專利名稱：多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效評價方法、疾病預(yù)測方法以及多態(tài)性檢測用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效評價方法、疾病預(yù)測方法以及多態(tài)性檢測用試劑盒。
背景技術(shù)：
—直以來,作為高尿酸血癥的治療祀標(biāo)分子，已知作為尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子的Urate轉(zhuǎn)運(yùn)子(URAT1/SLC22A12)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子 9 (GLIT9/SLC22A12)。 近年來，明確了由也被稱為 BCRP (breast cancer resistance protein)的ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member 2)基因編碼高容量性的排尿轉(zhuǎn)運(yùn)子。另外，受到ABCG2基因的多態(tài)性的存在與痛風(fēng)的發(fā)病風(fēng)險的增加有關(guān)的啟發(fā)，明確了 ABCG2基因是痛風(fēng)的主要致病基因(例如，參見實驗醫(yī)學(xué)2010年，第28卷，第8號，p.1285-1289)。另外，還受到ABCG2基因的多態(tài)性的存在與胎盤中的蛋白質(zhì)表達(dá)異常有關(guān)聯(lián)(例如，參見Drug. Metab. Dispos.，2005年，第33卷，第I號，p. 94-101)的啟示啟發(fā)，人們期待短時間、低成本并且簡便地測定ABCG2基因的多態(tài)性的方法。作為測定基因的多態(tài)性的方法，已知有使用被設(shè)計為擴(kuò)增含有想要測定的堿基的部分的引物進(jìn)行PCR，用能夠以該特定堿基中有無突變來區(qū)分是否切斷的限制性內(nèi)切酶來切斷，之后用電泳檢測是否切斷了的方法(PCR-RFLP法)(例如，參見Genet. Mol. Res. ,2010年，第9卷，第I號，p. 34-40)。另外，還已知有在用PCR法擴(kuò)增了含有突變的區(qū)域之后，使用熒光染料標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行熔解曲線分析，并基于熔解曲線分析的結(jié)果來分析堿基序列的突變的方法(例如，參見日本專利文獻(xiàn)特開2002-119291號公報)。但是，在PCR-RFLP法中，在PCR反應(yīng)之后需要提取擴(kuò)增產(chǎn)物來進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理。因此，擴(kuò)增產(chǎn)物有可能混入下一反應(yīng)體系，由此有可能獲得假陽性、假陰性的結(jié)果。另夕卜，由于在PCR結(jié)束后用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理，之后進(jìn)行電泳，因此有時到檢測為止需要的時間非常長。而且，由于操作復(fù)雜，難以自動化。因此，期望進(jìn)一步開發(fā)用于ABCG2基因多態(tài)性檢測的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明要解決的問題在于提供能夠高靈敏度且簡便地檢測ABCG2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針、使用該探針的多態(tài)性檢測方法。另外，本發(fā)明要解決的問題在于提供使用了該檢測方法的藥效評價方法和疾病預(yù)測方法。此外，本發(fā)明要解決的問題還在于提供使用了該檢測用探針的多態(tài)性檢測用試劑盒。用于解決問題的手段
用于解決上述問題的具體手段如下。<1> 一種ABCG2基因的多態(tài)性檢測用探針，含有從包括下述P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸(Pl)寡核苷酸，其為與含有在序列編號I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對于除了與第311位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外與序列編號I互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第311位堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記；(P1’)寡核苷酸，其為與含有在序列編號I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第311位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外具有與序列編號I相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第311 位喊基對應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；(P2)寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對于除了與第251位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外與序列編號2互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第251位喊基對應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；(P2’)寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第251位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外具有與序列編號2相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第251位喊基對應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；(P3)寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對于除了與第152位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外與序列編號3互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第152位喊基對應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；以及(P3’)寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第152位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外具有與序列編號3相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第152位堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。 <2>根據(jù)〈1>所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第311位堿基位于從5’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置,所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第251位堿基位于從5’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置,所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第152位堿基位于從3’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置?！?>根據(jù)〈1>或〈2>所述的ABCG2基因的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl或P1’突光標(biāo)記寡核苷酸的被突光染料標(biāo)記的第311位堿基位于5’末端,所述P2或P2’突光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第251位堿基位于5’末端，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被突光染料標(biāo)記的第152位堿基位于3’末端。<4>根據(jù)〈1> 〈3>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度減少或增加。<5>根據(jù)〈1> 〈4>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度減少?！?>根據(jù)<1> <5>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為11 40，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為18 40，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為10 40。<7>根據(jù)〈1> 〈6>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為11 28，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為20 30，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為15 30。<8>根據(jù)〈1> 〈7>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為14 18，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為22 26，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為18 22。 <9>根據(jù)〈1> 〈8>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針為熔解曲線分析用的探針。<10> 一種ABCG2基因的多態(tài)性檢測方法，其使用〈1> 〈9>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針。<11>根據(jù)〈10>所述的多態(tài)性檢測方法，其使用從包括〈1> 〈9>中任一項所述的所述P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少兩種多態(tài)性檢測用探針。<12>根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的多態(tài)性檢測方法，包括(I)使〈1> 〈9>中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交來獲得雜交體；(II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，并測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動；(III)基于所述熒光信號的變動來測定雜交體的解離溫度、即Tm值。(IV)基于所述Tm值來檢測所述試樣中的單鏈核酸中的ABCG2基因中的多態(tài)性的存在。〈13>根據(jù)權(quán)利要求12所述的多態(tài)性檢測方法，還包括在所述(I)的獲得雜交體之前或者與(I)的獲得雜交體的同時擴(kuò)增核酸。<14> 一種藥劑的藥效判定方法，包括通過〈10> 〈13>中任一項所述的多態(tài)性檢測方法來檢測ABCG2基因的多態(tài)性；以及基于檢測到的多態(tài)性的有無來判定對藥劑的耐受性或者藥劑的藥效。<15> 一種疾病預(yù)測方法，包括通過〈10> 〈13>中任一項所述的多態(tài)性檢測方法來檢測ABCG2基因的多態(tài)性；以及基于檢測到的多態(tài)性的有無來預(yù)測疾病的罹患風(fēng)險。<16> 一種多態(tài)性檢測用試劑盒，包含權(quán)利要求I至9中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針。<17>根據(jù)〈16>所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含下述引物對中的至少一者能夠擴(kuò)增含有序列編號I所示的堿基序列中的、與所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對；能夠擴(kuò)增含有序列編號2所示的堿基序列中的、與所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對；以及能夠擴(kuò)增含有序列編號3所示的堿基序列中的、與所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對。發(fā)明效果通過本發(fā)明，能夠提供可高靈敏度且簡便地檢測ABCG2基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用探針、使用該探針的多態(tài)性檢測方法。另外，通過本發(fā)明，能夠提供使用了該檢測方法的藥效評價方法和疾病預(yù)測方法。此外，通過本發(fā)明還能夠提供使用了該檢測用探針的多態(tài)性檢測用試劑盒。


圖I的(A)是示出核酸混合物的熔解曲線的示例的圖，以及圖I的(B)是示出微 分熔解曲線的示例的圖；圖2的(A)和⑶是使用本發(fā)明實施例1-1涉及的多態(tài)性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖3是使用本發(fā)明實施例1-2涉及的多態(tài)性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖4的(A) (H)是使用本發(fā)明實施例2涉及的多態(tài)性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖5的(A) (C)是使用本發(fā)明實施例3涉及的多態(tài)性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖6的(A) (C)是使用本發(fā)明實施例4涉及的多態(tài)性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖7的(A) (C)是使用本發(fā)明實施例4涉及的多態(tài)性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖8的(A)和(B)是使用本發(fā)明比較例I涉及的多態(tài)性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖9是使用本發(fā)明比較例I涉及的多態(tài)性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖10的(A) ⑶是使用本發(fā)明比較例2涉及的多態(tài)性檢測用探針而獲得的熔解曲線；圖11的(A) (C)是使用本發(fā)明比較例3涉及的多態(tài)性檢測用探針而獲得的熔解曲線。
具體實施例方式本發(fā)明的探針是ABCG2基因的多態(tài)性檢測用探針，其含有從包括P1、P1’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸。通過本發(fā)明，能夠高靈敏度且簡便地檢測ABCG2基因的多態(tài)性。ABCG2基因的堿基序列相當(dāng)于與GeneID :9429,GenBank登錄號No. 000004(版本000004. 11)相當(dāng)?shù)男蛄兄械牡?9011415位堿基 第89080010位堿基的序列。本說明書中，將該第89011415位堿基 第89080010位堿基的序列作為“ABCG2基因的堿基序列”。本發(fā)明中，關(guān)于作為檢測對象的試樣中的試樣核酸、多態(tài)性檢測用探針或者引物的每個的序列，基于它們的相互互補(bǔ)的關(guān)系所記述的事項，只要不特別指出，也適用于各個序列和相對于各序列互補(bǔ)的序列。在將本發(fā)明的事項適用于相對于各序列互補(bǔ)的該序列時，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識的范圍內(nèi)，由該互補(bǔ)的序列識別的序列視為將說明書全體替換為與對應(yīng)的本說明書中記載的序列互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明中，“Tm值”是指雙鏈核酸解離的溫度(解離溫度Tm)，一般定義為260nm處的吸光度達(dá)到吸光度總上升量的50%時的溫度。即，當(dāng)加熱含有雙鏈核酸、例如雙鏈DNA的溶液時，260nm處的吸光度上升。這是因為雙鏈核酸DNA中的兩條雙鏈之間的氫鍵由于加熱而斷裂，解離成單鏈DNA (DNA的熔解)。并且，全部雙鏈核酸DNA解離成單鏈DNA時，其吸光度顯示為加熱開始時的吸光度(僅雙鏈核酸DNA的吸光度)的約I. 5倍左右，由此可以判斷熔解完成。Tm值基于該現(xiàn)象而設(shè)定。在本發(fā)明中，關(guān)于寡核苷酸的序列，當(dāng)稱為“從3’末端起數(shù)的第I 3位”時為以寡核苷酸鏈的3’末端為第I位起數(shù)的。同樣地，當(dāng)稱為“從5’末端起數(shù)的第I 3位”時 為以寡核苷酸鏈的5’末端為第I位起數(shù)的。在本說明書中，“步驟” 一詞不僅包含獨(dú)立的步驟，即使在不能與其他的步驟明確區(qū)別的情況下只要達(dá)到了本步驟預(yù)期的效果，則包含在本術(shù)語之內(nèi)。另外，在本說明書中，使用“ ”表示的數(shù)值范圍為將“ ”的前后記載的數(shù)值分別作為最小值和最大值包含的范圍。另外，在本發(fā)明中，組成物中的各成分的量在所述組成物中存在多種相當(dāng)于各成分的物質(zhì)的情況下，只要不特別指出，是指所述組成物中存在的該多種物質(zhì)的合計量的意思。下面說明本發(fā)明。<多態(tài)性檢測用探針>本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針(以下，有時僅稱為“探針”)包含從由包括下述P1’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸(以下，有時僅稱為“熒光標(biāo)記
寡核苷酸”)。(Pl)寡核苷酸，其為與含有序列編號I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列和除了與第311位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外與序列編號I互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第311位堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記；(P1’ )寡核苷酸，其為與含有序列編號I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列和除了與第311位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外具有與序列編號I相同堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第311位喊基對應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；(P2)寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對于除了與第251位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外與序列編號2互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第251位喊基對應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；(P2’ )寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列和除了與第251位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外具有與序列編號2相同堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第251位喊基對應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；
(P3)寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對于除了與第152位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外與序列編號3互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第152位喊基對應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記；以及(P3’ )寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列和除了與第152位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外具有與序列編號3相同堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第152位堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。通過含有至少一種上述特定的熒光標(biāo)記寡核苷酸，能夠更高靈敏度且簡便地第檢測ABCG2基因的多態(tài)性。 序列編號I所不的喊基序列為ABCG2基因的喊基序列的一部分，對應(yīng)于ABCG2基因的第I位 第68595位堿基中的第18597位 第19196位的601個堿基。在ABCG基因的野生型中，與序列編號I所示的堿基序列的第301位對應(yīng)的堿基為G (鳥嘌呤)，而在突變型中突變成A (腺嘌呤)。另外，在野生型的ABCG2基因中，ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)子的氨基酸序列中的第12位的氨基酸為纈氨酸(Val)，而在突變型的ABCG2基因中，為蛋氨酸(Met)(以下稱為“V12M突變”)。另外，在所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸中，“與第311位堿基對應(yīng)的堿基”是與序列編號I所示的堿基序列中的第311位堿基G(鳥嘌呤)互補(bǔ)的堿基C(胞嘧啶)。在所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸中，該被熒光標(biāo)記的互補(bǔ)的堿基C能夠存在于從5’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置。另外，能夠存在于5’末端。由此，例如多態(tài)性檢測靈敏度進(jìn)一步提高。另外，能夠生產(chǎn)性良好地獲得Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸。所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸是能夠檢測序列編號I所示的堿基序列的第301位堿基的多態(tài)性的探針。該堿基的野生型為G，突變型為A。所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長需為11 50。在堿基長為10以下或51以上的情況下，ABCG2基因多態(tài)性的檢測靈敏度降低。另外，從多態(tài)性檢測靈敏度的觀點(diǎn)來說，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長可以為11 40、11 28或14 18。另外，通過改變所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長，例如能夠?qū)⒂蒔l或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸與其互補(bǔ)鏈(靶標(biāo)序列)形成的雜交體的解離溫度、即Tm值調(diào)節(jié)到期望的值。本發(fā)明的所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸與除了第311位的堿基為鳥嘌呤之外和序列編號I所示的堿基序列互補(bǔ)的序列具有同源性。具體地，本發(fā)明的所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸相對于與序列編號I所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列具有80%以上的同一性。另外，從檢測靈敏度的觀點(diǎn)來說，也可以顯示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或99%以上的同一丨I"生。在將本發(fā)明的所述Pl熒光標(biāo)記寡核苷酸和下述與序列編號I互補(bǔ)的序列進(jìn)行比較時的同一性低于80%的情況下，對含有突變型的ABCG2基因的試樣核酸的檢測靈敏度變低，所述與序列編號I互補(bǔ)的序列是除了與第311位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外與序列編號I互補(bǔ)的序列。本發(fā)明的所述P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸與除了第311位堿基為鳥嘌呤之外具有和序列編號I相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。雜交可以根據(jù)公知的方法或者基于公知方法的方法，例如Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中記載的方法等來進(jìn)行。該文獻(xiàn)通過參考被并入本說明書中。嚴(yán)謹(jǐn)條件是指形成特異性雜交體但不形成非特異性雜交體的條件。典型的嚴(yán)謹(jǐn)條 件例如可以舉出在鉀濃度約25mM 約50mM以及鎂濃度約I. OmM 約5. OmM中進(jìn)行雜交的條件。作為本發(fā)明的條件的示例，可以舉出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KCl以及I. 5mM的MgCl2下進(jìn)行雜交的條件,但不限于此。此外，嚴(yán)謹(jǐn)條件被記載在Molecular Cloning3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。該文獻(xiàn)通過參考被并入本說明書中。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過改變雜交反應(yīng)、雜交反應(yīng)液的鹽濃度等來容易地選擇這樣的條件。以下，在表I中示出本發(fā)明的pi或Pr熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基序列的示例，但本發(fā)明不限于這些。在表I中，與序列編號I的第301位堿基對應(yīng)的堿基用大寫字母表示，并且一并示出與該序列編號I的第301位堿基對應(yīng)的堿基為C、T、A或G時的寡核苷酸與各熒光標(biāo)記寡核苷酸之間的雜交體的Tm值。這里Tm 值是使用 Meltcalc 99 free (http://www. meltcalc. com/)在設(shè)定條件Oligoconc [ u M] 0. 2、Na eq. [mM] 50 的條件下計算的。表I
權(quán)利要求
1.一種ABCG2基因的多態(tài)性檢測用探針，含有從包括下述PU PI’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸 (PD寡核苷酸，其為與含有在序列編號I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對于除了與第311位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外與序列編號I互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第311位喊基對應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記； (Pr )寡核苷酸，其為與含有在序列編號I所示的堿基序列中的第301位 第311位堿基的堿基長為11 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第311位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外具有與序列編號I相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第311位喊基對應(yīng)的喊基用突光染料標(biāo)記； (P2)寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對于除了與第251位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外與序列編號2互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第251位堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記； (P2’ )寡核苷酸，其為與含有序列編號2所示的堿基序列中的第234位 第251位堿基的堿基長為18 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第251位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外具有與序列編號2相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第251位堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記； (P3)寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列相對于除了與第152位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外與序列編號3互補(bǔ)的序列具有至少80%以上的同一性，并且與第152位堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記；以及 (P3’ )寡核苷酸，其為與含有序列編號3所示的堿基序列中的第152位 第161位堿基的堿基長為10 50的堿基序列互補(bǔ)的序列，該序列與除了與第152位堿基對應(yīng)的堿基為鳥嘌呤之外具有與序列編號3相同的堿基的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且與第152位堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多態(tài)性檢測用探針，其中， 所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第311位堿基位于從5’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置， 所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第251位堿基位于從5’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置， 所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第152位堿基位于從3’末端起數(shù)第I位 第3位的任何位置。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ABCG2基因的多態(tài)性檢測用探針，其中， 所述pi或pr熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第311位堿基位于5’末端， 所述P2或P2’突光標(biāo)記寡核苷酸的被突光染料標(biāo)記的第251位堿基位于5’末端， 所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的被熒光染料標(biāo)記的第152位堿基位于3’末端。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度減少或增加。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未與靶標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度減少。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pi或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為11 40，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為18 40，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為10 40。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pi或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為11 28，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為20 30，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為15 30。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl或P1’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為14 18，所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為22 26，所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸的堿基長為18 22。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述多態(tài)性檢測用探針為熔解曲線分析用的探針。
10.一種ABCG2基因的多態(tài)性檢測方法，其使用權(quán)利要求I至9中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針。
11.一種ABCG2基因的多態(tài)性檢測方法，其使用從包括權(quán)利要求I至9中任一項所述的所述PU PI’、P2、P2’、P3和P3’的組中選擇的至少兩種多態(tài)性檢測用探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的多態(tài)性檢測方法，包括 (I)使權(quán)利要求I至9中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交來獲得雜交體； (II)通過改變含有所述雜交體的試樣的溫度來使所述雜交體解離，并測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動； (III)基于所述熒光信號的變動來測定雜交體的解離溫度、即Tm值。
(IV)基于所述Tm值來檢測所述試樣中的單鏈核酸中的ABCG2基因中的多態(tài)性的存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多態(tài)性檢測方法，還包括所述在所述(I)的獲得雜交體之前或者與(I)的獲得雜交體的同時擴(kuò)增核酸。
14.一種藥劑的藥效判定方法，包括 通過權(quán)利要求10至13中任一項所述的多態(tài)性檢測方法來檢測ABCG2基因的多態(tài)性；以及 基于檢測到的多態(tài)性的有無來判定對藥劑的耐受性或者藥劑的藥效。
15.一種疾病預(yù)測方法，包括 通過權(quán)利要求10至13中任一項所述的多態(tài)性檢測方法來檢測ABCG2基因的多態(tài)性；以及 基于檢測到的多態(tài)性的有無來預(yù)測疾病的罹患風(fēng)險。
16.一種多態(tài)性檢測用試劑盒，包含權(quán)利要求I至9中任一項所述的多態(tài)性檢測用探針。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含下述引物對中的至少一者 能夠擴(kuò)增含有序列編號I所示的堿基序列中的、與所述pi或Pr熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對；能夠擴(kuò)增含有序列編號2所示的堿基序列中的、與所述P2或P2’熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對；以及 能夠擴(kuò)增含有序列編號3所示的堿基序列中的、與所述P3或P3’熒光標(biāo)記寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域的引物對。
全文摘要
本發(fā)明提供多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效評價方法、疾病預(yù)測方法以及多態(tài)性檢測用試劑盒。ABCG2基因的多態(tài)性檢測用探針通過包含下述的寡核苷酸等而構(gòu)成其為與含有序列編號1所示的堿基序列中的第301位～第311位堿基的堿基長為11～50的堿基序列互補(bǔ)且具有至少80％以上的同一性，并且與第311位堿基對應(yīng)的堿基用熒光染料標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK102766681SQ20121013201
公開日2012年11月7日 申請日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月2日
發(fā)明者井口亞希, 黑瀬熏 申請人:愛科來株式會社