小球藻的cDNA或GenBank登錄號(hào)⑶269622 . I所示的核酸，引物zds_F(SEQ ID NO. I)和 zds-R(SEQ ID NO. 2)，引物 s45-F/zds_F (SEQ ID NO. 3)和 s45-R/zds_R(SEQ ID NO. 4),引物T7/s45-F(SEQ ID NO. 5)和S45_R(SEQ ID NO. 6)。另外，優(yōu)選檢測試劑盒還進(jìn)一步包括PCR試劑和/或體外轉(zhuǎn)錄試劑。例如，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，體外轉(zhuǎn)錄試劑來自T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒。檢測試劑盒還可以包括提取RNA和/或RT-PCR檢測中所用的試劑。這些試劑可以通過市場渠道購買，如可以將現(xiàn)有的提取RNA和/或RT-PCR檢測試劑盒中的試劑進(jìn)行分裝。優(yōu)選檢測試劑盒還包括引物S45-F和S45-R，S45-F 的序列為 5’-TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 7), S45-R 的序列為5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ ID NO. 8)。在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面的檢測試劑盒在制備用于檢測樣品中活的沙門氏菌的方法的檢測試劑產(chǎn)品中的應(yīng)用。檢測試劑產(chǎn)品包括檢測試劑盒、檢測試劑等，進(jìn)一步地，還可以包括記載檢測樣品中活的沙門氏菌的方法的說明書。優(yōu)選該應(yīng)用用于本發(fā)明第一方面的方法，即本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面的檢測試劑盒在制備用于本發(fā)明第一方面的方法的檢測試劑產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明取得的有益效果在于有效避免了沙門氏菌屬檢測中的假陰性漏檢，有效監(jiān)控RT-PCR擴(kuò)增過程；沙門氏菌屬的檢測特異性強(qiáng)，對(duì)沙門氏菌屬各菌種的檢測適應(yīng)性廣；可有效區(qū)分死和活的沙門氏菌，使得檢測結(jié)果更能滿足實(shí)際食品安全檢測的需求；檢測方法快速、靈敏度高，適用于高通量篩選。為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。


圖I顯示了實(shí)施例I. 3內(nèi)標(biāo)制備過程中各步驟的PCR產(chǎn)物的電泳圖譜；其中，圖I(A)顯示了第一次PCT產(chǎn)物的電泳圖譜；圖I(B)顯示了第二次PCT產(chǎn)物的電泳圖譜；圖I(C)顯示了第三次PCT產(chǎn)物的電泳圖譜。圖2顯示了實(shí)施例I. 5未加以及加入不同內(nèi)標(biāo)量的RT-PCR圖譜及其融解曲線分析圖譜。
具體實(shí)施例方式以下本文將通過具體的實(shí)施例來描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratoryPress)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社,北京，中國，2001年)、《RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)》(科學(xué)出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測技術(shù)》(科學(xué)出版社，北京，中國，1991)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來實(shí)施。I. I主要試劑和儀器β -巰基乙醇，2. 46mol/l，異硫氰酸胍抽提緩沖液，購自上海柏匯申生物科技有限公司；蛋白酶K,20mg/ml,天根生物科技(北京)有限公司；異丙醇(Cat. No. 80109218)、乙醇(Cat. No. 10009218)、三氯甲烷(Cat. No. 10006818)購自上海國藥集團(tuán)；RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒，購自天根生物公司；膠回收試劑盒Wizard SV Gel andPCR Clean-Up System(Promega Cat. No. A9281) ；SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (PerfectReal Time) (TAKARA 公司)瓊脂糖試劑盒反轉(zhuǎn)錄試劑盒,TaKaRa PrimeScript RT reagentKit (Cat. No. DRR037S)及實(shí)時(shí)熒光 PCR 試劑盒 Premix Ex Taq (Cat. No. DRR039S)，購自·大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自美國Axygen公司；紫外核酸與蛋白質(zhì)分析儀，購自美國Beckman公司；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司，Cat.No. 91106A-50) ；ABI7500 熒光定量 PCR 儀，購自 ABI 公司。I. 2菌株以及RNA的抽提菌株均可以購自于中國科學(xué)院微生物研究所和中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心以及美國典型微生物保藏中心，菌株編號(hào)如表I所示。培養(yǎng)方法可以按照上述菌株提供單位推薦的方法進(jìn)行，參照廠商說明，用RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat. No. DP430)來提取。表I沙門氏菌及非沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌株以及用本發(fā)明的PCR方法檢測的結(jié)果
菌種菌株編號(hào)血清型PCR檢測
____結(jié)果*
雞沙門氏菌CMCC50770 雞沙門氏菌 +
傷寒沙門菌TyphiCMCC50180 傷寒+
鼠傷寒沙門菌Typhimurium ATCC 14028 鼠傷寒+
權(quán)利要求
1.一種沙門氏菌內(nèi)標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量快速檢測的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)提取樣品中的RNA； (2)制備內(nèi)標(biāo)，包括如下步驟 A.以原殼小球藻的cDNA或GenBank登錄號(hào)⑶269622.I所示的核酸為模板，用引物 zds-F :5’ -GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. I)和 zds_R :5’ -AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 2)進(jìn)行第一次 PCR 擴(kuò)增，得到初始 PCR 產(chǎn)物； B.以初始PCR 產(chǎn)物為模板，用引物 s45-F/zds-F :5’ -TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. 3)和 s45-R/zds_R :5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGG TGT-3’ (SEQ ID NO. 4)進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到第二次PCR產(chǎn)物； C.以第二次PCR 產(chǎn)物為模板，用引物 T7/s45-F :5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGCATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 5)和 S45-R :5’-AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ IDNO. 6)，進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增，得到第三次PCR產(chǎn)物； D.將第三次PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成RNA，作為內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)RNA序列如SEQID NO. 9所示； (3)將步驟(I)獲得的RNA與步驟(2)獲得的內(nèi)標(biāo)RNA混合，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述樣品來自于食品。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物為S45-F 和 S45-R，S45-F 的序列為 5’ -TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 7)，S45-R 的序列為 5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ ID NO. 8)。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的條件為950C /45s, 580C /45s, 72°C /45s, 40 個(gè)循環(huán)。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述內(nèi)標(biāo)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系中的含量為3fg/y I。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，第一次、第二次和第三次PCR擴(kuò)增的退火溫度均為60°C。
7.一種含內(nèi)標(biāo)的沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括由如下方法制成的內(nèi)標(biāo)序列及制成該內(nèi)標(biāo)的引物序列 以原殼小球藻的cDNA或GenBank登錄號(hào)⑶269622. I所示的核酸為模板，用引物 zds-F :5’ -GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. I)和 zds_R :5’ -AAGTACGGGTCGGCGGGTGT-3’ (SEQ ID NO. 2)進(jìn)行第一次 PCR 擴(kuò)增，得到初始 PCR 產(chǎn)物； 以初始 PCR 產(chǎn)物為模板，用引物 s45-F/zds-F :5’ -TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGGCGTGCCTGTGA-3’ (SEQ ID NO. 3)和 s45-R/zds_R :5’-AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGGTCGGCGGG TGT-3’ (SEQ ID NO. 4)進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到第二次PCR產(chǎn)物； 以第二次 PCR 產(chǎn)物為模板，用引物 T7/s45-F 5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGCAT AAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 5)和 S45-R :5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ IDNO. 6)，進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增，得到第三次PCR產(chǎn)物，以及 將第三次PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄成RNA，作為內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)RNA序列如SEQ ID NO. 9所示。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，還包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物S45-F 和 S45-R，S45-F 的序列為 5’ -TGGCATAAAGGGACAGCAC-3’ (SEQ ID NO. 7)，S45-R 的序列為 5’ -AGCGGCAAAGATCGTACAG-3’ (SEQ ID NO. 8)。
9.如權(quán)利要求7或8所述的檢測試劑盒在制備用于檢測樣品中活的沙門氏菌的檢測試劑產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用,其用于權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種帶有內(nèi)標(biāo)的，以沙門氏菌sigD/sigE基因?yàn)榘袠?biāo)的逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR快速檢測方法，其中包括經(jīng)三次PCR擴(kuò)增得到的RNA內(nèi)標(biāo)。另外，本發(fā)明還提供了相應(yīng)試劑盒以及應(yīng)用。本發(fā)明可廣泛用于實(shí)驗(yàn)室研究、食品安全、醫(yī)藥衛(wèi)生等眾多領(lǐng)域，不但能避免假陰性漏檢的現(xiàn)象以有效監(jiān)控PCR擴(kuò)增，而且沙門氏菌屬的檢測特異性強(qiáng)，可有效區(qū)分死細(xì)菌和活細(xì)菌，快速，檢測靈敏度高，并可以應(yīng)用于食品中沙門氏菌的高通量篩檢。
文檔編號(hào)C12R1/42GK102676662SQ20121012938
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者史賢明, 周敏, 楊捷琳, 楊柳, 潘良文 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué), 中華人民共和國上海出入境檢驗(yàn)檢疫局