專利名稱：一種三烯抗生素及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗生素，特別涉及一種三烯抗生素及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物病害一直以來都是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的大敵，在三類植物病害中由病原真菌引起的植物病害位居首位(真菌病害、細(xì)菌病害和病毒病害)，在小麥的200多種病害中，真菌病害占據(jù)了 90%左右，因此所造成的損失每年可占其總產(chǎn)量的10%-20%。長期以來，人們?yōu)閷共『Γ褂昧舜罅康幕瘜W(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致了三大難題的產(chǎn)生污染環(huán)境，積累殘毒，最終危害人類 自身健康；病原真菌的抗藥性呈爆發(fā)式上升；有益微生物被殺死,破壞了動(dòng)植物體內(nèi)微生物種群的平衡，使得病原真菌成為優(yōu)勢種群，導(dǎo)致病害的暴發(fā)流行?；诨瘜W(xué)農(nóng)藥的這些毒副作用以及人們環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng)和對綠色無公害食品要求的逐漸提高，研發(fā)、生產(chǎn)和使用具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高科技、無公害生物農(nóng)藥已經(jīng)成為了當(dāng)務(wù)之急。農(nóng)用抗真菌抗生素作為生物農(nóng)藥的一個(gè)重要的分支，因其具有高效、易降解、無殘留、無污染等優(yōu)點(diǎn)而日益受到人們的重視，如井R霉素、春雷霉素、中生菌素、武夷霉素、新多氧霉素、多抗霉素、農(nóng)抗120、慶豐霉素等，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于防治各類植物病原真菌病害中。農(nóng)用抗生素是在微生物代謝過程中產(chǎn)生的，它是指在低濃度下就能抑制或能殺死農(nóng)作物病、蟲、草害或者可以調(diào)節(jié)作物生長發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)，美國、英國、日本等國家最早開始應(yīng)用農(nóng)用抗生素。對農(nóng)用抗生素的研究是隨著醫(yī)用抗生素的發(fā)展而發(fā)展起來的，早期使用如鏈霉素、灰黃霉素、土霉素等醫(yī)用抗生素來防治植物病害。后來，Dekker等人相繼報(bào)道了一批例如放線菌酮(Cycloheximide)、抗霉素A(ActimycinA)以及其他一些多烯類農(nóng)用抗生素。日本于1958年成功研制出殺稻痕菌-S(Blasticidin-s),并在1961年大規(guī)模應(yīng)用于稻瘟病的防治，這就基本替代了有機(jī)汞制劑在稻瘟病防治上的使用，可以說殺稻瘟菌素-S的發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)的工業(yè)化，是農(nóng)用抗生素開發(fā)的里程碑。在這之后，相繼開發(fā)的又有春雷霉素、多抗霉素等一系列高效低毒的抗真菌農(nóng)藥新品種。我國對農(nóng)用抗生素的研究開始于上世紀(jì)五十年代初，起步雖晚但發(fā)展較為迅速。井網(wǎng)霉素、公主嶺霉素(Gongzhulingmycin)、農(nóng)抗120、武夷菌素、春雷霉素等農(nóng)用抗生素品種相繼被研制出并得到應(yīng)用。經(jīng)過幾十年的探索研究，我國在篩選新型農(nóng)用抗生素的方法上有了較大的提高，近年來又研發(fā)出天柱菌素、中生菌素(Zhongshengmycin)、新多氧霉素等。多烯類抗真菌抗生素是作用于真菌感染的藥物，它的作用機(jī)理是與真菌細(xì)胞膜的固醇部分進(jìn)行選擇性結(jié)合，在細(xì)胞膜上形成孔道，從而改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種小分子物質(zhì)外泄，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡而發(fā)揮抗菌作用，但它對細(xì)菌無作用，因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞膜不含固醇。多烯類抗真菌藥物在近幾年來發(fā)展較快。多烯類抗生素中有一類是多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素，它們的組成包括由25-37個(gè)碳原子組成的內(nèi)酯環(huán)和環(huán)上的一部分共軛多烯結(jié)構(gòu)，在其對應(yīng)部位有羥基，并由苷鍵連接一個(gè)或多個(gè)氨基糖。按結(jié)構(gòu)中共軛雙鍵數(shù)目的不同可分為三、四、五、六、七烯，每一種都有其特異的紫外吸收峰值。這類抗生素有許多共同的性質(zhì)，如廣譜抗真菌、遇光易分解、不易溶于水、靜脈給藥毒性高、口服毒性低等。由放線菌產(chǎn)生的具有共軛四烯的大環(huán)內(nèi)酯，紫外吸收光譜在(291±2)nm，(302±2)nm，(320±3)nm有特征吸收峰，每個(gè)吸收峰都有抗真菌活性。目前多烯類抗真菌藥物約有50余種，如兩性霉素B (amphotericin B, AMB)的新制劑AMB是目前唯一臨床使用的可靜脈注射的多烯類抗真菌抗生素，它能與真菌細(xì)胞膜中的麥角留醇(ergosterol)結(jié)合并使其氧化,具有殺真菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣等特點(diǎn)，不足之處是AMB有較強(qiáng)的腎毒性，目前臨床研究及開發(fā)上市的AMB新制劑主要有3類脂質(zhì)體(liposome)、脂質(zhì)復(fù)合物(lipid complex)和膠體分散劑(colloidal dispersion),它們都是以脂類為介質(zhì)制成的。制霉菌素脂質(zhì)體NyotranNystatin(NYS)能結(jié)合麥角甾醇，降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，對多種真菌有抗生活性，但由于其在胃腸道不易被吸收，且毒性較大等原因，使得該藥的臨床應(yīng)用受到很大的限制。Aronex公司的Johnson等研制成商品名為Nyotran的脂質(zhì)體，不僅大大提高了療效，而且降低了它的毒副作用。3874H1和3874H3這2個(gè)化合物與AMB類似，均屬于七烯類抗生素，其中3874H1含有一個(gè)芳香環(huán)，而3874H3不含芳香環(huán)，因此3874H3的水溶性很強(qiáng)，兩者都有廣泛的抗菌作用，對多種皮膚真菌、絲狀真菌及酵母都有抗生活性，且活性高于AMB和NYS。
由于真菌是真核微生物，它們與高等動(dòng)植物的許多生物特性都相似，因此真菌抗生素不具有細(xì)菌抗生素那種高效低毒且專一性好的特性，一般它們的毒副作用較大且療效較低。因此，盡管臨床上抗真菌感染的藥物有許多種，但多數(shù)化學(xué)合成藥只能用于表面感染的治療，能作為體內(nèi)用藥的非常少。所以，篩選殺菌(或抑菌)效率高、副作用小、專一性好的抗真菌抗生素具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種三烯抗生素及其制備方法和應(yīng)用，該種抗生素具有較好的抑菌活性，且提取的時(shí)間周期明顯縮短，經(jīng)濟(jì)成本也相應(yīng)降低，純度高。本發(fā)明采取的技術(shù)方案為—種三烯抗生素，其分子式為C23H34O8S,結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1.一種三烯抗生素，其分子式為C23H34O8S，結(jié)構(gòu)式如下
2.權(quán)利要求I所述的三烯抗生素的制備方法，其特征是，包括如下步驟 (1)發(fā)酵液預(yù)處理從山東鏈霉菌成熟斜面上刮取菌體接種于高氏I號液體培養(yǎng)基中，25-30°C培養(yǎng)70-75h，再接種至發(fā)酵罐中25_30°C攪拌條件下發(fā)酵4_5天，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH =3-6，將發(fā)酵液離心除去菌體留上清液； (2)用大孔樹脂X-5柱層析預(yù)處理將上清液在大孔樹脂X-5柱上樣，先用去離子水沖洗，然后用40%乙醇沖洗洗掉色素等雜質(zhì)，再用50%乙醇洗下活性組分，收集洗脫液，將收集的洗脫液閃蒸濃縮，濃縮至上清液體積的30-40%，得初步濃縮液； (3)用大孔樹脂HP-20柱層析預(yù)處理將初步濃縮液在大孔樹脂HP-20柱上樣，先用45%乙醇沖洗洗掉雜質(zhì)，然后用50%乙醇洗下活性組分，收集洗脫液，將收集的洗脫液閃蒸濃縮，濃縮至上清液體積的20 ±5%，得二次濃縮液； (4)HPLC半制備型液相分離將二次濃縮液液相分離，HPLC半制備柱為C18，流動(dòng)相為甲醇和20mM乙酸銨pH3. 0，采用程序梯度洗脫方法，20mM乙酸銨pH3. O的起始濃度為50%，終止?jié)舛葹?0%，甲醇起始濃度為50%，終止?jié)舛葹?0%，收集液相中的各個(gè)峰，除去溶劑甲醇和乙酸銨； (5)將活性組分所在的峰對應(yīng)的收集液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥即得所要純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三烯抗生素的制備方法，其特征是，步驟(I)所述的高氏I號液體培養(yǎng)基的重量份比組成為可溶性淀粉20份、KNO3 I份、NaCl O. 5份、K2HPO4 · 3Η200· 655 份、MgSO4O. 5 份、FeSO4 O. 01 份、水 1000 份；ρΗ 7. 2 7. 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三烯抗生素的制備方法，其特征是，步驟(I)所述的攪拌速度為 200-400r. mirr1 ;所述的離心速度為 6000-12000r. mirT1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三烯抗生素的制備方法，其特征是，步驟(5)所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度50°C，冷凍干燥的時(shí)間24-32h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三烯抗生素的制備方法，其特征是，步驟(5)活性組分所在的峰為 271±lnm。
7.權(quán)利要求I所述的三烯抗生素在制備真菌抑制劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I所述的三烯抗生素在制備蘋果腐爛菌、白地霉菌抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及三烯抗生素，其分子式為C23H34O8S，結(jié)構(gòu)式如下，其制備是用山東鏈霉菌培養(yǎng)發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心除去菌體留上清液，上清液先用大孔樹脂X-5柱層析預(yù)處理，再用大孔樹脂HP-20柱層析預(yù)處理，然后進(jìn)行HPLC半制備型液相分離，將活性組分所在的峰對應(yīng)的收集液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥即得所要純品。本發(fā)明能得到雜質(zhì)比較少，純度比較高的純品，在相同濃度下，本發(fā)明抗生素抑菌圈直徑較大，抑菌效果較強(qiáng)。
文檔編號C12R1/465GK102659734SQ20121012965
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者李德舜, 陳琦, 馬井玉 申請人:山東大學(xué)